王嵬，胡煒，苑紅，苑春慧

（1.遼寧省錦州市中心醫(yī)院，遼寧 錦州 121001；2.解放軍第302醫(yī)院，北京 100039）

RAGE和sRAGE在胃癌中的表達及其臨床意義*

王嵬1，胡煒1，苑紅2，苑春慧1

（1.遼寧省錦州市中心醫(yī)院，遼寧 錦州 121001；2.解放軍第302醫(yī)院，北京 100039）

目的通過檢測胃癌組織晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）和血清可溶性RAGE（sRAGE）表達水平，探討其在胃癌發(fā)生過程中的作用及其臨床意義。方法為研究胃癌組織RAGE表達水平，納入非糖尿病胃癌患者（Ⅰ～Ⅲ期）38例的病理組織蠟塊，10例癌周組織（癌組織邊緣≥5 cm）為對照，以免疫組織化學法染色評價胃癌組織RAGE表達水平。為檢測外周血sRAGE表達水平，采集38例胃癌患者（Ⅰ～Ⅲ期）術前24 h、術后7 d肘靜脈血2 ml，以30例健康捐獻者外周血為對照，分離血清，以酶聯(lián)免疫吸附法檢測sRAGE濃度。結(jié)果

RAGE在正常組織和胃癌組織均有表達，胃癌組織表達水平更高（P＜0.05），而與TNM分期和病理組織分型無關（P＞0.05）。胃癌患者手術前后血清sRAGE表達水平高于健康捐獻者（P＜0.05），術后血清sRAGE水平降低（P＜0.05），但Ⅱ、Ⅲ期患者術后sRAGE水平高于Ⅰ期患者（P＜0.05）。結(jié)論胃癌組織RAGE表達水平上調(diào)，可作為病理組織學輔助診斷指標；胃癌患者血清sRAGE水平上調(diào)作為術前輔助診斷指標，有一定臨床意義。

胃癌；晚期糖基化終末產(chǎn)物受體；可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體

晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（the receptor for advanced glycation end product，RAGE）作為一種多配體的跨膜信號轉(zhuǎn)導受體[1]，與神經(jīng)血管再生、炎癥反應、糖尿病并發(fā)癥等病理過程有關[2-3]，與胃癌等惡性腫瘤分期、病理組織分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠端轉(zhuǎn)移有關[4]。可溶性 RAGE（soluble RAGE，sRAGE）是RAGE的抑制性配體，是一種可靠的炎癥生物標志物[5]，在乳腺癌、胰腺癌的某些階段表達下調(diào)[6-7]。本研究擬檢測胃癌組織RAGE表達水平和手術前后血清sRAGE表達水平，探討RAGE、sRAGE用于胃癌診斷的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月-2013年12月在遼寧省錦州市中心醫(yī)院接受結(jié)胃癌根治術治療的胃癌Ⅰ～Ⅲ期患者62例，排除15例確診糖尿病和9例接受過術前化療或免疫治療的患者，其余38例患者納入本研究。臨床分期采用2010年第7版國際抗癌聯(lián)盟TNM分期標準[8]，組織病理學分級采用2010版世界衛(wèi)生組織消化系統(tǒng)腫瘤組織學分類標準[9]。本研究通過本院倫理委員會審核批準，患者簽署知情同意書。

為檢測胃癌細胞RAGE表達水平，38例患者術后胃癌組織送檢，作為RAGE胃癌組。胃癌根治術樣本，距癌組織邊緣≥5 cm，經(jīng)病理診斷為正常組織，共10例，作為RAGE對照組。組織樣本行蘇木精-伊紅染色和RAGE免疫組織化學染色。

檢測外周血sRAGE表達水平，38例胃癌組患者術前24h、術后7d行肘靜脈采集外周血樣本2 ml，送遼寧省錦州市中心醫(yī)院細胞生物學研究室備檢，作為sRAGE胃癌組；健康體檢患者肘靜脈采集外周血2 ml，排除糖尿病、腫瘤、外傷和感染患者共30例，作為sRAGE對照組。

1.2 方法

1.2.1 組織化學染色 組織化學實驗在本院病理科進行。鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶試劑盒購自上海藍基生物科技有限公司，羊抗人RAGE抗體購自美國Santa Cruz公司。病理切片常規(guī)脫蠟入水，0.3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，10%小牛血清封閉切片，滴加一抗（1∶200），4℃過夜。以磷酸鹽緩沖液洗后滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺法顯色，蘇木精復染胞核，脫水，透明，封片。用磷酸鹽緩沖液置換一抗作為陰性對照；以細胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒的細胞作為陽性細胞，每張切片在200倍高倍鏡下隨機觀察5個視野，計數(shù)100個細胞中陽性細胞比例，判定陽性細胞顯色強度，無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，兩者相乘計算免疫組織化學法評分（immunohistochemical score，IHS），5 個視野IHS評分取平均值，既得樣本的IHS。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA）檢測血清 sRAGE水平ELISA法檢測在本院細胞生物學研究室進行。外周血樣本在采集后4℃過夜，3 000 r/min離心10 min，分離血清，置入-80℃冰箱冷凍保存待測。sRAGE檢測嚴格按試劑和儀器使用說明書進行操作。主要包括：①檢測樣本準備。將450.0 ng/L標準品制備成450.0、300.0、200.0、100.0、50.0、25.0 和 12.5 ng/L 系列標準品檢測樣本，將待檢血清5倍稀釋。②設置空白孔l孔、各濃度標準品各2孔、待檢血清1孔進行ELISA檢測。③以標準品濃度（取2孔均值）為橫坐標、光密度（optical density，OD）值為縱坐標，應用Curve Expert 1.3繪制標準曲線，導出sRAGE濃度與OD值關系的方程式。根據(jù)待測樣品OD值在標準曲線上查出或由關系方程式計算出相應的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為待測樣本的實際sRAGE濃度（ng/L）。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，用獨立樣本t檢驗、配對t檢驗或方差分析，計數(shù)資料，以率表示，用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者的一般情況比較

RAGE胃癌組與RAGE對照組患者性別、年齡、臨床分期、病理學分級等一般情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見附表。

2.2 RAGE在胃癌組織中的表達

RAGE在癌旁組織和不同分化程度的胃癌組織中都有一定程度的表達（見附圖）。

RAGE對照組 IHS為（0.55±0.17）分，RAGE 胃癌組 IHS為（1.33±0.32）分，經(jīng)t檢驗，差異由統(tǒng)計學意義（t=7.234，P=0.000），胃癌組織RAGE表達上調(diào)。RAGE胃癌組中，臨床分期Ⅰ期樣本IHS為（1.19±0.30）分，Ⅱ期 IHS為（1.47±0.40）分，Ⅲ期 IHS為（1.32±0.25）分；3個臨床分期胃癌組織RAGE表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

38例胃癌組織樣本經(jīng)病理檢查，低分化IHS為（1.25±0.28）分；中分化 IHS為（1.40±0.36）分；高分化IHS為（1.31±0.32）分，3個病理分級胃癌組織RAGE表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

附表 胃癌患者的一般資料

附圖 胃癌組織RAGE的表達 （鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法×200）

2.3 sRAGE在胃癌患者血清中的表達水平

sRAGE對照組血清sRAGE濃度為（149.97±30.12）ng/L，sRAGE胃癌患者手術前后血清sRAGE濃度分別為（395.32±70.43）和（296.61±77.67）ng/L。胃癌患者手術前后血清sRAGE濃度分別與sRAGE對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=19.351和10.666，均P=0.000），表達水平上調(diào)；而術后血清sRAGE濃度與術前比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.804，P=0.000），術后sRAGE表達水平下調(diào)。其中，胃癌Ⅰ期患者術前血清 sRAGE 濃度為（413.01±71.05）ng/L，術后為（219.79±67.42）ng/L；Ⅱ期患者術前血清sRAGE濃度為（367.26±55.07）ng/L，術后為（318.16±53.22）ng/L；Ⅲ期患者術前血清 sRAGE濃度為（402.45±77.37）ng/L，術后為（334.60±61.28）ng/L。胃癌患者經(jīng)根治術后，Ⅰ期患者血清sRAGE濃度與Ⅱ、Ⅲ期患者比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.798和4.594，P=0.001和0.000），Ⅰ期患者血清 sRAGE 濃度表達水平較低。

38例胃癌患者中，病理組織學診斷低分化胃癌患者術前血清sRAGE濃度為（369.71±81.05）ng/L，術后為（281.48±67.42）ng/L；中分化患者術前為（380.06±43.88）ng/L，術后為（312.19±71.18）ng/L；高分化患者術前為（437.88±72.88）ng/L，術后為（334.60±81.74）ng/L。高分化患者術前血清sRAGE濃度與低分化、中分化患者比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.214和 2.555，P=0.046和 0.017），高分化患者表達水平較高。

3 討論

目前，腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中配體RAGE的作用還存在諸多爭議，但越來越多的證據(jù)表明，RAGE在腫瘤微環(huán)境形成過程中與促進炎癥環(huán)境形成有關[10]。有證據(jù)表明，胃癌組織中RAGE表達增高，低分化胃癌尤為顯著[11]，而且RAGE可以作為預測胃癌預后的獨立因素，對胃癌的治療有指導意義[12]。胃癌細胞通過自分泌HMGB1分子激活RAGE，促進胃癌細胞增殖[13]。但對RAGE的抑制性配體sRAGE在腫瘤領域的研究還很少。有研究表明，循環(huán)sRAGE水平降低，增加腫瘤發(fā)生的風險[14]，血清sRAGE水平降低與胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、預后有關[7，15]。本研究通過檢測胃癌根治術患者腫瘤組織RAGE表達水平和手術前后血清sRAGE濃度，揭示胃癌組織RAGE表達水平、血清sRAGE濃度與胃癌臨床分期和病理組織分型的關系，以及血清sRAGE濃度與胃癌根治術的關聯(lián)。

本研究發(fā)現(xiàn)，正常胃組織和胃癌組織中均有RAGE表達，但胃癌組織RAGE高表達，與胃癌臨床分期和胃癌組織分化程度無關，與BASTA等[11]的發(fā)現(xiàn)并不完全相符。既往研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中均出現(xiàn)血清sRAGE濃度降低[6，15]，而晚期乳腺癌患者血清sRAGE表達上調(diào)[6]。sRAGE的產(chǎn)生有2種機制，一是由RAGE mRNA選擇性剪接產(chǎn)生，二是由細胞膜上的RAGE經(jīng)膜表面的金屬蛋白酶作用裂解得到的一種異構(gòu)體[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者手術前后血清sRAGE表達水平遠高于正常健康捐獻者，而術后血清sRAGE濃度降低，說明血清sRAGE濃度變化受到胃癌根治術的影響，可能在胃癌細胞快速增殖的情況下，血清sRAGE的來源主要來自于膜RAGE胞外部分脫落。而臨床分期Ⅰ期的患者，經(jīng)胃癌根治術后，無影像學淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠端轉(zhuǎn)移，血清sRAGE低于Ⅱ、Ⅲ期患者也證明該點。因此胃癌組織RAGE表達水平上調(diào)，可作為病理組織學輔助診斷指標；胃癌患者血清sRAGE水平上調(diào)，作為術前輔助診斷指標有一定臨床意義。

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（童穎丹 編輯）

Clinical significance of RAGE and sRAGE expressions in gastric cancer*

Wei Wang1,Wei Hu1,Hong Yuan2,Chun-hui Yuan1
(1.Jinzhou Central Hospital,Jinzhou,Liaoning 121001,China;2.The 302nd Hospital of PLA,Beijing 100039,China)

ObjectiveTo reveal the clinical significance of the expressions of receptor of advanced glycation end product(RAGE)and soluble RAGE(sRAGE)in gastric cancer and their correlations with tumor differentiation.MethodsTo study the expression of RAGE in gastric carcinoma tissues,the paraffin-embedded cancerous tissues of 38 patients with stageⅠ-Ⅲ gastric cancer without diabetes mellitus were enrolled in this study and 10 samples of adjacent tissues(distance from the edge of the cancer tissues≥5 cm)as control group.RAGE was analyzed by immunohistochemical staining.To detect the concentration of serum sRAGE,peripheral blood of the 38 gastric cancer patients was collected about 24 hours before operation and on the 7th day after surgery,and the peripheral blood of 30 healthy donors was collected as control group.The concentration of serum sRAGE was analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsRAGE was expressed in the adjacent tissues and the gastric tumor tissues,but higher in the gastric tumor tissues (P＜0.05).RAGE was not correlated with TNM stage or pathological type of the cancer(P＞0.05).The expression levels of preoperative and postoperative serum sRAGE from the 38 patients with gastric cancer were higher than that from the healthy donors (P＜0.05).The sRAGE expression level decreased after radical gastrectomy(P＜0.05).After the surgery,compared with the patients with stageⅡorⅢgastric cancer,the patients with stageⅠ gastric cancer had a lower expression level of serum sRAGE (P＜0.05).ConclusionsRAGE expression is up-regulated in gastric tumor tissues,and is helpful to histopathological diagnosis.Serum sRAGE concentration increases in the patients with stage I-Ⅲ gastric cancer,which expresses a certain clinicalsignificance in preoperative tumor screening.

gastric cancer;RAGE;sRAGE

R735.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.010

1005-8982（2017）17-0050-04

2016-09-14

遼寧省錦州市科學技術計劃（No：12A1B36）