王杰，陳大興，郭寧，陶立軒

（湖北省武漢市普仁醫(yī)院 心胸外科，湖北 武漢 430081）

CCNB2過表達對非小細胞肺癌不良預(yù)后的預(yù)測效果研究*

王杰，陳大興，郭寧，陶立軒

（湖北省武漢市普仁醫(yī)院 心胸外科，湖北 武漢 430081）

目的探討細胞周期蛋白B2（CCNB2）在非小細胞肺癌（NSCLC）組織中的表達及對預(yù)后的影響。方法

實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組織化學(xué)法測定CCNB2 mRNA和蛋白在NSCLC腫瘤組織及臨近非腫瘤組織中的表達水平，分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果腫瘤組織中CCNB2 mRNA和蛋白表達量高于非腫瘤組織（P＜0.05），且其表達水平與腫瘤分化等級、直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)（P＜0.05），同時CCNB2高表達是患者生存率預(yù)后不良的危險因素。結(jié)論腫瘤組織中CCNB2高表達與NSCLC不良預(yù)后密切相關(guān)。

非小細胞肺癌；細胞周期蛋白B2；生物標(biāo)志物；預(yù)后

肺癌是病死率極高的一種惡性腫瘤[1-2]，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占全部肺癌的80%～85%，發(fā)病率高[3]。臨床上大多數(shù)NSCLC患者確診時已為晚期，5年生存率僅為16%[4-5]，因此成為臨床面臨的一個難題，也為相關(guān)預(yù)后研究提出挑戰(zhàn)。細胞周期蛋白B2（cyclin B2，CCNB2）在不同部位和細胞周期中發(fā)揮作用[6-8]。近年來有研究提示，其在多種人類腫瘤組織和外周血中表達增高[9-13]，且與腫瘤臨床分期和轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)[14]。本研究就CCNB2在NSCLC組織中的表達及其與預(yù)后的關(guān)系進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年1月-2011年12月湖北省武漢市普仁醫(yī)院腫瘤科收治的NSCLC患者186例，均為臨床原發(fā)灶，入組前未接受任何治療。收集同期體檢健康對照組31例。將收集的NSCLC樣本和鄰近非腫瘤組織樣本共217例石蠟包埋，液氮保存。診斷和分期標(biāo)準(zhǔn)參照美國癌癥聯(lián)合委員會制定的第7版腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[15]；術(shù)后隨訪5～60個月。本研究通過本院倫理委員會審批。

1.2 核糖核酸提取與實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

提取組織樣本總RNA，使用Trizol（大連寶生生物工程公司有限公司），通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連寶生生物工程公司有限公司）進行逆轉(zhuǎn)錄，每個樣本重復(fù)3個/孔，以β-actin基因作為內(nèi)參，取5μl血清與5 μl準(zhǔn)備液（2.5%Tween 20、50 mmol/L 三羥甲氨基甲烷和1mmol乙二胺四乙酸二鈉混合，加入10μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含2 μl 10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、0.8 μl 25×脫氧核糖核苷三磷酸混合液（100 nmol/L）、2μl 10×隨機引物、1 μl Multi ScribeTMReverse Transcriptase 試劑、1 μl RNA 抑制劑和3.2μl焦碳酸二乙酯水。反應(yīng)條件：25℃預(yù)變性，10 min，37℃變性 120 min，85℃退火 5 min。反應(yīng)液140 000 r/min離心5 min，取上清液，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物序列見表 1。CCNB2基因相對表達量采用2-ΔΔCt方法進行計算。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 免疫組織化學(xué)染色

組織樣本石蠟包埋后切片，分別用二甲苯和無水乙醇脫石蠟和水，在檸檬酸鈉溶液煮沸10 min介導(dǎo)抗原復(fù)性。3%過氧化氫和1%牛血清白蛋白封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性和非特異性位點，采用1∶200稀釋的CCNB2一抗（英國Abcam公司）孵育，4℃過夜。磷酸鹽緩沖溶液洗滌后加入生物素標(biāo)記的二抗及親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）復(fù)合物，每步均室溫孵育 20 min，加入發(fā)光液后顯色。染色結(jié)果由2位病理學(xué)家參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)觀察判斷[9]，總分0～7分，0～5分判為低表達，6和7分為高表達。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，用χ2檢驗，Kaplan-Meier法制作生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，影響因素的分析用Cox比例風(fēng)險模型，P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織樣本中CCNB2的表達

20對NSCLC及鄰近非腫瘤組織CCNB2 mRNA表達水平比較，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=45.961，P=0.001），NSCLC 樣本中 CCNB2 mRNA 表達量為鄰近非腫瘤組織的3.02倍（見圖1）。186例石蠟包埋NSCLC樣本中62.4%（116/186）為CCNB2高表達，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=12.089，P=0.001），CCNB2高表達率在NSCLC樣本中高于正常組（見圖 2）。

2.2 不同特征CCNB2高表達率的比較

不同特征CCNB2高表達率的比較，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=19.541，P=0.000），CCNB2高表達與腫瘤分化等級增加有關(guān)，CCNB2高表達率越低，腫瘤分化等級越高。CCNB2高表達與腫瘤大小的增加、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,以及遠處轉(zhuǎn)移和臨床分期密切相關(guān)（P＜0.05），提示腫瘤越大、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越嚴(yán)重,以及出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移和臨床癥狀越嚴(yán)重，則腫瘤分化等級越高。CCNB2高表達與患者性別、年齡、吸煙史及病理學(xué)分化類型無關(guān)。見表2。

圖1 20對NSCLC和鄰近非腫瘤組織CCNB2 mRNA表達的比較

2.3 CCNB2高表達與NSCLC患者疾病預(yù)后關(guān)系

CCNB2低表達NSCLC患者疾病預(yù)后較好，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=33.251，P=0.000），CCNB2表達與NSCLC患者疾病總生存率相關(guān)（見圖3）。CCNB2是NSCLC患者疾病預(yù)后不良的獨立危險因素；但其與患者腫瘤臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移無關(guān)。Cox回歸分析提示，CCNB2蛋白高表達是NSCLC患者疾病預(yù)后不良的危險因素（HR=2.272，P=0.001）。見表3和圖3。

圖2 NSCLC組織CCNB2蛋白表達 （免疫組織化學(xué)法）

表2 不同特征CCNB2高表達率的比較

表3 NSCLC患者總生存率的單一和多重變量分析

圖3 CCNB2不同表達患者生存率曲線

3 討論

細胞周期蛋白B2是B類細胞周期蛋白家族的成員，在分裂間期CCNB1會持續(xù)在細胞核和細胞質(zhì)間穿梭，在分裂間期末CCNB1快速進入細胞核并與有絲分裂體結(jié)合[16-17]。與之相反，在分裂間期和有絲分裂期CCNB2會穿出細胞核，逐漸靠近高爾基體[18]。盡管兩者在細胞內(nèi)定位不同，但是CCNB1和CCNB2共同完成促發(fā)細胞進入G2/M期中的重要功能[19]。此外，CCNB1和CCNB2在氨基末端結(jié)構(gòu)上有一定差異，其同源性為57%[20]。目前已經(jīng)比較明確CCNB1在NSCLC中的作用，但關(guān)于CCNB2還在摸索中，YOSHIDA等[21]研究表明，CCNB2與腫瘤細胞分化、血管侵入、Ki-67增長指數(shù)及增殖細胞核抗原標(biāo)記指數(shù)密切相關(guān)。研究提示，CCNB1過表達是NSCLC患者不良預(yù)后的獨立危險因素[22-23]。然而CCNB2在NSCLC中的表達情況及作用研究尚不多。

基因芯片研究提示，胃癌患者的胃黏膜組織中CCNB2存在過表達狀態(tài)[13]。此外，CCNB2是HPV16陽性宮頸癌患者表達上調(diào)的6種基因之一[24]。本研究結(jié)果提示，與非腫瘤肺臟組織相比，NSCLC樣本中CCNB2 mRNA和蛋白高表達。進一步研究CCNB2在NSCLC組織中表達的臨床意義，本研究發(fā)現(xiàn)CCNB2表達與NSCLC患者腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移及臨床分期呈正相關(guān)。本研究結(jié)果證實，CCNB2過表達可以通過促進腫瘤細胞生長和加速腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致NSCLC腫瘤發(fā)展。與TAKASHIMA等[25]報道的結(jié)果近似。

國內(nèi)外不少研究均提示，在多種人類腫瘤組織中檢測到CCNB2過表達，且與疾病預(yù)后不良密切相關(guān)。SHUBBAR等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CCNB2過表達與乳腺癌患者DSS預(yù)后有關(guān)，是其獨立預(yù)后標(biāo)志物。此外，TAKASHIMA等[25]也報道，肺腺癌患者腫瘤組織中CCNB2 mRNA過表達，且其表達與疾病總生存率密切相關(guān)。為進一步探討CCNB2表達在NSCLC中的預(yù)后價值，本研究探討CCNB2表達與患者總生存率的關(guān)系，結(jié)果證實兩者呈負相關(guān)，多重變量分析提示，CCNB2過表達是NSCLC患者疾病預(yù)后不良的獨立標(biāo)志物?？傊琋SCLC組織中CCNB2蛋白表達升高，且與腫瘤的臨床分期和預(yù)后不良密切相關(guān)。

[1]KANEMATSU T,HANIBUCHI M,TOMIMOTO H,et al.Epidemiological and clinical features of lung cancer patients from 1999 to 2009 in Tokushima Prefecture of Japan[J].Journal of Medical Investigation Jmi,2010,57(3/4):326-333.

[2]AKGüN K M,CROTHERS K,PISANI M.Epidemiology and management of common pulmonary diseases in older persons[J].Journals of Gerontology,2012,67(3):276-291.

[3]KAMANGAR F,DORES G M,ANDERSON W F.Patterns of cancer incidence,mortality,and prevalence across five continents:defining priorities to reduce cancer disparities in different geographic regions of the world[J].Journal of the American Society of Clinical Oncology,2006,24(14):2137-2150.

[4]SORIA J C,MASSARD C,LE C T.Should progression-free survival be the primary measure of efficacy for advanced NSCLC therapy[J].Annals of Oncology,2010,21(12):2324-2332.

[5]CHU Z,YANG Z,SHAO H,et al.Small peripheral lung adenocarcinoma:CT and histopathologic characteristics and prognostic implications[J].Cancer Imaging,2011,11(1):237-246.

[6]VERMEULEN K,van BOCKSTAELE D R,BERNEMAN Z N.The cell cycle:a review of regulation,deregulation and therapeutic targets in cancer[J].Cell Proliferation,2003,36(3):131-149.

[7]PETRI E T,ERRICO A,ESCOBEDO L,et al.The crystal structure of human cyclin B[J].Cell Cycle,2007,6(11):1342-1349.

[8]WU T,ZHANG X,HUANG X,et al.Regulation of cyclin B2 expression and cell cycle G2/M transition by menin[J].Journal of Biological Chemistry,2010,285(24):18291-18300.

[9]FERNANDEZ-RANVIER G G,WENG J,YEH R F,et al.Identification of biomarkers of adrenocortical carcinoma using genomewide gene expression profiling[J].ArchivesofSurgery,2008,143(9):841-846.

[10]SHUBBAR E,KOVáCS A,HAJIZADEH S,et al.Elevated cyclin B2 expression in invasive breast carcinoma is associated with unfavorable clinical outcome[J].BMC Cancer,2013,13(1):1-10.

[11]PARK S H,YU G R,KIM W H,et al.NF-Y-dependent cyclin B2 expression in colorectal adenocarcinoma[J].Clinical CancerResearch an Official Journal of the American Association for Cancer Research,2007,13(3):858-867.

[12]DE-MARTINO I,VISONE R,WIERINCKX A,et al.HMGA proteins up-regulate CCNB2 gene in mouse and human pituitary adenomas[J].Cancer Research,2009,69(5):1844-1850.

[13]WANG D G,CHEN G,WEN X Y,et al.Identification of biomarkers for diagnosis of gastric cancer by bioinformatics[J].Asian Pacific Journal of Cancer Prevention Apjcp,2015,16(4):1361-1365.

[14]MO M L,CHEN Z,LI J,et al.Use of serum circulating CCNB2 in cancersurveillance[J].InternationalJournalofBiological Markers,2010,25(4):236-242.

[15]方子文.電視胸腔鏡下解剖性肺段切除聯(lián)合系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃在ⅠB期老年高危非小細胞肺癌患者切除術(shù)后生存及預(yù)后因素的研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué),2016.

[16]HAGTING A,JACKMAN M,SIMPSON K,et al.Translocation of cyclin B1 to the nucleus at prophase requires a phosphorylation-dependent nuclear import signal[J].Current Biology,1999,9(13):680-689.

[17]CLUTE P,PINES J.Temporal and spatial control of cyclin B1 destruction in metaphase[J].Nature Cell Biology,1999,1(2):82-87.

[18]JACKMAN M,FIRTH M,PINES J.Human cyclins B1 and B2 are localized to strikingly different structures:B1 to microtubules,B2 primarily to the Golgi apparatus[J].Embo Journal,1995,14(8):1646-1654.

[19]LIU J H,WEI S,BURNETTE P K,et al.Functional association of TGF-beta receptorⅡwith cyclin B[J].Oncogene,1999,18(1):269-275.

[20]BRANDEIS M,HUNT T.The proteolysis of mitotic cyclins in mammalian cells persists from the end of mitosis until the onset of S phase[J].Embo Journal,1996,15(19):5280-5289.

[21]YOSHIDA T,TANAKA S,MOGI A,et al.The clinical significance of cyclin B1 and wee 1 expression in non-small-cell lung cancer[J].Annals of Oncology,2004,15(2):252-256.

[22]SORIA J C,JANG S J,KHURI F R,et al.Overexpression of cyclin B1 in early-stage non-small cell lung cancer and its clinical implication[J].Cancer Research,2000,60(15):4000-4004.

[23]COOPER W A,KOHONENCORISH M R,MCCAUGHAN B,et al.Expression and prognostic significance of cyclin B1 and cyclin A in non-small cell lung cancer[J].Histopathology,2009,55(1):28-36.

[24]ESPINOSA A M,ALFARO A,ROMAN-BASAURE E,et al.Mitosis is a source of potential markers for screening and survival and therapeutic targets in cervical cancer[J].PLoS One,2013,8(2):142.

[25]TAKASHIMA S,SAITO H,TAKAHASHI N,et al.Strong expression of cyclin B2 mRNA correlates with a poor prognosis in patients with non-small cell lung cancer[J].Tumor Biology,2014,35(5):4257-4265.

（童穎丹 編輯）

Cyclin B2 overexpression is a poor prognostic biomarker in NSCLC patients*

Jie Wang,Da-xing Chen,Ning Guo,Li-xuan Tao
(Department of Cardiothoracic Surgery,Wuhan Puren Hospital,Wuhan,Hubei 430081,China)

ObjectiveTo identify the role of cyclin B2 (CCNB2)in patients with NSCLC.MethodsCCNB2 mRNA and protein expressions were detected in NSCLC and paracancerous tissues.Immunohistochemistry was used to detect the expression of CCNB2 protein in 186 NSCLC patients.The relationships between the expression of CCNB2 and clinicopathological features were analyzed.ResultsIn this study,the expressions of CCNB2 mRNA and protein in the tumor tissues were higher than those in the nontumor tissues(P＜0.05).The expression levels of CCNB2 mRNA and protein were positively correlated with tumor differentiation grade,tumor diameter,lymph node metastasis,distant metastasis and clinical stage (P＜0.05),while CCNB2 overexpression was a risk factor for low survival rate and poor prognosis of the patients.ConclusionsThe overexpression of CCNB2 in NSCLC is closely related to disease progression and poor prognosis,and CCNB2 could be severed as a marker of prognosis in patients with NSCLC.

CCNB2;NSCLC;biomarker;prognosis

R734.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.009

1005-8982（2017）17-0045-05

2016-05-06

湖北省武漢市科技基金（No：WX12D26）