張曉，薛煥洲，王亞東，余淼，黃今朝

（鄭州大學人民醫(yī)院 肝膽外科，河南 鄭州 450003）

布加綜合征患者腔房轉流術后血清MAPK相關蛋白的表達及意義*

張曉，薛煥洲，王亞東，余淼，黃今朝

（鄭州大學人民醫(yī)院 肝膽外科，河南 鄭州 450003）

目的觀察布加綜合征（BCS）患者腔房轉流術后血清絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）相關蛋白的表達。方法選取腔房轉流術后BCS患者（觀察組）和健康志愿者（對照組），各40例。采用Western blot檢測術前和術后3 d及1個月血清MAPK相關蛋白表達。結果①觀察組術前和術后各時間點血清胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）、p38、c-Jun氨基末端激酶及胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（ERK5）的表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），且觀察組術前表達水平與術后3 d及術后1個月比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；②觀察組術前和術后各時間P-ERK1/2、P-p38及磷酸化c-Jun氨基末端激酶（P-JNK）表達水平均高于對照組，P-ERK5低于對照組；③觀察組術后3 d的P-ERK1/2、P-p38及P-JNK表達水平較術前上升，而P-ERK5較術前下降。結論腔房轉流術可上調(diào)BCS患者血清P-ERK1/2、P-p38及P-JNK的表達水平，下調(diào)血清P-ERK5的表達水平，而對各總蛋白的表達無調(diào)控作用。

腔房轉流術；布加綜合征；MAPK；臨床研究

近年來，布加綜合征（budd chiari syndrome，BCS）在河南、山東發(fā)病率較高，如不能及時接受手術治療，最終可發(fā)展為肝硬化和門脈高壓而死于消化道出血和肝功能衰竭[1-3]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是重要的信號通路調(diào)節(jié)中樞之一，其信號通路主要由胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK 1/2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun n-terminal kinase，JNK）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK） 和胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（extracellular signal-regulated kinase 5，ERK5）通路4大亞族組成，激活后形成不同的轉導通路，介導不同的生物學效應。MAPK信號通路的重要成員可能與BCS的發(fā)病、發(fā)展過程具有高度的關聯(lián)性[4]。目前，國內(nèi)關于BCS的相關機制的研究鮮見，本研究通過觀察MAPK信號通路主要蛋白在BCS患者腔房轉流術后血清中的表達，探討B(tài)CS的可能機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年11月-2013年11月于本院住院接受腔房轉流術治療的BCS患者40例作為觀察組，符合BCS的診斷標準，疾病分型Ⅱ型[5]。其中，男性23例，女性17例；年齡30～50歲，平均（38.81±6.72）歲。另選取同期本院體檢中心體檢健康者40例作為對照組。其中，男性20例，女性20例；年齡30～52歲，平均（38.65±6.50）歲。排除標準：由于其他原因?qū)е碌母?、心及肺功能不全者?994年版美國紐約心臟病學會心功能分級Ⅳ級，或補充分級D階段者；肝功能Child-Pugh分級為重度損傷者；合并嚴重原發(fā)性疾病，如肝、腎、內(nèi)分泌及造血系統(tǒng)等疾病并發(fā)；過敏體質(zhì)、哺乳期或妊娠期婦女等對多種藥物過敏者；3個月內(nèi)參加其他臨床試驗的患者；精神異常且不配合治療者；試驗過程中，受試者病情出現(xiàn)加重或惡化趨勢者；試驗過程中受試者主動或被動接受試驗規(guī)定以外治療方法者。本研究經(jīng)過本院倫理委員會審核，患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 主要抗體及儀器 ERK1/2抗體、磷酸化胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（Phosphorylation extracellular sig nal-regulated kinase 1/2，P-ERK1/2）抗體、JNK 抗體、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（Phosphorylation JNK，P-JNK）抗體、p38抗體、磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（Phosphorylation p38，P-p38）抗體、ERK5 抗體及磷酸化胞外信號調(diào)節(jié)激酶5（Phosphorylation ERK5，P-ERK5）抗體均購自美國Santa cruz公司。LE-80K型超速離心機購自美國Beckman公司。DYCZ-24F型電泳儀購自北京六一儀器廠。GE Nova Blot型轉印儀購自美國GE公司。

1.2.2 Western blot檢測血清MAPK相關蛋白表達所有患者抽取晨起肘靜脈血，2 500～3 000 r/min離心15～30 min，去血漿得固形物，蒸餾水溶解，采用醋酸和氯化鈉的混合物（2∶1～4∶1）進行酸化，90～110℃下加熱5～15 min。冷卻，添乙醚，得蛋白絮狀物。采用聚氰基丙烯酸正丁酯法測蛋白濃度，根據(jù)定量結果稀釋各組樣本蛋白總濃度為一致；將各組樣本蛋白與4×十二烷基硫酸鈉蛋白上樣緩沖液按3∶1體積比例混合，煮沸5 min。根據(jù)目的蛋白大小，配置4.5%積層凝膠，10%的分離凝膠。進行積層凝膠電泳，前15 min 16 mA/gel電泳，后32 mA/gel電泳至底部。電泳后進行電轉，采用恒流轉膜2 h，電流根據(jù)聚偏二氟乙烯膜膜面積大小設置，計算方法為電流=膜面積（cm2）×數(shù)量×0.8mA。轉膜成功后，放入封閉液，置于搖床上37℃恒溫搖動封閉1 h。從封閉液中取出后，洗滌 3次，加一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，洗滌3次后加二抗，搖床上37℃恒溫搖動孵育1h后，洗去二抗。采用Image Tool 3.0軟件分析各條帶光密度值，內(nèi)參用β-肌動蛋白表示，蛋白的相對表達量用目的蛋白條帶（光密度值）/β-肌動蛋白（光密度值）來反映。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清ERK1/2和P-ERK1/2表達的比較

觀察組術前ERK1/2表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.762，P=0.441），觀察組術前P-ERK1/2表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-21.700，P=0.000）；觀察組術后 3d的ERK1/2表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.476，P=0.140），觀察組術后3 d的P-ERK1/2表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=26.900，P=0.000）；觀察組術后1個月的ERK1/2表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.381，P=0.166），觀察組術后1個月P-ERK1/2表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=20.633，P=0.000），觀察組均高于對照組。觀察組術后3 d的ERK1/2表達水平與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.714，P=0.470），觀察組術后3 d的ERK1/2水平與術前比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=5.200，P=0.000）；觀察組術后1個月的ERK1/2表達水平與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.619，P=0.531），觀察組術后1個月的ERK1/2水平與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.067，P=0.289）。見表1和圖1。

2.2 兩組血清p38和P-p38表達水平的比較

觀察組術前血清p38表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=2.333，P=0.076），觀察組術前血清P-p38表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=8.897，P=0.000）；觀察組術后 3 d血清 p38表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=1.767，P=0.055），觀察組術后3 d血清P-p38表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=19.923，P=0.000）；觀察組術后1個月血清p38表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.667，P=0.553），觀察組術后1個月血清P-p38表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.220，P=0.000）；觀察組術后3 d血清p38表達水平與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.333，P=0.630），觀察組術后 3d血清P-p38表達水平與術前比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=11.025，P=0.000）；觀察組術后1個月血清p38表達水平與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.667，P=0.070），觀察組術后1個月血清P-p38表達水平與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.322，P=0.749）。見表2和圖2。

2.3 兩組血清JNK和P-JNK表達水平的比較

觀察組術前血清JNK表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=2.500，P=0.062），觀察組術前血清P-JNK表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=9.493，P=0.000）；觀察組術后 3 d 血清 JNK表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.500，P=0.571），觀察組術后3 d血清P-JNK表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=24.375，P=0.000）；觀察組術后1個月血清JNK表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=2.000，P=0.095），觀察組術后1個月血清P-JNK表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=7.761，P=0.000）；觀察組術后3 d血清JNK表達水平與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.630，P=0.112），觀察組術后3 d血清P-JNK表達水平與術前比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=14.881，P=0.000）；觀察組術后1個月血清JNK表達水平與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-0.485，P=0.260），觀察組術后1個月血清P-JNK表達水平與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-1.732，P=0.092）。見表3和圖3。

表1 兩組血清ERK1/2和P-ERK1/2表達的比較（n=40）

圖1 兩組血清ERK1/2和P-ERK1/2表達的比較

表2 兩組血清p38和P-p38表達水平的比較 （±s）

表2 兩組血清p38和P-p38表達水平的比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與術前比較，P＜0.05

組別 p38 P-p38對照組 0.079±0.007 0.367±0.033觀察組術前 0.085±0.005 0.505±0.0351）術后 3 d 0.084±0.007 0.676±0.0281）2）術后 1 個月 0.080±0.051 0.510±0.0411）F值 2.670 132.884P值 0.062 0.000

圖2 兩組血清p38和P-p38表達水平的比較

表3 兩組血清JNK和P-JNK表達水平的比較 （±s）

表3 兩組血清JNK和P-JNK表達水平的比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與術前比較，P＜0.05

組別 JNK P-JNK對照組 0.061±0.003 0.483±0.028觀察組術前 0.066±0.005 0.631±0.0381）術后 3 d 0.062±0.006 0.863±0.0361）2）術后 1 個月 0.064±0.006 0.604±0.0361）F值 2.053 207.483P值 0.124 0.000

2.4 兩組血清ERK5和P-ERK5表達水平的比較

觀察組術前血清ERK5表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.220，P=0.827），觀察組術前血清P-ERK5表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-5.774，P=0.000）；觀察組術后 3 d血清ERK5表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.220，P=0.827），觀察組術后3d血清P-ERK5表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-9.193，P=0.000）；觀察組術后1個月血清ERK5表達水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-2.070，P=0.116），觀察組術后1個月血清P-ERK5表達水平與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-5.315，P=0.000）；觀察組術后3 d血清P-ERK5表達水平與術前比較，差異有統(tǒng)計學意義（t=-3.419，P=0.002）；觀察組術后1個月血清ERK5表達水平與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=-2.290，P=0.139），觀察組術后1個月血清P-ERK5表達水平與術前比較，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.460，P=0.649）。見表4和圖4。

表4 兩組血清ERK5和P-ERK表達水平的比較 （±s）

表4 兩組血清ERK5和P-ERK表達水平的比較 （±s）

注：1）與對照組比較，P＜0.05；2）與術前比較，P＜0.05

組別 ERK5 P-ERK5對照組 0.059±0.006 0.785±0.028觀察組術前 0.060±0.005 0.584±0.0721）術后 3 d 0.060±0.005 0.465±0.1141）2）術后 1 個月 0.054±0.004 0.600±0.0721）F值 2.670 28.835P值 0.062 0.000

圖4 兩組血清ERK5和P-ERK5表達水平的比較

3 討論

MAPK可調(diào)控細胞內(nèi)多種信號通路，其主要是通過蛋白修飾調(diào)控下游元件來參與細胞增殖、分化及凋亡等環(huán)節(jié)。腔房轉流術是目前治療BCS常用的外科手術方法之一，是一種通過促進側支循環(huán)建立的間接減壓手術。腔房轉流術可能對MAPK信號通路產(chǎn)生影響[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組術前和術后各時間血清ERK1/2、p38、JNK及ERK5的表達水平與對照組比較無差異，且觀察組術前表達水平與術后3 d與術后1個月比較無差異，提示MAPK的4大亞族的總蛋白在BCS患者血清中的表達在術前、術后未見變化，即上述4大亞族的功能并非由其總蛋白的表達變化來實現(xiàn)的。

進一步觀察發(fā)現(xiàn)，觀察組術前和術后各時間P-ERK1/2、P-p38及P-JNK表達水平均高于對照組，P-ERK5表達水平低于對照組，且觀察組術后3 d PERK1/2、P-p38及P-JNK表達水平較術前上升，而PERK5較術前下降，說明4大亞族的功能主要通過其蛋白磷酸化來體現(xiàn)。其中，ERK1/2、p38及JNK蛋白磷酸化的表達程度隨著病情的進展而升高，隨著病情的緩解而降低，ERK5蛋白磷酸化的表達則恰好呈現(xiàn)相反的趨勢，其表達程度隨著病情的進展而降低，隨著病情的緩解而升高。由此可見，MAPK信號通路蛋白磷酸化的表達與BCS密切相關。MPKA信號通路相關蛋白的表達與肝、心及肺功能的改變具有相關性[7-10]。運用腔房轉流術治療BCS，雖然術后早期因手術麻醉、創(chuàng)傷和機體應激反應等因素導致短期內(nèi)肝功能惡化、短時間內(nèi)回心血量增大引起不同程度的心功能不全，急性肺損傷導致肺功能的惡化，但是由于術后肝靜脈狹窄解除，配合術前保肝，術后利尿等積極治療和機體的自身調(diào)整，患者的心、肺及肝可以慢慢適應術后的負荷，在術后1個月逐漸恢復至正常水平，MPKA信號通路相關蛋白的水平也隨之降低。

綜上所述，腔房轉流術治療后可以上調(diào)BCS患者血清P-ERK1/2、P-p38及P-JNK的表達水平，下調(diào)血清P-ERK5的表達水平，而對各總蛋白的表達無調(diào)控作用，該結果可能為腔房轉流術治療BCS的作用機制提供新的思路。但是本研究仍有一定的局限性：由于觀察周期短、病例收集樣本數(shù)較少等問題，缺少對p38、ERK1/2、JNK、ERK5等信號通路中特異性抑制劑及其下游調(diào)控元件的系統(tǒng)分析，后期仍需對機制做進一步探討。

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（李科 編輯）

Expressions of serum MAPK-related proteins in patients with Budd-Chiari syndrome after artificial vascular bypass operation and their clinical significance*

Xiao Zhang,Huan-zhou Xue,Ya-dong Wang,Miao Yu,Jin-zhao Huang
(Department of Hepatobiliary Surgery,People's Hospital of Zhengzhou University,Zhengzhou,Henan 450003,China)

ObjectiveTo observe the expressions of related proteins of serum mitogen activated protein kinase (MAPK)in patients with Budd-Chiari syndrome (BCS)after artificial vascular bypass operation and discuss their clinical significance.MethodsIn this study,40 BCS patients(observation group)and 40 healthy volunteers(control group)were collected.The raleted proteins of serum MAPK were tested by Western blot before operation,3 days and 1 month after operation,and compared between the two groups.ResultsThe expression levels of serum extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2),P38,JNK and ERK5 in the observation group before operation,3 days and 1 month after operation were not significantly different from those in the control group(P＞0.05).In the observation group the expression levels of ERK1/2,P38,JNK and ERK5 before operation were not significantly different from those 3 days or1 month afteroperation.Compared to the control group,the expression levels of serum P-ERK1/2,P-P38 and P-JNK were higher,while P-ERK5 was lower in the observation group at each time point(P＜0.05).In the observation group,the expression levels of serum P-ERK1/2,P-P38 and P-JNK rised,but the P-ERK5 level reduced 3 days after operation compared to the preoperative levels.ConclusionsArtificial vascular bypass operation can increase the expression levels of serum P-ERK1/2,P-P38 and P-JNK,but reduce serum P-ERK5 expression.However,it has no obvious regulatory effect on the total protein expressions.

artificial vascular bypass operation;Budd-Chiari syndrome;mitogen activated protein kinase;clinical research

R696.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.008

1005-8982（2017）17-0040-05

2016-11-17

河南省醫(yī)學科技攻關計劃重點攻關項目（No：200902006）

薛煥洲，E-mail：hnsyzhangxiao@163.com