陳勇軍，劉稀金，廖衛(wèi)平，郭靜，李欣，易毅利

（1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽 421002；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所，廣東 廣州 510120；3.廣東省佛山市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 佛山 528000）

SCN1A基因突變陰性熱性驚厥患者SCN3A基因突變的特點(diǎn)*

陳勇軍1，劉稀金1，廖衛(wèi)平2，郭靜3，李欣1，易毅利1

（1.南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽 421002；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)科學(xué)研究所，廣東 廣州 510120；3.廣東省佛山市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，廣東 佛山 528000）

目的對SCN1A基因突變陰性的熱性驚厥（FS）患者進(jìn)行SCN3A基因突變篩查，并分析其突變特點(diǎn)。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增和Sanger測序方法對38例入組患者篩查SCN3A基因突變，采用生物軟件分析突變特點(diǎn)。結(jié)果2例錯義突變（c.956T＞C/p.I319T，c.5179G＞A/p.D1727N）；同源性比對分析提示2例突變均高度保守，在千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫和100例正常人中未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的位點(diǎn)改變。結(jié)論在SCN1A基因突變陰性的FS患者中，發(fā)現(xiàn)2例SCN3A基因突變錯義突變，該突變可能具有致病性。

熱性驚厥；SCN1A基因；SCN3A基因；篩查

熱性驚厥（febrile seizures，F(xiàn)S）是兒童期很常見和具有代表性的癲癇發(fā)作，與發(fā)熱及年齡相關(guān)，多在體溫＞38.5℃發(fā)作，一般3個月～6歲發(fā)病，患病率為3%～5%，發(fā)作形式多為強(qiáng)直陣攣發(fā)作。電壓門控鈉離子通道基因突變是熱性驚厥的最常見病因，在家族性患者中更為多見[1]。癲癇是由于腦部神經(jīng)元電活動異常而導(dǎo)致的短暫、發(fā)作性疾病。離子通道基因突變能夠?qū)е律窠?jīng)細(xì)胞動作電位的產(chǎn)生和傳播發(fā)生改變，因而與癲癇的發(fā)生密切相關(guān)。SCN1A基因是與熱性驚厥關(guān)系最為密切的基因，國內(nèi)外研究最多，迄今發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)最多，已經(jīng)＞1 000個[2-6]。SCN1A和SCN3A基因?yàn)殁c通道的不同亞型，基因定位相似，主要分布在大腦神經(jīng)元的胞體部位，功能特性上具有相似性，然而對于SCN3A與熱性驚厥或相關(guān)性癲癇關(guān)系的報(bào)道仍然很少[7-11]。對于SCN1A基因突變陰性的患者，可能存在其他致病基因的突變，本文擬收集SCN1A基因突變陰性的熱性驚厥患者，進(jìn)行SCN3A基因篩查，并初步分析其致病性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2013年6月-2016年6月南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科和小兒科就診的FS患者38例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①起病年齡3個月～6歲，急性發(fā)熱（體溫≥38.5℃）而誘發(fā)的全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作；②熱性驚厥持續(xù)到6歲后，或出現(xiàn)無熱驚厥，發(fā)作形式為部分性和或全面性發(fā)作；③性別及就診年齡不限；④排除顱內(nèi)感染、腦損傷等疾??；⑤已行SCN1A基因篩查未見突變。選取100例健康志愿者作為正常對照組。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，入組對象簽署知情同意書。參照BAULAC[12]和LIAO等[13]的描述對入組患者進(jìn)行分類診斷。熱性驚厥：3個月～6歲，只在發(fā)熱時出現(xiàn)驚厥發(fā)作，無熱時無發(fā)作，未用藥物或簡單少量的抗癲癇藥即能完全控制發(fā)作，6歲后不再發(fā)作，智能發(fā)育無異常；熱性驚厥附加征（febrile seizures plus，F(xiàn)S+）：3個月～6歲有 FS或無熱驚厥，6歲后仍有熱性或無熱發(fā)作；部分性癲癇伴熱性驚厥附加征（partial epilepsy with febrile seizures plus，PEFS+）：符合FS+患者，發(fā)作形式只有部分性或部分繼發(fā)全面性發(fā)作，腦電圖表現(xiàn)多為局灶性異常；全面性癲癇伴熱性驚厥附加征（generalized epilepsy with febrile seizures plus，GEFS+）：符合 FS+ 患者，臨床表型只有全面性發(fā)作；嬰兒重癥肌陣攣性癲癇（severe myoclonic epilepsy in infancy，SMEI）：1 歲內(nèi)起病，起病前精神運(yùn)動發(fā)育無異常，起病時表現(xiàn)為熱性和無熱的單側(cè)或雙側(cè)陣攣或強(qiáng)直陣攣發(fā)作，起病后出現(xiàn)肌陣攣發(fā)作等多種發(fā)作形式，但以部分性發(fā)作為主，且伴精神運(yùn)動發(fā)育遲滯，腦電圖表現(xiàn)為局灶性、多灶性甚至廣泛的異常，治療效果不好，預(yù)后差。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 收集患者和健康志愿者的外周靜脈血4 ml，采用美國傲銳基因技術(shù)有限公司提供的Quick-Gene-610L和Quick Genen Mini 80基因組DNA快速提取試劑盒抽提DNA，置入-20℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物合成 參照文獻(xiàn)[7]合成引物，序列覆蓋所有外顯子編碼區(qū)和內(nèi)含子-外顯子剪切區(qū)，由上海生工生物工程股份有限公司合成，轉(zhuǎn)錄本號為NM066922。

1.2.3 篩查方案 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增SCN3A基因全部外顯子，使用廣州東盛生物科技有限公司的Taq DNA酶和2×HSTMReaction Mix冰上配置PCR體系（基因組200 ng+正反向引物各5 μl+Mix 25 μl+Taq酶0.5 μl+ddH2O至50μl，引物工作濃度為10μmol/L），取3 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，若電泳條帶單一且清晰，取剩余PCR產(chǎn)物連同引物送至深圳華大基因有限公司測序。采用Vector-NTI-V8.0生物軟件進(jìn)行序列比對，若發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)則擴(kuò)增100例正常人同一片段進(jìn)行測序?qū)φ?，為判斷突變來源，收集患者雙親血液驗(yàn)證。

1.2.4 生物軟件分析 對于發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，采用Clustalx1行保守性分析及Mutation Taster軟件預(yù)測其致病性（網(wǎng)址http：//www.mutationtaster.org，輸入SCN3A基因名稱，選擇轉(zhuǎn)錄本NM_006922，輸入突變后的堿基及位置，點(diǎn)擊進(jìn)入，了解在千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫中的突變情況，初步判斷其致病性）。

2 結(jié)果

2.1 突變位點(diǎn)及致病性分析

納入38例SCN1A基因陰性的熱性驚厥患者，發(fā)現(xiàn)2例雜合錯義突變（c.956T＞C/p.I319T，c.5179G＞A/p.D1727N）。c.956T＞C導(dǎo)致第319位的氨基酸殘基遺傳密碼子上第2個堿基胸腺嘧啶被胞嘧啶取代（ATT→ACT），導(dǎo)致異亮氨酸變?yōu)樘K氨酸。該突變位于第6號外顯子上，雙親DNA驗(yàn)證來源于父親。c.5179G＞A導(dǎo)致1727位氨基酸殘基遺傳密碼子上第1個堿基鳥嘌呤被腺嘌呤取代（GAC→AAC），導(dǎo)致天冬氨酸變?yōu)樘於０?，位于?6號外顯子上，父母親中未發(fā)現(xiàn)相同位點(diǎn)改變，提示為新生突變。2個錯義突變都位于在鈉離子通道的孔區(qū)，前者在DⅠS5-S6，后者在DⅣS5-S6。在人的分布于神經(jīng)系統(tǒng)鈉通道亞型中（如SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN8A、SCN9A、SCN10A），以及哺乳動物狗、大鼠小鼠中序列一致。同源性分析提示保守性高，兩者在100例正常對照組中未發(fā)現(xiàn)同樣的變異，Mutation Taster軟件分析在千人基因組計(jì)劃中未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的突變位點(diǎn)，提示兩者都可能具有致病性。見圖1、2。

圖1SCN3A基因突變位點(diǎn)測序圖

圖2SCN3A突變位點(diǎn)位置示意圖及保守性分析

2.2 臨床資料

納入38例患者，其中男性24例，女性14例首發(fā)年齡（3.6±0.5）歲，5例有FS家族史，33例為散發(fā)，27例智能發(fā)育差，11例智能正常。1例患者可能表現(xiàn)出多種發(fā)作形式，統(tǒng)計(jì)發(fā)作形式如下：復(fù)雜部分性發(fā)作（complex partial seizure，CPS）14 例，全面性強(qiáng)直陣攣發(fā)作（generalized tonic-clonic seizure，GTCS）15 例，繼發(fā)性 GTCS（secondary gtcs，sGTCS）7 例，失神3例，肌陣攣4例，強(qiáng)直8例，陣攣5例，3例有癲癇持續(xù)狀態(tài)等。腦電圖有局灶性棘慢波發(fā)放的12例，全面性棘慢復(fù)合波15例，未見放電的7例，其他4例。影像學(xué)有異常提示10例，表現(xiàn)為大腦皮質(zhì)發(fā)育不良、皮質(zhì)局灶性低密度影、海馬萎縮等。藥物以丙戊酸鈉口服液使用最多，其次奧卡西平、卡馬西平、拉莫三嗪、托吡酯及氯硝西泮等，單藥治療控制較好的12例，其余使用二聯(lián)或＞3種藥物。分類診斷FS 4例，F(xiàn)S+7例，PEFS+9例，GEFS+8例，SMEI 10例。

2例突變患者病史如下：1例為男性，3歲時在體溫39℃首次發(fā)作，表現(xiàn)為全面性大發(fā)作，此后發(fā)熱就有發(fā)作，6歲以后不發(fā)熱也有發(fā)作，腦電圖提示為全面性慢波，MRI未見異常，診斷為GEFS+，服用過苯妥英鈉、卡馬西平效果差，加丙戊酸鈉后發(fā)作減少，其父親2歲時有FS，此后未有再發(fā)；另外1例為女性，3.5歲首發(fā)，體溫38.5℃，表現(xiàn)為部分性發(fā)作為主，間斷全面性發(fā)作，此后多次發(fā)作。6歲仍然有發(fā)作，與發(fā)熱無關(guān)，其姑媽2～5歲時有FS，此后未再發(fā)。MRI提示左側(cè)海馬信號略高，腦電圖示局灶性慢波發(fā)放，臨床診斷PEFS+，服用奧卡西平、左乙拉西坦、拉莫三嗪等藥物發(fā)作減少。2例患者智商分別為45和27分，提示存在中度或重度智能障礙，尤其是語言功能明顯受損。

3 討論

大家系連鎖分析揭示FS是常染色體顯性遺傳模式，目前已經(jīng)將FS相關(guān)基因定位擴(kuò)大到11個染色體位點(diǎn)上，命名為FEB1～FEB11，其中位點(diǎn)FEB3（2q23～24）與SCN1A和SCN3A基因在2號染色體上的簇集位置一致[14]。SCN1A基因突變已明確是FS相關(guān)性癲癇的主要致病原因，SCN3A基因與SCN1A的位置相近，都分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，亞細(xì)胞定位于神經(jīng)元的胞體和樹突，但是SCN3A突變與FS的相關(guān)性未引起重視，研究報(bào)道很少。2009年國內(nèi)王鵬[8]首先在伴有智能障礙的熱性驚厥患者中發(fā)現(xiàn)2例SCN3A基因突變（A463V，D998E），其后郭靜[9]發(fā)現(xiàn)4例突變（A201V、N302S、R520T及 D530G），其中D530G是在27例SCN1A基因突變陽性患者中發(fā)現(xiàn)，提示SCN3A基因突變率與SCN1A相比較非常低。VANOYE等[10]在局灶性癲癇患兒發(fā)現(xiàn)M1323V突變，該突變可能是國外第1個報(bào)道SCN3A基因與FS相關(guān)的突變位點(diǎn)，患者16個月大時僅表現(xiàn)為單純性FS發(fā)作。

不管是FS患者還是其他遺傳性疾病患者，同時存在≥2種基因突變的情況極為少見，其發(fā)病機(jī)制可能也更為復(fù)雜，其致病性可能以其中一種為主，另一種起修飾作用，加強(qiáng)或者減弱前者的致病性。SCN1A基因突變陰性的FS患者可能存在其他基因突變，本文對38例患者施行SCN3A篩查，發(fā)現(xiàn)2例錯義突變，突變率僅為5.26%（2/38），100例正常對照組未發(fā)現(xiàn)相同位點(diǎn)改變。生物軟件分析表明，2個突變點(diǎn)保守性高，在千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫和100例正常人中未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的突變，提示可能為致病性突變，SCN3A基因缺陷容易導(dǎo)致癲癇易感性增加[15]。VECCHI等[16]利用陣列比較基因組雜交技術(shù)，發(fā)現(xiàn)1例癲癇患兒的2號染色體上存在12 Mb長度的鈉通道集群的缺失，該缺失片段覆蓋SCN3A基因，該患者同時存在FS發(fā)作和智能障礙。本研究發(fā)現(xiàn)的2例突變患者都存在智能障礙，即智能障礙的FS患者中SCN3A的突變率為7.41%（2/27），而在11例智能正常的患者中無一例突變發(fā)現(xiàn)，表明在伴有智能障礙者中的突變率高于總突變率，提示SCN3A突變可能與智能障礙相關(guān)。

FS具有明確的遺傳易感性，家族性發(fā)病常見，患者同胞的患病率較普通人群高19.9%～24.9%[17]。本研究納入患者多為散發(fā)病例，樣本量較小，突變率低可能還不能反映實(shí)際情況，如果能夠進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、盡量收集到家系病例，突變率可能增高。鈉離子通道基因發(fā)生突變后如何導(dǎo)致癲癇的發(fā)生，其發(fā)病機(jī)制是非常復(fù)雜的問題。突變后通道的功能發(fā)生改變，導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞電活動異常，可能是癲癇發(fā)生的分子機(jī)制，膜片鉗電生理功能研究亦是進(jìn)一步研究的方向[18]。

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（童穎丹 編輯）

Screening ofSCN3Agene mutations inSCN1Amutation negative patients with febrile seizures*

Yong-jun Chen1,Xi-jin Liu1,Wei-ping Liao2,Jing Guo3,Xin Li1,Yi-li Yi1
(1.Department of Neurology,Nanhua Hospital Affiliated to University of South China,Hengyang,Hunan 421002,China;2.Institute of Neuroscience,the Second Affiliated Hospital,Guangzhou Medical University,Guangzhou,Guangdong 510120,China;3.Department of Neurology,the First People's Hospital of Foshan City,Foshan,Guangdong 528000,China)

ObjectiveTo screenSCN3Agene mutations in patients with febrile seizures but noSCN1Amutation,and to analyze the genetic characteristics.MethodsThe mutations ofSCN3Agene were screened in 38 patients by PCR amplification and Sanger sequencing,and the genetic characteristics of the mutations were analyzed using the biological software.ResultsTwo missense mutations (c.956T＞C/p.I319T,c.5179G＞A/p.D1727N)were found.And homology comparison analysis suggested that the mutations were highly conserved,and no corresponding locus changes were found in the thousand human genome project database or in 100 normal people.ConclusionsThere are two missense mutations ofSCN3Agene in patients with negative SCN1A mutation,and theSCN3Agene mutations may be pathogenic.

febrile seizures;SCN1Agene;SCN3Agene;screening

R742.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.007

1005-8982（2017）17-0035-05

2017-03-02

湖南省教育廳高?？蒲幸话沩?xiàng)目（No：15C1206）