劉華松，徐蘭蘭，張軍，郭家龍，林稱意，原野，曾敏，程棟梁

[1.湖北省十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）胸心大血管外科，湖北 十堰 442099；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，湖北 十堰 442000]

PTPN14對(duì)食管癌的抑制作用及其機(jī)制研究*

劉華松1，徐蘭蘭2，張軍1，郭家龍1，林稱意1，原野1，曾敏1，程棟梁1

[1.湖北省十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）胸心大血管外科，湖北 十堰 442099；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院 護(hù)理學(xué)院，湖北 十堰 442000]

目的探討蛋白酪氨酸磷酸酶14（PTPN14）對(duì)食管癌的抑癌作用及其機(jī)制。方法通過(guò)轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)粒過(guò)表達(dá)食管癌細(xì)胞EC9706中PTPN14的表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)及Western blot檢測(cè)其過(guò)表達(dá)效果；四甲基偶氮唑鹽比色法檢測(cè)過(guò)表達(dá)PTPN14對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PTPN14對(duì)EC9706細(xì)胞周期的影響；Western blot檢測(cè)過(guò)表達(dá)PTPN14對(duì)YAP蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)?？缮险{(diào)食管癌細(xì)胞系EC9706中PTPN14的表達(dá)；過(guò)表達(dá)EC9706細(xì)胞中PTPN14可以抑制食管癌細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G1期；過(guò)表達(dá)EC9706中PTPN14可以下調(diào)細(xì)胞中YAP的表達(dá)水平。結(jié)論P(yáng)TPN14可通過(guò)下調(diào)YAP，阻滯食管癌細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。

蛋白酪氨酸磷酸酶14；YAP；增殖；食管癌

食管癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，是我國(guó)主要的惡性腫瘤之一，在腫瘤死因中食管癌的死亡率占11.19%，位居第4位，嚴(yán)重影響患者的健康和生命[1]。隨著醫(yī)學(xué)及生物科學(xué)的逐步發(fā)展，食管癌的研究逐漸深入。食管癌發(fā)生、發(fā)展的致病基因不斷被發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)制的研究已成為目前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型14（tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 14，PTPN14）是由PTPN14基因編碼的酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTPs）家族的成員之一。PTPs可參與調(diào)控多種細(xì)胞過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化及有絲分裂，甚至惡性轉(zhuǎn)變[2]。然而PTPN14在食管癌細(xì)胞中的作用及機(jī)制，目前尚未有研究報(bào)道。本研究闡明過(guò)表達(dá)食管癌細(xì)胞系EC9706中PTPN14的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PTPN14可抑制食管癌細(xì)胞的增殖，阻滯食管癌細(xì)胞的周期，下調(diào)細(xì)胞中YAP的表達(dá)，為尋找食管癌的致病分子及進(jìn)一步闡明食管癌的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，Trizol裂解液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，PTPN14質(zhì)粒及對(duì)照載體購(gòu)自北京普如汀生物技術(shù)有限公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，小鼠抗人單克隆PTPN14、YAP、βactin的一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，羊抗小鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋科技有限公司，四甲基偶氮唑鹽比色法[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司，食管癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 食管癌細(xì)胞系EC9706用含100 ml/L胎牛血清的改良伊格爾培養(yǎng)基培養(yǎng)，37℃、50 ml/L二氧化碳CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%～80%融合度后，將PTPN14質(zhì)粒及對(duì)照載體經(jīng)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)入EC9706細(xì)胞中，具體操作步驟參見(jiàn)脂質(zhì)體試劑說(shuō)明書(shū)。將轉(zhuǎn)染后食管癌細(xì)胞分別為PTPN14-vetor組和PTPN14-NC組。

1.2.2PTPN14基因表達(dá)水平檢測(cè) 待食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，用Trizol裂解細(xì)胞，分別提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板。根據(jù)PTPN14（NM_005401）序列設(shè)計(jì)引物，正向引物：5'-TCTAGGATGTGTGCCAGGGA-3'；反向引物：5'-TGT GGTGCTTCCGGAAATGTRT-3'。產(chǎn)物長(zhǎng)度為 123 bp，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）的反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 3 min，95℃變性 15 s，59℃退火 35 s，共39個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 PTPN14和YAP蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染后48 h細(xì)胞，胰酶消化后，離心，棄上清液，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解45 min，4℃、10 000 r/min離心20 min，取部分上清行蛋白質(zhì)定量，其余加入上樣緩沖液，100℃煮沸5 min變性，取上述變性蛋白30 μg，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，半干轉(zhuǎn)方式將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜上。室溫封閉2 h。分別加入 PTPN14、YAP、β-actin 的一抗，4℃過(guò)夜，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌3次，6 min/次，加入二抗，室溫孵育1.5 h，PBS洗滌3次，6 min/次；加入顯色劑顯色、成像。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以4.0×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔板，每組7個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)1～5 d，每24 h取出96孔板，向每孔中加入濃度為1.5 g/L MTT 20μl，培養(yǎng)4 h后，再向每孔加入二甲基亞砜150 μl，讀值并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 取轉(zhuǎn)染48 h后的PTPN14-vetor組和PTPN14-NC組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，用5 ml PBS，1 000 r/min離心5 min，反復(fù)洗滌3次后，棄上清液；加入1 ml 70%預(yù)冷乙醇中，吹打均勻，4℃固定12 h，PBS洗滌，去乙醇，1 000 r/min離心5 min，洗3遍。PBS重懸細(xì)胞，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI）和核糖核酸酶A至終濃度50 μg/ml，37℃溫浴30 min。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)粒上調(diào)EC9706細(xì)胞中PTPN14基因表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染空載體及PTPN14質(zhì)粒于食管癌EC9706細(xì)胞48 h，分別提取各組細(xì)胞總RNA，各自逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，qRT-PCR檢測(cè)各組 PTPN14的表達(dá)，PTPN14-vetor組與PTPN14-NC組的PTPN14表達(dá)水平比較，經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.714，P=0.007），PTPN14-vetor組高于 PTPN14-NC組。見(jiàn)圖1。

2.2 轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)粒增強(qiáng)EC9706細(xì)胞中PTPN14蛋白表達(dá)水平

轉(zhuǎn)染空載體及PTPN14質(zhì)粒于食管癌EC9706細(xì)胞48h，分別提取各組細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)各組PTPN14的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PTPN14-vetor組的PTPN14表達(dá)較PTPN14-NC組上升。見(jiàn)圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)粒抑制EC9706細(xì)胞的增殖

MTT檢測(cè)轉(zhuǎn)染空載體與PTPN14質(zhì)粒的EC9706細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，從檢測(cè)后第3天開(kāi)始，PTPN14-vetor組的細(xì)胞增殖與PTPN14-NC組比較，經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.265，P=0.014）。見(jiàn)圖 3。

2.4 轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)粒阻滯EC9706細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染空載體與PTPN14質(zhì)粒的EC9706細(xì)胞周期情況。結(jié)果顯示，PTPN14-NC組G1期比例為（48.45±7.24），PTPN14-vetor組 G1期比例為（62.79±5.87），經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.586，P=0.011），轉(zhuǎn)染 PTPN14-vetor組的EC9706細(xì)胞周期被阻滯在G1期。見(jiàn)圖4。

2.5 轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)粒下調(diào)EC9706細(xì)胞中YAP的表達(dá)

Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染空載體與PTPN14質(zhì)粒的EC9706細(xì)胞中YAP的表達(dá)。結(jié)果顯示，與PTPN14-NC組比較，轉(zhuǎn)染PTPN14-vetor組EC9706細(xì)胞中YAP的表達(dá)降低。見(jiàn)圖5。

圖1 轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)粒上調(diào)EC9706細(xì)胞中的PTPN14基因的表達(dá)水平 （±s）

圖2 轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)粒增強(qiáng)EC9706細(xì)胞中PTPN14的蛋白表達(dá)水平

圖3 轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)粒與空載體的EC9706細(xì)胞增殖情況

圖4 轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)粒與PTPN14空載體的EC9706細(xì)胞周期

圖5 轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)粒與空載體的EC9706細(xì)胞中YAP的表達(dá)

3 討論

1995年，科學(xué)家在尋找正常乳腺組織中表達(dá)的酪氨酸磷酸酶時(shí)，PTPN14首次被克隆發(fā)現(xiàn)[3]。其是非受體酪氨酸磷酸酶家族的蛋白成員之一。研究顯示，PTPN14在乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤中存在突變[4-6]。在小鼠胰腺腫瘤的基因分析研究中發(fā)現(xiàn)，PTPN14表達(dá)明顯下調(diào)（P＜10～10.8）[7]。浸潤(rùn)性乳腺癌組織中PTPN14表達(dá)明顯降低，敲低PTPN14可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移[8]。此外，PTPN14一直被認(rèn)為參與細(xì)胞的增殖調(diào)控。有研究顯示，PTPN14為micro RNA-21（miR-21）的直接靶基因，在肝內(nèi)膽管癌中miR-21過(guò)表達(dá)，并靶向作用于PTPN14使其下調(diào)，從而促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡[9]。本研究探索PTPN14對(duì)食管癌細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)食管癌細(xì)胞中PTPN14可以明顯阻滯細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖，證實(shí)在食管癌中PTPN14對(duì)細(xì)胞增殖有重要調(diào)控作用。

Hippo信號(hào)通路是目前研究熱點(diǎn)之一，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。在哺乳動(dòng)物中，Hippo信號(hào)通路上游的膜蛋白受體感受到細(xì)胞外的生長(zhǎng)抑制信號(hào)后，經(jīng)過(guò)一系列激酶的磷酸化反應(yīng)，最終作用于下游效應(yīng)分子YAP/TAZ使其滯留于胞質(zhì)內(nèi)，不能入核行使功能。然而，未被抑制的YAP/TAZ將會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，作為共激活因子或轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及凋亡[10]。YAP/TAZ作為Hippo信號(hào)通路的主要效應(yīng)分子，是一種致癌蛋白，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可作為腫瘤診斷及預(yù)后判斷的獨(dú)立標(biāo)志物[11]。有研究顯示，PTPN14可以通過(guò)Hippo信號(hào)通路參與癌癥的形成和發(fā)展。WILSON等[12]研究顯示，PTPN14可以通過(guò)PPXY結(jié)構(gòu)域與Kibra蛋白質(zhì)的WW結(jié)構(gòu)域相互作用，PTPN14與Kibra結(jié)合可以誘導(dǎo)LATS1的激活；此外，PTPN14還可以增加LAST1蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，而LATS1的激活可以抑制YAP的致癌功能。有研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺上皮細(xì)胞中PTPN14通過(guò)與YAP結(jié)合從而負(fù)調(diào)控YAP，下調(diào)PTPN14，可以導(dǎo)致YAP的異常表達(dá)，從而引起細(xì)胞發(fā)生惡變[13]；PTPN14也可以通過(guò)PPXY結(jié)構(gòu)域與YAP蛋白質(zhì)的WW結(jié)構(gòu)域相互作用形成復(fù)合物，并抑制YAP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄功能[14]。本研究探索食管癌中PTPN14對(duì)YAP的影響，發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PTPN14可以明顯抑制YAP的表達(dá)，提示在食管癌中PTPN14很可能通過(guò)抑制YAP參與調(diào)控細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染PTPN14質(zhì)粒過(guò)表達(dá)食管癌細(xì)胞中PTPN14的表達(dá)，檢測(cè)PTPN14對(duì)食管癌細(xì)胞系增殖周期的作用，以及對(duì)YAP表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)PTPN14可以抑制食管癌細(xì)胞增殖，阻滯食管癌細(xì)胞周期，抑制YAP的表達(dá)。研究結(jié)果表明，PTPN14在食管癌增殖周期中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究PTPN14在食管癌發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論基礎(chǔ)，為食管癌的治療提供新的分子靶標(biāo)。

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（童穎丹 編輯）

PTPN14 inhibits proliferative ability of esophageal cancer cells via hippo/YAP pathway*

Hua-song Liu1,Lan-lan Xu2,Jun Zhang1,Jia-long Guo1,Chen-yi Lin1,Ye Yuan1,Min Zeng1,Dong-liang Cheng1
(1.Department of Thoraco-cardio-macrovascular Surgery,the Affiliated Hospital of Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei 442099,China;2.Shool of Nursing,Hubei University of Medicine,Shiyan,Hubei 442000,China)

ObjectiveTo investigate the tumor-suppressing role of protein tyrosine phosphatase nonreceptor type 14 (PTPN14)in esophageal carcinoma and the mechanism.MethodsEC9706 cells were transfected with PTPN14 over-expression vector,and then PTPN14 expression in the EC9706 cells was detected by qRT-QPCR and Western blot.The proliferation of the EC9706 cells was analyzed by MTT.The cell cycle of the EC9706 cells was analyzed by flow cytometry.The expression of YAP was detected by Western blot.ResultsThe expression level of PTPN14 was significantly upregulated in the EC9706 cells transfected with PTPN14 over-expression vector.After transfection,the proliferation of EC9706 cells was inhibited,the cell cycle was blocked at G1,and YAP expression was decreased.ConclusionsPTPN14 may block cell cycle and inhibit proliferation of esophageal cancer cells by down-regulation of YAP.

protein tyrosine phosphatase non-receptor type 14;YAP;proliferation;esophageal cancer

R735.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.005

1005-8982（2017）17-0025-04

2016-04-06

湖北省教育廳項(xiàng)目（No：B2016497）

張軍，E-mail：zhjun159@sina.com；Tel：13508684276