李克躍，石承先，湯可立，劉振華，黎濤，張帥民，徐賢剛

（貴州省人民醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550002）

地塞米松抑制膽管瘢痕成纖維細胞的體外研究*

李克躍，石承先，湯可立，劉振華，黎濤，張帥民，徐賢剛

（貴州省人民醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550002）

目的研究地塞米松（DEX）對體外培養(yǎng)的兔膽管瘢痕模型成纖維細胞（MF）中I型膠原、結(jié)締組織生長因子（CTGF）及第10號染色體丟失的張力蛋白同源的磷酸酶基因（PTEN）表達的影響。方法對家兔采用切開再吻合方法復(fù)制膽管瘢痕模型并獲取MF，經(jīng)細胞鑒定后對MF給予不同濃度的DEX（0.00、0.01、0.05和0.25 mg/ml）干預(yù)48 h，活細胞計數(shù)法試劑盒測定各組細胞增殖水平；實時聚合酶鏈反應(yīng)檢測各組細胞I型膠原、CTGF和PTEN mRNA表達水平；Western blot檢測各組細胞I型膠原和PTEN蛋白表達水平。結(jié)果在DEX干預(yù)48 h后，MF增殖受抑制，細胞I型膠原、CTGF mRNA和蛋白表達下調(diào)，PTEN mRNA和蛋白表達上調(diào)（P＜0.05），呈濃度依耐性。結(jié)論DEX可能具有抑制膽管瘢痕及良性膽道狹窄形成的作用，其機制之一可能與MF中I型膠原、CTGF及PTEN的調(diào)控有關(guān)。

膽管瘢痕；成纖維細胞；抑制；體外；地塞米松

良性膽道狹窄（benign biliary stricture，BBS）的直接原因是膽道增生性瘢痕的形成，其發(fā)病率逐年增高。成纖維細胞大量增殖、Ⅰ型膠原過度積聚及結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的過高表達等是瘢痕及BBS的主要特征[1-4]。第10號染色體丟失的張力蛋白同源的磷酸酶基因（phosphataseand tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）可抑制皮膚瘢痕的形成[5-6]。地塞米松（Dexamethasone，DEX）已被用于防治皮膚瘢痕形成[7-9]。但DEX對BBS的作用尚不清楚。本研究對BBS膽管成纖維細胞使用DEX進行干預(yù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

抗-Ⅰ型膠原蛋白抗體（SAB2100463）、抗-PTEN蛋白抗體（PLA0133）、抗-波形蛋白單克隆抗體（V2258）、抗 -細胞角蛋白單克隆抗體（C-1801）及聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜購自美國Sigma公司，抗-β-肌動蛋白（β-actin）單克隆抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的第二抗體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）試劑盒（美國Millipore公司），SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNase H Plus）（大連寶生生物工程公司有限公司），4'，6- 二脒基 -2- 苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（瑞士 Roche 公司），全蛋白提取試劑盒、UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、β-actin引物、Trizol、胰酶（0.25%）、活細胞計數(shù)法試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）購自上海生工生物工程股份有限公司，Ⅰ型膠原、CTGF、PTEN引物購自上海Introgen公司，Ⅰ型膠原正向引物：5'-AGAACGGAGATGACGG AGAA-3'，反向引物：5'-CCAAACCACTGAAACCTC TGT-3'；CTGF 正向引物：5'-GGCTAAGTTCTGCGGA GTATG-3'，反向引物：5'-CAGGCACAGGTCTTGATG AA-3'；PTEN 正向引物：5'-AAACAGTAGAGGAGCC ATCAAATC-3'，反向引物：5'-TCAGAGTCAGTGGTG TCAGAAT-3'；β-actin 正向引物：5'-CTCTCCACCT TCCAGCAGAT-3'，反向引物：5'-TGGCTCTAACAGT CCGCCTA-3'。地塞米松磷酸鈉注射液（武漢華中藥業(yè)有限公司，批號：20150204），家兔4只購自貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 動物模型的復(fù)制、細胞的獲取及細胞鑒定

清潔級家兔4只，其中2只用于正常對照組，2只用于復(fù)制BBS模型，術(shù)前12 h禁食，分籠飼養(yǎng)，動物的飼養(yǎng)在貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心進行。動物未出現(xiàn)死亡、膽瘺等并發(fā)癥。采用2.5%戊巴比妥鈉溶液（40～45 mg/kg體重）靜脈注射麻醉，取上腹部正中切口，切開皮膚及皮下組織，暴露膽總管，BBS模型組在近十二指腸處游離長約1 cm的膽總管，橫向切開膽總管，長約其周徑的1/3，用Dexon線縫合膽總管，逐層關(guān)腹[3]。正常對照組開腹后就關(guān)腹，不打開膽總管。各組術(shù)后禁食12 h后正常進食。取BBS模型組及正常對照組術(shù)后1周膽管壁[3]，膽管組織用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS）清洗3次后剪為2～3 mm3大小，轉(zhuǎn)移至25 cm2培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5%二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中貼壁4 h，加入少許含 20%（v/v）FBS、100 u/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)[10]。使用差速貼壁法分離，純化成纖維細胞，細胞生長至80%～90%融合時傳代。選擇第3代成纖維細胞進行細胞鑒定。使用細胞免疫熒光法檢測波形蛋白和細胞角蛋白抗體的表達，進行成纖維細胞的鑒定[10]。實驗所用細胞為第3～5代成纖維細胞。

1.3 分組及各組細胞的處理

實驗分組如下：正常膽管成纖維細胞（normal bile duct fibroblasts，NF）組；BBS 模型膽管成纖維細胞（model fibroblasts，MF）組；MF+ 不同濃度的DEX 組（DEX濃度分別為0.01，0.05和0.25 mg/ml）。細胞經(jīng)消化后，轉(zhuǎn)移到6孔板（細胞增殖測定用96孔板），細胞密度為2×105個/孔（細胞增殖測定2×104個/孔）。含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h后改為不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基饑餓過夜，根據(jù)分組的不同加用含對應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基在37℃、5%C02培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)48 h。

1.4 觀察指標(biāo)及測定方法

1.4.1 成纖維細胞 采用細胞免疫熒光法，胰酶消化細胞，按照2×105個/孔均勻接種至帶有玻璃片的6孔板中，24 h后進行免疫熒光操作，具體步驟如下：PBS清洗細胞，4%多聚甲醛室溫固定15 min；PBS清洗后加入0.1%Triton-100室溫孵育10 min，PBS清洗后加入10%山羊血清室溫封閉30 min，吸取150 μl第一抗體（波形蛋白和細胞角蛋白稀釋至1∶200）滴在封口膜上，將蓋玻片倒扣于封口膜，4℃孵育過夜。將蓋玻片放入6孔板中，PBS清洗后加入含山羊抗小鼠的Alexia第二抗體室溫孵育30 min，PBS 清洗后滴加稀釋的 DAPI（1∶100）；封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。陰性對照以PBS代替第一抗體，排除非特異性的第二抗體結(jié)合。

1.4.2 成纖維細胞增殖的測定 按CCK-8說明書進行操作。將成纖維細胞按照2×104個/孔接種于96孔板，100μl/孔，重復(fù)5次/孔。細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后根據(jù)分組的不同，加入對應(yīng)濃度的DEX分別培養(yǎng)48 h，加入CCK-8試劑10 μl/孔培養(yǎng)2.5 h，在酶標(biāo)儀上450 nm波長處測定每孔的光密度（optical density，OD）值，采用扣除本底策略來消除誤差。

1.4.3 各組細胞中I型膠原、CTGF及PTEN mRNA表達的檢測 采用用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRTPCR）分別提取各組細胞總RNA，將純度好、完整性高的RNA合成cDNA。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μl，其中正反向引物各 0.8 μl，樣品 cDNA 2 μl，雙蒸水 6 μl，2×SYBRR Premix 10 μl，ROX Reference Dye（50×）0.4 μl，每個樣品重復(fù) 4 次。PCR 反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 30 s，95℃變性 5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。使用ABI Stepone software v 2.3 qRTPCR系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)并分析結(jié)果，熔解曲線為單峰表示引物特異性好，β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計算目的基因的相對表達量。

1.5 各組細胞中I型膠原及PTEN蛋白表達的檢測

采用Western blot檢測分別提取各組細胞總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，用聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜后給予封閉，按1∶5 000稀釋目的蛋白的一抗，在4℃冰箱內(nèi)孵育過夜，以三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）在搖床上洗PVDF膜3次。按1∶5 000稀釋二抗，在室溫下振蕩孵育2 h，以TBST清洗PVDF膜3次，10 min/次。電化學(xué)發(fā)光后用顯影和定影方法對膠片進行拍照和掃描，β-actin蛋白為內(nèi)參，以Quantity One系統(tǒng)分析目的條帶的相對灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用方差分析，兩兩比較用Bonferroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成纖維細胞的鑒定

鏡下可見原代培養(yǎng)的膽管成纖維細胞部分呈不規(guī)則三角形，胞質(zhì)淡而透明，折光弱，細胞核較大，呈橢圓形，通常含2或3個核，隨后逐漸變?yōu)樗笮蔚膯蝹€核細胞，為成纖維樣細胞。第3代成纖維細胞波形蛋白細胞免疫熒光陽性，細胞角蛋白細胞免疫熒光陰性，符合成纖維細胞的特點。見圖1。

圖1 兔膽管成纖維細胞的鑒定 （熒光顯微鏡×100）

2.2 各組增殖水平的比較

NF組OD值為（0.329±0.005），MF組 OD值為（0.531±0.007），MF+DEX 0.01 mg/ml組 OD 值為（0.501±0.007），MF+DEX 0.05 mg/ml組 OD 值為（0.458±0.004），MF+DEX 0.25 mg/ml組 OD 值為（0.398±0.004），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 120.000，P=0.000）；MF組的 OD 值較 NF組的高，MF+DEX組OD值較MF組低。見圖2。

2.3 各組I型膠原、CTGF及PTEN mRNA表達的比較

各組細胞Ⅰ型膠原mRNA的相對表達量：NF組為（1.000±0.002），MF 組為（2.957±0.023），MF+DEX 0.01 mg/ml組為（2.718±0.054），MF+DEX 0.05 mg/ml組為（2.453±0.053），MF+DEX 0.25 mg/ml組為（2.182±0.036），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 629.000，P=0.000）；MF 組的Ⅰ型膠原mRNA表達較NF組高，MF+DEX組的Ⅰ型膠原mRNA表達較MF組低。見表1。

圖2 不同組別細胞增殖水平比較 （±s）

各組細胞CTGF mRNA的相對表達量：NF組為（1.000±0.003），MF 組為（3.365±0.009），MF+DEX 0.01 mg/ml組為（2.952±0.035），MF+DEX 0.05 mg/ml組為 （2.542±0.047），MF+DEX 0.25 mg/ml組為（2.007±0.045），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=3 026.000，P=0.000）；MF 組 CTGF mRNA表達較NF組高，MF+DEX組CTGF mRNA表達較MF組低。見表1。

各組細胞PTEN mRNA的相對表達量：NF組為（1.000±0.006），MF 組為（0.416±0.024），MF+DEX 0.01 mg/ml組為（0.448±0.009），MF+DEX 0.05 mg/ml組 為 （0.537±0.053），MF+DEX 0.25 mg/ml組 為（0.620±0.029），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=304.179，P=0.000）；MF 組 PTEN mRNA 表達較NF組低，MF+DEX組PTEN mRNA表達較MF組高。見表1。

2.4 各組I型膠原和PTEN蛋白表達水平的比較

各組細胞Ⅰ型膠原蛋白的相對表達量：NF組為（1.000±0.021），MF 組為（2.706±0.032），MF+DEX 0.01 mg/ml組為（2.643±0.043），MF+DEX 0.05 mg/ml組為 （2.175±0.060），MF+DEX 0.25 mg/ml組為（1.847±0.028），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=1 256.000，P=0.000）；MF組Ⅰ型膠原蛋白表達較NF組高，MF+DEX組Ⅰ型膠原蛋白表達較MF組低。見表2和圖3。

各組細胞PTEN蛋白的相對表達量：NF組為（1.000±0.044），MF 組為（0.494±0.049），MF+DEX 0.01 mg/ml組為（0.535±0.038），MF+DEX 0.05 mg/ml組為 （0.623±0.028），MF+DEX 0.25 mg/ml組為（0.680±0.015），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=116.637，P=0.000）；MF 組 PTEN 蛋白表達較NF組低，MF+DEX組PTEN蛋白表達較MF組高。見表2和圖3。

表1 各組Ⅰ型膠原、CTGF及PTEN mRNA表達的比較（±s）

表1 各組Ⅰ型膠原、CTGF及PTEN mRNA表達的比較（±s）

注：?與MF組比較，P＜0.05

組別 Ⅰ型膠原 CTGF PTEN NF 組 1.000±0.002?1.000±0.003?1.000±0.006?MF 組 2.957±0.023 3.365±0.009 0.416±0.024 MF+DEX 0.01 mg/ml組 2.718±0.054?2.952±0.035?0.448±0.009 MF+DEX 0.05 mg/ml組 2.453±0.053?2.542±0.047?0.537±0.053?MF+DEX 0.25 mg/ml組 2.182±0.036?2.007±0.045?0.620±0.029?F值 1 629.00 3 026.00 304.179P值 0.000 0.000 0.000

表2 各組Ⅰ型膠原和PTEN蛋白表達水平的比較 （±s）

表2 各組Ⅰ型膠原和PTEN蛋白表達水平的比較 （±s）

注：?與MF組比較，P＜0.05

組別 Ⅰ型膠原 PTEN NF組 1.000±0.021?1.000±0.044?MF 組 2.706±0.032 0.494±0.049 MF+DEX 0.01mg/ml組 2.643±0.043 0.535±0.038 MF+DEX 0.05mg/ml組 2.175±0.060?0.623±0.028?MF+DEX 0.25mg/ml組 1.847±0.028?0.680±0.015?F值 1 256.000 116.637P值 0.000 0.000

圖3 各組I型膠原和PTEN蛋白表達水平的比較

3 討論

在損傷修復(fù)的過程中，不可避免會形成不同程度的增生性疤痕，輕微的瘢痕可以通過組織塑形得以糾正，過多的瘢痕則難以通過簡單的組織塑形予以解決[11]。增生性瘢痕在膽道的形成伴隨著較高的BBS發(fā)病率。

成纖維細胞是重要的組織修復(fù)細胞，來源于胚胎時期的間充質(zhì)細胞。組織損傷后，成纖維細胞大量增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，一方面收縮創(chuàng)面，另一方面分泌細胞外基質(zhì)填補創(chuàng)面。正常情況下，一旦創(chuàng)面被完全表皮化，組織修復(fù)過程趨于停止，成纖維細胞及肌成纖維細胞等組織修復(fù)細胞就開始加速凋亡，細胞外基質(zhì)的分泌就減少；另一方面，一旦成纖維細胞及肌成纖維細胞等組織修復(fù)細胞持續(xù)過度增殖、細胞外基質(zhì)過度積聚，則形成增生性瘢痕[12]。膠原是構(gòu)成細胞外基質(zhì)的骨架，尤其是Ⅰ型膠原是細胞外基質(zhì)的重要組成部分。在膽管瘢痕修復(fù)及BBS形成過程中，成纖維細胞大量增殖，同時轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞收縮創(chuàng)面、分泌大量包括Ⅰ型膠原在內(nèi)的細胞外基質(zhì)填補創(chuàng)面，成纖維細胞和肌成纖維細胞是膽管瘢痕修復(fù)及BBS形成過程中的主要效應(yīng)細胞[3-4]。本研究結(jié)果提示，BBS模型膽管成纖維細胞中Ⅰ型膠原的表達較正常膽管成纖維細胞中的表達增高，提示大量Ⅰ型膠原的產(chǎn)生在BBS形成過程中可能發(fā)揮重要作用。

CTGF是一種可刺激成纖維細胞增殖和膠原沉積的生長因子，可由成纖維細胞、內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞合成分泌。CTGF可以直接作用于成纖維細胞等間充質(zhì)來源細胞，促進細胞增殖和合成包括Ⅰ型膠原在內(nèi)的細胞外基質(zhì)，還能作為轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的下游蛋白介導(dǎo)其促瘢痕形成[13]。而TGF-β1是目前已知的與瘢痕及膽管瘢痕形成最重要的細胞因子。研究表明，CTGF對TGF-β1誘導(dǎo)的肌成纖維細胞分化是必需的，但僅CTGF不足以引起肌成纖維細胞的分化和膠原基質(zhì)的收縮[14]。研究發(fā)現(xiàn)，CTGF在膽管瘢痕組織中的表達增高，并且可能是通過TGF-β1/Smads/CTGF通路在膽管瘢痕修復(fù)和BBS形成過程中發(fā)揮重要作用[2]。本研究結(jié)果提示，BBS模型膽管成纖維細胞中CTGF的表達較正常膽管成纖維細胞中上調(diào)，提示CTGF在BBS形成過程中可能發(fā)揮重要作用。

PTEN作為一種腫瘤抑制基因，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肝臟、腎臟、胃腸道及皮膚等全身多器官有表達。研究發(fā)現(xiàn)，通過對皮膚瘢痕成纖維細胞轉(zhuǎn)染PTEN基因后，成纖維細胞蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT）活性降低，細胞增殖、膠原合成受抑制，細胞凋亡增加，PTEN可能通過調(diào)控PTEN/AKT和PTEN/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKT 通路抑制皮膚瘢痕的形成[5，15]。調(diào)控瘢痕成纖維細胞中PTEN的表達是瘢痕治療的措施之一[15-17]。本研究結(jié)果提示，PTEN在膽管成纖維細胞中有表達，并且BBS模型膽管成纖維細胞中PTEN mRNA和蛋白表達較正常膽管成纖維細胞下調(diào)，提示PTEN的下調(diào)在BBS形成過程中可能發(fā)揮重要作用。

地塞米松是臨床常用的糖皮質(zhì)類激素，具有較強的抗炎、免疫抑制等作用。研究表明，地塞米松能抑制皮膚瘢痕成纖維細胞增殖，抑制瘢痕形成，而機制可能與其調(diào)控瘢痕成纖維細胞中TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等因素有關(guān)[7-9]。本實驗結(jié)果提示，地塞米松能下調(diào)BBS模型膽管成纖維細胞中Ⅰ型膠原、CTGF mRNA及蛋白的表達，同時上調(diào)該細胞中PTEN mRNA和蛋白表達，從而抑制該細胞的增殖，且濃度越高（DEX 0.05～0.25 mg/ml），抑制作用越強。提示DEX抑制BBS形成的作用機制之一可能與其對BBS模型膽管成纖維細胞中Ⅰ型膠原、CTGF及PTEN的調(diào)控有關(guān)。

總之，與正常膽管成纖維細胞比較，BBS膽管成纖維細胞增殖加快，而Ⅰ型膠原和CTGF的表達上調(diào)，PTEN的表達下調(diào)，DEX可能具有抑制BBS形成的作用，其機制之一可能與其對BBS膽管成纖維細胞中Ⅰ型膠原、CTGF及PTEN的調(diào)控有關(guān)。

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（童穎丹 編輯）

Inhibitory effect of Dexamethasone on rabbit bile duct scar fibroblastsin vitro*

Ke-yue Li,Cheng-xian Shi,Ke-li Tang,Zhen-hua Liu,Tao Li,Shuai-min Zhang,Xian-gang Xu
(Department of Hepatobiliary Surgery,Guizhou Provincial People's Hospital,Guiyang,Guizhou 550002,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Dexamethasone (DEX)on expressions of collagen I,connective tissue growth factor (CTGF),and phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10(PTEN)genes in rabbit bile duct scar model fibroblasts (MF)in vitro.MethodsRabbit bile duct scar model was established to culture MF.The MF were identified,and then treated by different concentrations of DEX(0,0.01,0.05 and 0.25 mg/ml).After respective incubation for 48 h,cell proliferation was investigated by CCK-8;relative mRNA expressions of collagen-I,CTGFandPTENwere assessed by qRT-PCR;relative protein expressions of collagen-I and PTEN were investigated by Western blot.ResultsDEX significantly inhibited cell proliferation,down-regulated both mRNA and protein expressions of collagen-I andCTGF,and significantly up-regulated both mRNA and protein expressions ofPTEN(P＜0.05)in the MF in a dosedependent manner.ConclusionsDEX may have preventive and therapeutic effect on bile duct scar and benign biliary stricture.Effect of DEX in anti-bile duct scar and benign biliary stricture may be partly through regulating collagen-I,CTGFandPTENexpressions in MF.

bile duct scar;fibroblast;inhibitory effect;in vitro;Dexamethasone

R575.7

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.17.002

1005-8982（2017）17-0007-06

2017-01-23

貴州省科技廳—貴州省人民醫(yī)院聯(lián)合基金[No：黔科合LH字（2016）7146]