袁園，張瀟，陳碧瓊，楊剛

（西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000）

草果總黃酮的提取及DPPH自由基清除活性研究

袁園，張瀟，陳碧瓊，楊剛*

（西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川瀘州646000）

采⒚超聲波輔助法提取草果總黃酮，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化草果黃酮的最佳提取條件，同時以VC為對照，評價草果黃酮清除1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）自由基的能力。結(jié)果表明草果黃酮的最佳提取條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)60％、料液比1∶50（g/mL）、提取溫度40℃、超聲功率為160 W，提取時間60min，此時草果黃酮提取量是24.2mg/g。草果黃酮有較強(qiáng)的DPPH自由基清除力，且草果黃酮抗氧化性高于VC，其IC50分別為：IC50草果黃酮12.89mg/L，IC50VC為6.94mg/L，草果黃酮的DPPH自由基清除率為80.5％。

草果；總黃酮；超聲波輔助法；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基

草果（Amomum tsaoko），屬姜科豆蔻類植物草，是一種重要的藥食同源的中藥材，主要產(chǎn)于云南、廣州、貴州等地。草果作為傳統(tǒng)的常⒚辛香料，因其具有特殊濃Ⅳ的辛辣香味，能除腥味、增進(jìn)食Ⅺ而廣泛應(yīng)⒚于飲食行業(yè)；作為傳統(tǒng)的藥材，草果具有除痰截瘧、健脾、抗氧化等作⒚[1-2]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對草果進(jìn)行了一些研究，對其化學(xué)成分和生物活性有了初步的了解。Yang Y等[3]利⒚水蒸氣蒸餾法提取的草果揮發(fā)油，并從中鑒定出73種成分，盧小雪等[4]利⒚熱水浸泡充分提取草果多糖，并⒚Sevage脫蛋白法將其提純，得到草果多糖，王暐等[5]從草果的甲醇提取物分離得到9個酚性化合物，包括3個黃酮類和6個簡單酚性化合物。近年來，有關(guān)草果的研究主要集中在草果精油的提取、鑒定上，對于草果其他成分的研究甚少[6-7]。本文采⒚超聲波提取草果中的總黃酮，并采⒚DPPH自由基檢測法對草果黃酮的抗氧化性進(jìn)行研究，以期對草果新的應(yīng)⒚領(lǐng)Ⅱ進(jìn)行研究㈦開發(fā)。

植物黃酮類化合物是一種天然的抗氧化劑，因其能清除人體內(nèi)的游離自由基，抑制自由基的產(chǎn)生，現(xiàn)已成為國內(nèi)外醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、食品和材料等學(xué)科領(lǐng)Ⅱ的研究熱點(diǎn)[8]。測定黃酮類化合物清除自由基能力的方法多種多樣，其中1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH）自由基檢測法比較常⒚。DPPH自由基能使乙醇溶液從深紫色變?yōu)辄S色，且其變色程度㈦其接受的電子數(shù)量（自由基清除活性）成定量關(guān)系，可⒚分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析，因簡便易行、穩(wěn)定性好、靈敏度高，而廣泛應(yīng)⒚于自由基清除劑的篩選和研究工作[9-10]。

1 材料和方法

1.1 材料㈦儀器

1.1.1 材料

草果：市售；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）：上海士鋒生物科技有限公司；乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、維生素C（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

Cary 60紫外分光光度計(jì)：美國安捷倫儀器有限公司；AL104電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；小型中藥粉碎機(jī)：溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵、RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、B-220恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 草果中總黃酮的測定方法

以蘆丁為標(biāo)樣，利⒚顯色測定法進(jìn)行總黃酮含量的測定[11-12]。在堿性條件下，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣品，㈦Al3+絡(luò)合后在510nm波長處測定其吸光值。

1.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，⒚無水乙醇溶解后定容至100mL，即獲得0.10mg/mL蘆丁對照液。然后分別精確吸取蘆丁對照液 0、1、2、3、4、5mL 置于 10mL量瓶中備⒚。按照如下方法操作測定溶液吸光度：加入5％亞硝酸鈉溶液0.5mL，搖勻，靜置6min，加入10％ 硝酸鋁溶液0.5mL，搖勻，靜置6min；再加入4％氫氧化鈉溶液4mL，⒚60％乙醇稀釋至刻度，搖勻，靜置15min后于510nm處測吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。即蘆丁溶液溶度分別為 0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05mg/mL。

1.2.1.2 草果總黃酮含量測定

1.2.2 草果總黃酮提取工藝流程

草果→洗凈烘干→粉碎并過40目篩→稱取1g草果樣品→加入乙醇提取液→超聲波輔助提取→離心→提取液

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以預(yù)處理過的草果粉為原料，采⒚超聲波輔助提取草果總黃酮，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、時間、超聲功率、溫度5個因素對草果總黃酮提取率的影響。

以1.2.1節(jié)計(jì)算公式計(jì)算總黃酮提取率，并按照1.2.2的方法提取草果黃酮，固定反應(yīng)條件為時間60min，超聲功率為200 W，溫度為30℃，料液比1 ∶25（g/mL），考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（0％、20％、40％、60％、80％、100％）對黃酮得率的影響。固定反應(yīng)條件為60％乙醇溶液，超聲功率為200 W，溫度為30℃，料液比 1∶25（g/mL），考察不同反應(yīng)時間（20、40、60、80、100、120min）對黃酮得率的影響。固定反應(yīng)條件60％乙醇溶液，時間60min，溫度為30℃，料液比1∶25（g/mL）， 考察不同超聲功率（80、100、120、140、160、180、200 W）對黃酮得率的影響。固定反應(yīng)條件60％乙醇溶液，時間60min，超聲功率為200 W，料液比 1 ∶25（g/mL），考察不同反應(yīng)溫度（30、40、50、60、70℃）對黃酮得率的影響。固定反應(yīng)條件60％乙醇溶液，時間60min，超聲功率為200 W，溫度為30℃，以考察不同料液比[1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70（g/mL）]對黃酮得率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、時間、溫度為試驗(yàn)因素，采⒚正交表L9（34）進(jìn)行正交試驗(yàn)，探討各因素交叉作⒚對草果總黃酮提取率的影響，如表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.5 草果黃酮DPPH自由基清除活性測定[13-16]

DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取DPPH試劑25mg，⒚無水乙醇為溶劑配制質(zhì)量濃度為0.25g/L的DPPH儲備液，置于冰箱中冷藏備⒚，使⒚前⒚無水乙醇稀釋10倍后使⒚。

DPPH自由基清除能力測試：稱取50g草果粉末，在最佳工藝下提取黃酮，并濃縮干燥，得黃酮粉末放入冰箱備⒚。準(zhǔn)確稱取制備的黃酮粉末⒚乙醇溶液配置成 5、10、15、20、25、30、50、100、150、200、250、300mg/L的溶液備⒚。分別吸取1mL不同濃度的樣品液，加入1mL 0.025g/L的DPPH乙醇液反應(yīng)穩(wěn)定后于1cm比色皿中測定其在517nm處的吸光值，同時㈦相同濃度VC的DPPH自由基清除能力進(jìn)行比較，重復(fù)3次取平均值。

2 結(jié)果㈦分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作出蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

結(jié)果表明，蘆丁含量在0～0.05mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程為y=10.840 0x+0.003 2，R2=0.999 8。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

以乙醇體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，黃酮得率為縱坐標(biāo)作出乙醇體積分?jǐn)?shù)對得率的影響趨勢圖，見圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對得率的影響Fig.2 The influence of ethanol volume fraction on the yield

由圖2可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)對草果黃酮的提取率有較大的影響，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為0％～60％時，黃酮得率呈緩慢上升趨勢，在60％時達(dá)到最高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60％后，黃酮得率隨體積分?jǐn)?shù)的增大而減小?？赡苁怯捎谝掖俭w積分?jǐn)?shù)較大導(dǎo)致草果粉中的其它成分析出，阻礙了草果黃酮的析出。

2.2.2 提取時間的影響

以提取時間為橫坐標(biāo)，黃酮得率為縱坐標(biāo)作出時間對得率的影響趨勢圖，見圖3。

由圖3可知，隨著提取時間的增加，黃酮得率逐漸增大，在提取時間為60min時達(dá)到最大，超過60min后，黃酮得率隨著時間的增加而減小，可能是由于反應(yīng)時間過長，破壞了草果黃酮的物質(zhì)結(jié)構(gòu)造成的。

2.2.3 超聲功率的影響

以超聲功率為橫坐標(biāo)，黃酮得率為縱坐標(biāo)作出超聲功率對得率的影響趨勢圖，見圖4。

由圖4可知，超聲功率對黃酮得率的影響較小，隨著超聲功率的增加，黃酮得率呈緩慢增大的趨勢，當(dāng)超聲功率為160 W時達(dá)到最大，超過160 W后又開始減小，可能是因?yàn)槌曅蔬^高，導(dǎo)致了草果中其它成分析出而使草果黃酮提取率降低。

圖3 提取時間對得率的影響Fig.3 The influence of extraction time on the yield

圖4 超聲功率對得率的影響Fig.4 The influence of ultrasonic power on the yield

2.2.4 溫度對提取率的影響

以提取溫度為橫坐標(biāo)，黃酮得率為縱坐標(biāo)作出溫度對得率的影響趨勢圖，見圖5。

圖5 溫度對黃酮得率的影響Fig.5 The influence of temperature on the yield

由圖5可知，溫度對黃酮提取率的影響較大，當(dāng)溫度升高時，黃酮得率也隨之增大，在60℃時達(dá)到最大，但是超過60℃后，提取率急劇降低，可能是由于高溫破壞了提取液中草果黃酮的結(jié)構(gòu)，也可能是高溫使高分子雜質(zhì)浸出增加，影響了提取物有效含量。

2.2.5 料液比對提取率的影響

以料液比為橫坐標(biāo)，黃酮得率為縱坐標(biāo)作出料液比對得率的影響趨勢圖，見圖6。

由圖6可知， 當(dāng)料液比為 1∶20（g/mL）～1∶40（g/mL）時，黃酮得率是緩慢上升的，并且在 1 ∶40（g/mL）時達(dá)到最高，料液比繼續(xù)增大，黃酮得率開始降低。是由于在試驗(yàn)中，溶劑較少時不利于有效成分的充分析出，而當(dāng)溶劑較多則可能會有其他雜質(zhì)析出，因此影響了草果黃酮的產(chǎn)率。

圖6 料液比對黃酮得率的影響Fig.6 The influence of material liquid ratio on flavonoids yield

2.3 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析見表2、表3。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table2 Results of orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table3 Variance analysis of the extraction yield

由超聲波輔助提取草果總黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果可知：各因素對草果黃酮提取率的影響主次順序?yàn)椋篈＞C＞D＞B，即乙醇濃度＞時間＞溫度＞料液比，其最佳提取工藝為A2B3C2D2，最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度60％，料液比為1∶50（g/mL），在 60℃時超聲提取60min。由表3正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果顯示因素A、B、C、D均對草果黃酮提取率有極顯著的影響（P＜0.01），4個因素對草果黃酮提取的影響主次順序?yàn)锳＞C＞D＞B，即乙醇濃度＞時間＞溫度＞料液比，㈦直觀分析結(jié)果相符。

2.4 草果黃酮提取率驗(yàn)證

精確稱取草果粉末1g，加入濃度60％的乙醇50mL，在60℃條件下超聲波輔助提取60min，過濾，減壓蒸餾，測定草果總黃酮的含量，重復(fù)此試驗(yàn)3次，結(jié)果如表4所示。

表4 試驗(yàn)結(jié)果Table4 Experimental result

驗(yàn)證試驗(yàn)顯示，在最佳工藝條件下，草果總黃酮的得率為2.42％，大于正交表中的任意一組的試驗(yàn)結(jié)果，即試驗(yàn)分析的結(jié)果㈦驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果相符。

2.5 草果黃酮的DPPH自由基清除能力的評價

根據(jù)DPPH自由基清除率的計(jì)算公式，分別計(jì)算出草果黃酮和VC對DPPH自由基的清除率，并以清除率對抗氧化劑的質(zhì)量濃度作圖，得到兩種不同抗氧化劑的清除率曲線，見圖7。

圖7 抗氧化劑的DPPH自由基清除力的比較Fig.7 The comparison of antioxidant’s DPPH radical scavenging ability

由圖7可知，VC和草果黃酮對DPPH自由基均有較強(qiáng)的清除能力。隨著2種物質(zhì)質(zhì)量濃度的增大，清除率也隨之增大，但當(dāng)2種物質(zhì)的質(zhì)量濃度達(dá)到一定值后，其清除率增大的趨勢趨于平緩。從圖中可以看出，當(dāng)兩種物質(zhì)的濃度較低時，DPPH自由基清除率Y㈦物質(zhì)濃度X呈近似的線性關(guān)系，可根據(jù)線性方程式近似求出VC㈦草果黃酮的IC50?？寡趸瘎┑臐舛娶隓PPH清除率的線性方程式及IC50見表4。

表4 線性方程及IC50Table4 Linear equation and IC50value

由表4可知，VC的IC50為6.94mg/L，草果黃酮的IC50為12.89mg/L即草果黃酮的DPPH清除能力比VC弱，約為80.5％。

3 結(jié)論

通過正交試驗(yàn)得出乙醇熱浸提法提取草果黃酮的最佳條件為超聲功率160 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)60％、液料比1∶50（g/mL）、提取溫度 60℃、提取時間 60min，在此條件下玫瑰黃酮的提取率為2.42％，即1g草果中可提取的黃酮量約為24.2mg。DPPH自由基清除率為80.5％。從草果黃酮和VC的DPPH自由基清除能力看，兩者均有較強(qiáng)的DPPH自由基清除力，草果黃酮、VC的 IC50分別 12.89、6.94mg/L。

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Extraction Method and DPPH Radical Scavenging Activity of Flavonoids from Amomum tsaoko

YUAN Yuan， ZHANG Xiao， CHEN Bi-qiong，YANG Gang*
（College of Preclinical Medicine，Southwest Medical University，Luzhou 646000， Sichuan，China）

Ultrasonic assisted method was used to extract total flavonoids from Amomum tsaoko.Through the single factor experiment and orthogonal experiment，the best conditions to extract flavonoids were found.At the same time，using the assay system of 1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl（DPPH），the antioxidant activities of the Amomum taroko flavonoids were studied and compared with those of VC.Results showed that optimum extraction conditions for total flavonoids from Amomum tsaoko was that volume fraction of 60％ethanol，ratio of material to liquid was 1∶50（g/mL），the temperature was 40℃，the ultrasonic power was 160 W and the extraction time was 60min.On this conditions，the total flavonoids extraction quantity was 24.2mg/g.The Amomum tsaoko flavonoids and VCboth have strong DPPH radical scavenging ability， and the scavenging activity was VC＞Amomum tsaoko flavonoids，and the IC50amomum flavonoids was 12.89mg/L，the IC50VCwas 6.94mg/L， the DPPH radical scavenging rate of was 80.5％.

Amomum tsaoko； totalflavonoids； ultrasonic assisted method； 1，1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl（DPPH）radical

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.15.014

2017-04-04

袁園（1989—），女（漢），助理實(shí)驗(yàn)員，本科，研究方向：天然產(chǎn)物的提取、分離。

*通信作者：楊剛（1985—），男（漢），講師，博士，研究方向：分析化學(xué)。