● 楊 軍 莫新民

壯骨止痛方對骨質(zhì)疏松大鼠Wnt/β-catenin信號通路、血清Sclerostin水平的影響※

● 楊 軍1*莫新民2

目的：探討壯骨止痛方對骨質(zhì)疏松雌鼠Wnt/β-catenin信號通路以及Sclerostin含量的影響。方法：將實(shí)驗(yàn)動物分為假手術(shù)組、模型組、壯骨止痛方高劑量治療組、壯骨止痛方低劑量治療組、雌二醇組5組，用酶聯(lián)免疫法測定大鼠血清中β-catenin、Sclerostin的水平。結(jié)果：模型組大鼠血清β-catenin降低、Sclerostin水平上升，經(jīng)壯骨止痛方藥物干預(yù)后，大鼠血清β-catenin水平明顯升高、Sclerostin水平明顯下降。結(jié)論：壯骨止痛方藥物可以提升Wnt/β-catenin信號通路的表達(dá)，降低血清Sclerostin的水平，達(dá)到預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的作用。

壯骨止痛方 β-鏈蛋白 骨硬化蛋白

骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis，OP)是以骨量減少，骨小梁變細(xì)、斷裂、數(shù)量減少，皮質(zhì)骨多孔、變薄等骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，以致骨的脆性增高及骨折危險性增高的一種全身性骨病[1]。隨著人口老齡化的迅速到來，骨質(zhì)疏松癥已成為嚴(yán)重的社會問題，其發(fā)病率已經(jīng)躍居世界各種常見病的第7位。壯骨止痛方是湖南省名中醫(yī)、吾之業(yè)師莫新民教授研發(fā)而成，為治療骨質(zhì)疏松癥的新藥，已經(jīng)獲得國家新藥證書[國藥證字Z20050125]，對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有良好療效[2-5]。本研究以經(jīng)典的骨質(zhì)疏松動物模型，用壯骨止痛方藥物進(jìn)行干預(yù)治療，分別檢測不同組別大鼠血清中的β-catenin、Sclerostin的比率，從而探討壯骨止痛方預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制，為再次臨床開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 壯骨止痛方藥物由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供，動物灌胃前制備成混懸液，戊酸雌二醇(生產(chǎn)企業(yè)：拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，藥品批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字J20130009)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠50只，SPF級，體重(200±20)g，雌鼠，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SCXK-(軍)2012-0007。動物飼養(yǎng)于清潔級飼養(yǎng)室，期間自由飲水、攝食，室溫20～25℃，濕度40%～70%，光照周期12h/12h，通風(fēng)良好。

1.3 試劑與儀器 青霉素(華北制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H13020655)；大鼠硬骨素(SOST)ELISA檢測試劑盒，大鼠β-鏈蛋白(β-catenin)ELISA檢測試劑盒均購自(E20160801A，蘇州爾卡文生物科技有限公司)。ELX808-IU酶標(biāo)儀(美國寶特)；BT-25S型電子天平(上海)，0.5-10μl、2-20μl、1-200μl，200-1000μl移液槍。

2 方法

2.1 動物造模 采用國內(nèi)外公認(rèn)的雌性大鼠去卵巢3個月造成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型[6]，取同批次250g左右的雌性SD大白鼠共40只，月齡10～12個月。按體重將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、壯骨止痛方高劑量治療組(13.2g/kg/d)、壯骨止痛方低劑量治療組(3.3g/kg/d)、雌二醇組(0.167mg/kg/d)共5組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余4組均切除雙側(cè)卵巢造成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型，術(shù)后在大鼠大腿肌肉內(nèi)側(cè)，注射青霉素，每只4萬u/d，防止術(shù)后感染。

2.2 給藥方法 假手術(shù)組和模型組每天灌胃以相應(yīng)體積冷開水，壯骨止痛方治療組、己烯雌酚組灌胃以相應(yīng)藥物，劑量按成人劑量及人鼠體表面積折算確定。各組均從第5天拆線后開始給藥，每天灌胃一次，連續(xù)12周。(實(shí)驗(yàn)過程中，可能由于術(shù)后處理不當(dāng)，模型組和低劑量組各有一只腸脹氣死亡)。

2.3 標(biāo)本采集 給藥12周，最后一次灌胃后2小時，腹腔注射2%的戊巴比妥鈉(0.2ml/100g體重)麻醉，腹部切口，從腹主動脈取血，人道主義處死大鼠，分離血清后，再轉(zhuǎn)放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆么治觥?/p>

2.4 指標(biāo)檢測 指標(biāo)檢測前，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)項目的測定。主要測定大鼠血清β-catenin，Sclerostin比率變化，方法為酶聯(lián)免疫分析。

3 結(jié)果

3.1 壯骨止痛方藥物對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清β-catenin的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中β-catenin含量明顯下降(P<0.01)，說明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠造模成功；與模型組比較，雌二醇陽性藥組大鼠血清中β-catenin含量明顯升高(P<0.01)，壯骨止痛方高、低劑量給藥組血清中β-catenin含量也顯著升高(P<0.05)，均有統(tǒng)計學(xué)差異，提示壯骨止痛方藥物對升高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清β-catenin含量有較好作用。見表1。

3.2 壯骨止痛方藥物對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清Sclerostion的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清中Sclerostin含量明顯升高(P<0.01)，有顯著差異；與模型組比較，壯骨止痛方高劑量給藥組和雌二醇陽性藥組大鼠血清中Sclerostin含量明顯下降(P<0.01)，壯骨止痛方低劑量給藥組血清中Sclerostin含量顯著下降(P<0.05)，提示壯骨止痛方藥物對降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清SOST含量有較好作用。見表2。

表1 各組大鼠血清中β-catenin水平的變化

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

表2 各組大鼠血清中Sclerostin水平的變化

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.05，##P<0.01;與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

4 討論

壯骨止痛方由補(bǔ)骨脂、淫羊藿、枸杞、黨參、白術(shù)、芍藥、骨碎補(bǔ)、丹參、甘草等九味藥物組成，方中補(bǔ)骨脂、淫羊藿補(bǔ)腎氣，溫腎陽，善治腰腳疼痛之疾，淫羊藿又能“壯腰膝，通經(jīng)絡(luò)”，為君藥；黨參、白術(shù)益氣健脾，補(bǔ)益后天，為肝腎提供生化之源；枸杞在《景岳全書·本草正》中云其“味重而純，故能補(bǔ)陰，陰中有陽，故能補(bǔ)氣……其功則明耳目，添精益髓，健骨強(qiáng)筋”，以上共為臣藥；芍藥、甘草組合，為芍藥甘草湯，《傷寒論》云其具有“腳攣急”，可以治療、緩解骨質(zhì)疏松疼痛癥狀，為佐藥；丹參，不僅能補(bǔ)肝血以強(qiáng)筋骨，尚能在滋膩之群中輕疏靈動，通調(diào)經(jīng)脈而活血祛瘀，兼有“調(diào)血”之職，為使藥?？傊?，壯骨止痛方既著重補(bǔ)腎氣、溫腎陽，又兼顧滋補(bǔ)肝腎陰精，以冀陽中求陰，陰中求陽，陰陽互生，加用丹參等通經(jīng)活絡(luò)之品，標(biāo)本兼顧，補(bǔ)而不滯，是該方具有補(bǔ)益肝腎、壯骨止痛之功，為治療骨質(zhì)疏松癥的良藥。

現(xiàn)代研究證實(shí)，Wnt信號通路有3條，其中之一經(jīng)典信號通路即Wnt/β-catenin信號對骨生物學(xué)顯得尤為重要[7-8]，其通過多種途徑增加骨量，包括更新干細(xì)胞、刺激前成骨細(xì)胞復(fù)制、誘導(dǎo)成骨細(xì)胞發(fā)生、抑制成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡等。Wnt/β-catenin信號通路作用的關(guān)鍵分子是血清β-鏈蛋白(β-catenin)，它和骨骼的發(fā)育聯(lián)系密切：Hu[9]等人報道了β-catenin通路在骨生成中的重要性，評估了β-catenin基因敲除的小鼠的骨發(fā)育；證明了β-catenin信號對成骨細(xì)胞完成分化過程是必要的。Hill等人[10]利用小鼠模型研究β-catenin在肢體和頭間質(zhì)中的作用，發(fā)現(xiàn)β-catenin在成骨細(xì)胞分化的早期也是必需的。本次實(shí)驗(yàn)表明，在模型組大鼠組中，因?yàn)槌晒?fù)制了雌鼠骨質(zhì)疏松的模型，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清β-catenin含量的明顯下降，但是通過壯骨止痛方藥物的干預(yù)，尤其是高劑量組的藥物，大鼠血清中β-catenin的含量明顯升高，與模型組比較P<0.05，有顯著的療效，說明壯骨止痛方藥物可以有效提升雌鼠骨質(zhì)疏松癥的血清β-catenin的含量，從而激活Wnt/β-catenin信號通路，從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的臨床作用。

骨硬化蛋白(Sclerostin)，又稱硬骨素，是近年來發(fā)現(xiàn)的一種由基因編碼、骨原性細(xì)胞分泌的具有抑制骨形成作用的糖蛋白，已有研究顯示，在很多疾病中骨硬化蛋白水平高于正常人，如固定導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松、血液透析、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性甲狀腺功能亢進(jìn)等。Huang QY等人研究表明，絕經(jīng)后女性骨硬化蛋白水平高于絕經(jīng)前女性[11]。因此提示骨硬化蛋白具有抑制骨形成的作用。本次實(shí)驗(yàn)表明，與假手術(shù)組相比較，模型組大鼠的Sclerostin的水平明顯升高，說明造模骨質(zhì)疏松大鼠的骨質(zhì)在骨硬化蛋白的作用下發(fā)生變化，但是經(jīng)過壯骨止痛方藥物(特別是高劑量組)干預(yù)后，Sclerostin的水平明顯下降，P<0.01，從而說明壯骨止痛方能夠降低Sclerostin水平的表達(dá)，達(dá)到預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的作用。

總之，壯骨止痛方可以抑制大鼠血清Sclerostin水平的表達(dá)、提高大鼠血清β-catenin水平的表達(dá)，激活Wnt/β-catenin信號通路，達(dá)到干預(yù)骨質(zhì)疏松癥的作用。

[1]劉忠厚.骨質(zhì)疏松學(xué)[M].北京：科技出版社，1998：142.

[2]楊 軍，張小莉，劉仕杰，等.齊墩果酸對去卵巢骨質(zhì)疏松癥雌鼠的療效及機(jī)理研究[J].時珍國醫(yī)國藥，2013，24(7)：1564-1566.

[3]劉仕杰，莫新民，李勁平，等.淫羊霍苷對去卵巢骨質(zhì)疏松癥雌鼠的療效及機(jī)理初步研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2012，18(3)：271-272.

[4]楊 軍，張小莉，莫新民.基于蛋白質(zhì)組學(xué)壯骨止痛方治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，36(12)：817-820.

[5]莫新民，曾 英，洪 凈.去卵巢后雌鼠骨質(zhì)疏松癥模型相關(guān)局部因子檢測[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2002，8(4)：37-38.

[6]李素萍.骨質(zhì)疏松動物模型的研究現(xiàn)狀[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(20)：3767-3770.

[7]Westendorf JJ，Kahler RA，Schroeder TM.Wnt signaling in osteoblasts and bonediseases[J].Gene，2004，341：19-39.

[8]Rawadi Q Roman-Roman S，Wnt signalling pathway：a new target for the Treatment of osteoporosis[J].Expert Opin Ther Targets，2005，(5)：1063-1077.

[9]HuH，Hilton MJ，Tu X，et al.Sequential roles of Hedgehog and Wnt signaling inosteoblast development[J].Development，2005，132(1)：49-60.

[10]Hill TP，Spater D，Taketo MM，etal.Canonical Wnt/beta-catenin signalingprevents osteoblasts from differentiating into chondrocytes[J].Dev Cell 2005，8(5)：727-38.

[11]Huang QY，GHY，Kung，AWC.The-9247 T/C Polymorphism in the SOST upstream regulator region that potentially affects GEBPalpha and FOXA1 binding is associated with osteoporosis[J].Bone，2009，45(2)：289-94.

陜西省教育廳自然專項計劃基金項目(No.15JK1212)

楊軍，男，醫(yī)學(xué)博士，副教授、副主任醫(yī)師。主要從事經(jīng)方治療老年病的研究。

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(712046)；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)(410007)