● 楊 軍 莫新民
壯骨止痛方對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路、血清Sclerostin水平的影響※
● 楊 軍1*莫新民2
目的:探討壯骨止痛方對(duì)骨質(zhì)疏松雌鼠Wnt/β-catenin信號(hào)通路以及Sclerostin含量的影響。方法:將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為假手術(shù)組、模型組、壯骨止痛方高劑量治療組、壯骨止痛方低劑量治療組、雌二醇組5組,用酶聯(lián)免疫法測(cè)定大鼠血清中β-catenin、Sclerostin的水平。結(jié)果:模型組大鼠血清β-catenin降低、Sclerostin水平上升,經(jīng)壯骨止痛方藥物干預(yù)后,大鼠血清β-catenin水平明顯升高、Sclerostin水平明顯下降。結(jié)論:壯骨止痛方藥物可以提升Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá),降低血清Sclerostin的水平,達(dá)到預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的作用。
壯骨止痛方 β-鏈蛋白 骨硬化蛋白
骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)是以骨量減少,骨小梁變細(xì)、斷裂、數(shù)量減少,皮質(zhì)骨多孔、變薄等骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征,以致骨的脆性增高及骨折危險(xiǎn)性增高的一種全身性骨病[1]。隨著人口老齡化的迅速到來,骨質(zhì)疏松癥已成為嚴(yán)重的社會(huì)問題,其發(fā)病率已經(jīng)躍居世界各種常見病的第7位。壯骨止痛方是湖南省名中醫(yī)、吾之業(yè)師莫新民教授研發(fā)而成,為治療骨質(zhì)疏松癥的新藥,已經(jīng)獲得國家新藥證書[國藥證字Z20050125],對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有良好療效[2-5]。本研究以經(jīng)典的骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型,用壯骨止痛方藥物進(jìn)行干預(yù)治療,分別檢測(cè)不同組別大鼠血清中的β-catenin、Sclerostin的比率,從而探討壯骨止痛方預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制,為再次臨床開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 壯骨止痛方藥物由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科提供,動(dòng)物灌胃前制備成混懸液,戊酸雌二醇(生產(chǎn)企業(yè):拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,藥品批準(zhǔn)文號(hào):國藥準(zhǔn)字J20130009)。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠50只,SPF級(jí),體重(200±20)g,雌鼠,購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):SCXK-(軍)2012-0007。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔級(jí)飼養(yǎng)室,期間自由飲水、攝食,室溫20~25℃,濕度40%~70%,光照周期12h/12h,通風(fēng)良好。
1.3 試劑與儀器 青霉素(華北制藥股份有限公司,國藥準(zhǔn)字H13020655);大鼠硬骨素(SOST)ELISA檢測(cè)試劑盒,大鼠β-鏈蛋白(β-catenin)ELISA檢測(cè)試劑盒均購自(E20160801A,蘇州爾卡文生物科技有限公司)。ELX808-IU酶標(biāo)儀(美國寶特);BT-25S型電子天平(上海),0.5-10μl、2-20μl、1-200μl,200-1000μl移液槍。
2.1 動(dòng)物造模 采用國內(nèi)外公認(rèn)的雌性大鼠去卵巢3個(gè)月造成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型[6],取同批次250g左右的雌性SD大白鼠共40只,月齡10~12個(gè)月。按體重將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、壯骨止痛方高劑量治療組(13.2g/kg/d)、壯骨止痛方低劑量治療組(3.3g/kg/d)、雌二醇組(0.167mg/kg/d)共5組,每組10只。除假手術(shù)組外,其余4組均切除雙側(cè)卵巢造成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥病理模型,術(shù)后在大鼠大腿肌肉內(nèi)側(cè),注射青霉素,每只4萬u/d,防止術(shù)后感染。
2.2 給藥方法 假手術(shù)組和模型組每天灌胃以相應(yīng)體積冷開水,壯骨止痛方治療組、己烯雌酚組灌胃以相應(yīng)藥物,劑量按成人劑量及人鼠體表面積折算確定。各組均從第5天拆線后開始給藥,每天灌胃一次,連續(xù)12周。(實(shí)驗(yàn)過程中,可能由于術(shù)后處理不當(dāng),模型組和低劑量組各有一只腸脹氣死亡)。
2.3 標(biāo)本采集 給藥12周,最后一次灌胃后2小時(shí),腹腔注射2%的戊巴比妥鈉(0.2ml/100g體重)麻醉,腹部切口,從腹主動(dòng)脈取血,人道主義處死大鼠,分離血清后,再轉(zhuǎn)放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆么治觥?/p>
2.4 指標(biāo)檢測(cè) 指標(biāo)檢測(cè)前,嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行相關(guān)項(xiàng)目的測(cè)定。主要測(cè)定大鼠血清β-catenin,Sclerostin比率變化,方法為酶聯(lián)免疫分析。
3.1 壯骨止痛方藥物對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清β-catenin的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中β-catenin含量明顯下降(P<0.01),說明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠造模成功;與模型組比較,雌二醇陽性藥組大鼠血清中β-catenin含量明顯升高(P<0.01),壯骨止痛方高、低劑量給藥組血清中β-catenin含量也顯著升高(P<0.05),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示壯骨止痛方藥物對(duì)升高絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清β-catenin含量有較好作用。見表1。
3.2 壯骨止痛方藥物對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清Sclerostion的影響 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠血清中Sclerostin含量明顯升高(P<0.01),有顯著差異;與模型組比較,壯骨止痛方高劑量給藥組和雌二醇陽性藥組大鼠血清中Sclerostin含量明顯下降(P<0.01),壯骨止痛方低劑量給藥組血清中Sclerostin含量顯著下降(P<0.05),提示壯骨止痛方藥物對(duì)降低絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠血清SOST含量有較好作用。見表2。
表1 各組大鼠血清中β-catenin水平的變化
注:與假手術(shù)組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。
表2 各組大鼠血清中Sclerostin水平的變化
注:與假手術(shù)組比較,#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。
壯骨止痛方由補(bǔ)骨脂、淫羊藿、枸杞、黨參、白術(shù)、芍藥、骨碎補(bǔ)、丹參、甘草等九味藥物組成,方中補(bǔ)骨脂、淫羊藿補(bǔ)腎氣,溫腎陽,善治腰腳疼痛之疾,淫羊藿又能“壯腰膝,通經(jīng)絡(luò)”,為君藥;黨參、白術(shù)益氣健脾,補(bǔ)益后天,為肝腎提供生化之源;枸杞在《景岳全書·本草正》中云其“味重而純,故能補(bǔ)陰,陰中有陽,故能補(bǔ)氣……其功則明耳目,添精益髓,健骨強(qiáng)筋”,以上共為臣藥;芍藥、甘草組合,為芍藥甘草湯,《傷寒論》云其具有“腳攣急”,可以治療、緩解骨質(zhì)疏松疼痛癥狀,為佐藥;丹參,不僅能補(bǔ)肝血以強(qiáng)筋骨,尚能在滋膩之群中輕疏靈動(dòng),通調(diào)經(jīng)脈而活血祛瘀,兼有“調(diào)血”之職,為使藥。總之,壯骨止痛方既著重補(bǔ)腎氣、溫腎陽,又兼顧滋補(bǔ)肝腎陰精,以冀陽中求陰,陰中求陽,陰陽互生,加用丹參等通經(jīng)活絡(luò)之品,標(biāo)本兼顧,補(bǔ)而不滯,是該方具有補(bǔ)益肝腎、壯骨止痛之功,為治療骨質(zhì)疏松癥的良藥。
現(xiàn)代研究證實(shí),Wnt信號(hào)通路有3條,其中之一經(jīng)典信號(hào)通路即Wnt/β-catenin信號(hào)對(duì)骨生物學(xué)顯得尤為重要[7-8],其通過多種途徑增加骨量,包括更新干細(xì)胞、刺激前成骨細(xì)胞復(fù)制、誘導(dǎo)成骨細(xì)胞發(fā)生、抑制成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞凋亡等。Wnt/β-catenin信號(hào)通路作用的關(guān)鍵分子是血清β-鏈蛋白(β-catenin),它和骨骼的發(fā)育聯(lián)系密切:Hu[9]等人報(bào)道了β-catenin通路在骨生成中的重要性,評(píng)估了β-catenin基因敲除的小鼠的骨發(fā)育;證明了β-catenin信號(hào)對(duì)成骨細(xì)胞完成分化過程是必要的。Hill等人[10]利用小鼠模型研究β-catenin在肢體和頭間質(zhì)中的作用,發(fā)現(xiàn)β-catenin在成骨細(xì)胞分化的早期也是必需的。本次實(shí)驗(yàn)表明,在模型組大鼠組中,因?yàn)槌晒?fù)制了雌鼠骨質(zhì)疏松的模型,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清β-catenin含量的明顯下降,但是通過壯骨止痛方藥物的干預(yù),尤其是高劑量組的藥物,大鼠血清中β-catenin的含量明顯升高,與模型組比較P<0.05,有顯著的療效,說明壯骨止痛方藥物可以有效提升雌鼠骨質(zhì)疏松癥的血清β-catenin的含量,從而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的臨床作用。
骨硬化蛋白(Sclerostin),又稱硬骨素,是近年來發(fā)現(xiàn)的一種由基因編碼、骨原性細(xì)胞分泌的具有抑制骨形成作用的糖蛋白,已有研究顯示,在很多疾病中骨硬化蛋白水平高于正常人,如固定導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松、血液透析、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、原發(fā)性甲狀腺功能亢進(jìn)等。Huang QY等人研究表明,絕經(jīng)后女性骨硬化蛋白水平高于絕經(jīng)前女性[11]。因此提示骨硬化蛋白具有抑制骨形成的作用。本次實(shí)驗(yàn)表明,與假手術(shù)組相比較,模型組大鼠的Sclerostin的水平明顯升高,說明造模骨質(zhì)疏松大鼠的骨質(zhì)在骨硬化蛋白的作用下發(fā)生變化,但是經(jīng)過壯骨止痛方藥物(特別是高劑量組)干預(yù)后,Sclerostin的水平明顯下降,P<0.01,從而說明壯骨止痛方能夠降低Sclerostin水平的表達(dá),達(dá)到預(yù)防治療骨質(zhì)疏松的作用。
總之,壯骨止痛方可以抑制大鼠血清Sclerostin水平的表達(dá)、提高大鼠血清β-catenin水平的表達(dá),激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,達(dá)到干預(yù)骨質(zhì)疏松癥的作用。
[1]劉忠厚.骨質(zhì)疏松學(xué)[M].北京:科技出版社,1998:142.
[2]楊 軍,張小莉,劉仕杰,等.齊墩果酸對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥雌鼠的療效及機(jī)理研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥,2013,24(7):1564-1566.
[3]劉仕杰,莫新民,李勁平,等.淫羊霍苷對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松癥雌鼠的療效及機(jī)理初步研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2012,18(3):271-272.
[4]楊 軍,張小莉,莫新民.基于蛋白質(zhì)組學(xué)壯骨止痛方治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)理研究[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,36(12):817-820.
[5]莫新民,曾 英,洪 凈.去卵巢后雌鼠骨質(zhì)疏松癥模型相關(guān)局部因子檢測(cè)[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2002,8(4):37-38.
[6]李素萍.骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型的研究現(xiàn)狀[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2011,15(20):3767-3770.
[7]Westendorf JJ,Kahler RA,Schroeder TM.Wnt signaling in osteoblasts and bonediseases[J].Gene,2004,341:19-39.
[8]Rawadi Q Roman-Roman S,Wnt signalling pathway:a new target for the Treatment of osteoporosis[J].Expert Opin Ther Targets,2005,(5):1063-1077.
[9]HuH,Hilton MJ,Tu X,et al.Sequential roles of Hedgehog and Wnt signaling inosteoblast development[J].Development,2005,132(1):49-60.
[10]Hill TP,Spater D,Taketo MM,etal.Canonical Wnt/beta-catenin signalingprevents osteoblasts from differentiating into chondrocytes[J].Dev Cell 2005,8(5):727-38.
[11]Huang QY,GHY,Kung,AWC.The-9247 T/C Polymorphism in the SOST upstream regulator region that potentially affects GEBPalpha and FOXA1 binding is associated with osteoporosis[J].Bone,2009,45(2):289-94.
陜西省教育廳自然專項(xiàng)計(jì)劃基金項(xiàng)目(No.15JK1212)
楊軍,男,醫(yī)學(xué)博士,副教授、副主任醫(yī)師。主要從事經(jīng)方治療老年病的研究。
1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)(712046);2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)(410007)