吳超穎+劉圣金+房方+王宇華+楊文國+馬瑜璐+吳德康

[摘要]小鼠采用華法林鈉造模，用斷尾法和玻片法分別測定出血時(shí)間和止血時(shí)間，大鼠連續(xù)15 d給藥測定血漿復(fù)鈣時(shí)間、血漿黏度、血小板黏附率、血小板聚集率等血液指標(biāo)。 與空白組比較，模型組能延長（P<005）出血時(shí)間，與模型組相比陽性維生素K、淋濾浸染型水煎液和沉積型水煎液能顯著（P<001）縮短出血時(shí)間，陽性維生素K能顯著（P<001）縮短凝血時(shí)間，淋濾浸染型水煎液、沉積型水煎液和沉積型粉末可（P<005）縮短凝血時(shí)間。與空白組比較，淋濾浸染型水煎液低劑量、中劑量和粉末中劑量，以及沉積型水煎液高劑量和藥渣低劑量都可降低血漿黏度（P<005），淋濾浸染型粉末高劑量和沉積型水煎液低劑量能顯著降低（P<005）血漿黏度。與空白組比較，禹余糧淋濾浸染型水煎液高劑量組能顯著降低（P<005）血小板黏附率，沉積型水煎液高能顯著增加（P<005）血小板黏附率，淋濾浸染型水煎液高劑量、藥渣高劑量和淋濾浸染型粉末低劑量、藥渣低劑量能降低（P<005）血小板聚集率，沉積型水煎液高劑量、粉末高劑量能增加（P<005）血小板聚集率。礦物成分分析利用偏光顯微鏡及X射線衍射（Xray diffraction，XRD）法。 2種礦物成因禹余糧礦物組成均含針鐵礦、石英、高嶺石，沉積型尚含伊利石、鈉長石。研究結(jié)果表明沉積型成因的禹余糧止血作用較好，可能與針鐵礦、伊利石含量較高有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]礦物藥； 禹余糧； 礦物成因； 止血； 凝血； 礦物成分

Mineral composition analysis and hemostatic

effect of limonitum with different mineral genesis

WU Chaoying， LIU Shengjin， FANG Fang， WANG Yuhua， YANG Wenguo， MA Yulu， WU Dekang*

（Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization， National and Local Collaborative

Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine， State Administration of

traditional Chinese medicine Key Laboratory of Chinese Medicine Resource Recycling Utilization， Jiangsu Key Laboratory for

Functional Substance of Chinese Medicine， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China）

[Abstract]Models were established in mice with warfarin sodium method， and their bleeding time and hemostasis time were measured by tail cutting method and slide method respectively Rats were administered for 15 consecutive days to measure their recalcification time， plasma viscosity， platelet adhesion rate， platelet aggregation rate and other blood indexes As compared with the blank group， the bleeding time was prolonged in model groupn（P<005） As compared with the model group， the results showed that the positive vitamin K， the leaching type water decoction and the sediment type decoction could significantly shorten the bleeding time （P<001）； positive vitamin K significantly （P<001） shortened clotting time， and the leaching type water decoction， the sediment type water decoction and the sediment type powder could also shorten the clotting time （P<005） As compared with blank group， low dose， medium dose of leaching type water decoction， medium dose of powder， high dose of sediment type decoction and low dose of drug residues could reduce plasma viscosity （P<005）， and high dose of leaching powder and low dose of water decoction could significantly reduce （P<001） plasma viscosity As compared with blank group， Limonitum leaching type decoction high dose group could significantly reduce the platelet adhesion rate （P<005）， while sediment type water decoction could significantly increase the platelet adhesion rate （P<005）； the high dose of leaching type water decoction， high dose of drug residues， low dose of leaching type powder and low dose of drug residues could decrease the platelet aggregation rate （P<005）， while high dose of leaching type water decoction and high dose of the powder could increase the platelet aggregation rate （P<005） Analysis of mineral compositions was conducted by polarized light microscopy and Xray diffraction （XRD） The results of the both methods showed that Limonitum mineral compositions contained goethite， quartz， and kaolinite， and sedimentary type also contained illite and albite Sediment type of Limonitum showed better hemostatic effect， which may be related to the high content of goethite and illite.

[Key words]mineral Chinese medicine； limonitum； mineral genesis； hemostasis； coagulation； mineral composition

禹余糧Limonitum又稱余糧石，為臨床常用礦物藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，為氫氧化物類礦物褐鐵礦，主含堿式氧化鐵[FeO（OH）]，具有澀腸止瀉，收斂止血的功效，主治久瀉久痢、大便出血及崩漏帶下等癥[1]。禹余糧現(xiàn)代研究較少，研究內(nèi)容主要涉及藥材鑒定、炮制及無機(jī)元素（含價(jià)態(tài)）分析等[28]，對(duì)禹余糧止血作用研究報(bào)道較少。課題組前期實(shí)驗(yàn)研究表明，生品禹糧石有較好的止血作用，煅品及醋品雖能延期小鼠凝血時(shí)間，但與對(duì)照組比較無顯著性差異，說明對(duì)小鼠凝血時(shí)間無明顯影響[9]。本文止血作用研究以禹余糧生品為主要研究對(duì)象。

藥用礦物資源主要由無機(jī)化合物組成，在自然地質(zhì)作用中形成，多數(shù)是一種或幾種礦物的集合體或聚集體，很少是單個(gè)的晶體。藥用礦物資源可在各種地質(zhì)作用中形成，而同一種礦物藥資源也可在多種地質(zhì)作用中形成。一般用成因類型來概括一個(gè)地質(zhì)作用的某一段歷程所形成的藥用礦物及其相應(yīng)的特點(diǎn)，礦物成因主要與巖漿活動(dòng)、變質(zhì)作用及表生作用有關(guān)[10]。

在自然界中，作為禹余糧藥用的褐鐵礦有多種成因類型，主要礦物成因與表生作用相關(guān)。一種成因?yàn)轱L(fēng)化型中的淋積亞型（淋濾浸染型），即原發(fā)型結(jié)核禹余糧，為含鐵的原生礦物風(fēng)化后，多沿異地的礦物或巖石的層理、裂隙、顆粒間隙等處淋濾浸染，呈現(xiàn)紫褐色脈狀充填于均質(zhì)混合巖裂隙中，常常保留有原來巖石或礦物的層理構(gòu)造、砂粒結(jié)構(gòu)及裂隙條帶特征。另一種成因是沉積（膠態(tài)）型，淋濾遷移的凝膠若進(jìn)行交代沉積，在富水介質(zhì)中，被溶解的物質(zhì)形成有不同電荷的膠粒，如Fe2O3，Al2O3等形成帶正電荷的膠粒，SiO2，MnO2等黏土礦物質(zhì)形成帶負(fù)電荷膠粒，不同電荷的膠粒聚集形成具有同心環(huán)狀構(gòu)造的卵形結(jié)核體，經(jīng)氧化、脫水等作用，形成了常見的禹余糧形態(tài)。以氣泡或水滴為核心凝聚加大者，為空心結(jié)核體，其內(nèi)部包裹了一定的水分，天長日久，即形成了褐鐵礦粉末，多具膠態(tài)結(jié)核，同心圓狀，腎狀，鐘乳狀結(jié)構(gòu)及殼層、塊狀構(gòu)造。由于褐鐵礦本身成分的復(fù)雜性和鐵化合物的不完全轉(zhuǎn)化，在凝膠物質(zhì)沉淀過程中，就可能形成層疊狀結(jié)構(gòu)。此外，禹余糧尚有與巖漿活動(dòng)有關(guān)的熱液蝕變型等礦物成因[1112]。

不同礦物成因的禹余糧，其成分、形態(tài)、結(jié)構(gòu)構(gòu)造、藥理作用及藥用價(jià)值也不盡相同。本文對(duì)目前市場主要流通的淋濾浸染型、沉積型2種不同礦物成因的禹余糧進(jìn)行成分組成及止血作用差異性研究，為禹余糧優(yōu)質(zhì)礦產(chǎn)資源的篩選及其進(jìn)一步開發(fā)利用、深入研究奠定基礎(chǔ)。

1材料

11儀器

日本理學(xué)D/MaxRa型X射線衍射儀；B100V7型血液流變儀（重慶開發(fā)有限公司）；LBYNT型血小板聚集儀（北京普利生科技有限公司）；PUN2048B普朗醫(yī)療凝血儀；恒溫培養(yǎng)箱Binder F115；酶標(biāo)儀TECANF50。

12試劑與藥品

華法林鈉片（批號(hào)18151204E，上海信誼九福藥業(yè)有限公司）；維生素K注射液（215010611，山東益康藥業(yè)股份有限公司）；羧甲基纖維素鈉（CMCNa）、水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

沉積型禹余糧樣品采自河南南陽市欒川縣伏牛山一帶（批號(hào)20160507），淋濾浸染型禹余糧樣品購自河南禹州市銀泉藥材站（批號(hào)20160510），產(chǎn)地為河南禹州，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)吳德康教授鑒定均為礦物藥禹余糧，礦物成因由南京大學(xué)地球科學(xué)與工程學(xué)院胡文瑄教授鑒定，樣品保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定學(xué)教研室。

13實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠雌、雄各半，體質(zhì)量18～22 g，SPF級(jí)SD大鼠雌、雄各半，體質(zhì)量180～220 g，均購買于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)SCXK（滬）20130006。

2方法

21實(shí)驗(yàn)用藥的制備

211禹余糧水煎液制備取禹余糧顆粒，第1次加10倍量水，加熱，煮沸1 h后紗布過濾，所得藥液即為頭煎藥液。將過濾下來的藥渣加10倍量水繼續(xù)加熱，煮沸1 h后紗布過濾，所得藥液為二煎藥液。將2次煎藥液合，并濃縮至每40 mL藥液含5 g生藥，即為水煎液低劑量，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行濃縮，使得每20 mL藥液含5 g生藥，即為水煎液中劑量，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行濃縮，使得每10 mL藥液含5 g生藥，即為水煎液高劑量。

212禹余糧粉取禹余糧藥材，置瑪瑙研缽中研細(xì)，過100目篩，用05% CMCNa調(diào)勻，按水煎液的低、中、高劑量分別配制。

213禹余糧渣將水煎煮后的藥渣按禹余糧粉制備方法制備。

214華法林鈉溶液取稱華法林納5 mg，用05% CMCNa溶解，定容至100 mL。

215維生素K生理鹽水溶液取7 mg維生素注射液，用05% CMCNa溶解定容至30 mL，待用。

22動(dòng)物分組及給藥

221小鼠華法林鈉出血模型昆明種小鼠90只，雌雄各半，根據(jù)體重隨機(jī)分為9組，每組10只，分別為華法林模型組、華法林模型沉積型水煎液用藥組、華法林模型沉積型粉末用藥組、華法林模型沉積型藥渣用藥組、華法林模型淋濾浸染型水煎液用藥組、華法林模型淋濾浸染型粉末用藥組、華法林模型淋濾浸染型藥渣用藥組、華法林陽性藥組、空白組，用藥組統(tǒng)一用高劑量給藥。

222大鼠相關(guān)血液指標(biāo)的測定SD清潔級(jí)大鼠190只，雌雄各半，根據(jù)體重隨機(jī)分為19組，每組10只，分為禹余糧2種礦物成因的樣品水煎液、粉末、藥渣分別按人臨床劑量的5，10，20倍分別配制總共分成18組加1組空白對(duì)照。每天給藥1次，連續(xù)灌胃15 d，空白組給05% CMCNa生理鹽水。

23小鼠華法林鈉出血模型的制備

參照文獻(xiàn)復(fù)制華法林鈉出血模型[13]，華法林模型用藥組，禹余糧、華法林分別灌胃7 d，空白對(duì)照組給等量05% CMCNa溶液，華法林模型組、華法林模型陽性組口服灌胃給藥華法林。第7天，華法林模型陽性組在口服灌胃給藥華法林后，給予尾靜脈注射維生素K注射液，空白組給予等量05% CMCNa溶液。末次給藥后1 h后分別用斷尾法、玻片法測各組出血時(shí)間和凝血時(shí)間。

24小鼠出血時(shí)間和凝血時(shí)間測定

用手術(shù)刀距小鼠尾尖1 cm處剪斷，待血液自行溢出時(shí)開始計(jì)時(shí)，每隔10 s用濾紙吸附血滴1次，直至濾紙吸時(shí)無血跡，所經(jīng)時(shí)間作為出血時(shí)間。

用毛細(xì)管扎破小鼠眼眶血液滴到載玻片上開始計(jì)時(shí)，用毛細(xì)管挑絲，有血絲出現(xiàn)即記為凝血時(shí)間。

25大鼠血液指標(biāo)測定

第15天，各組正常給藥1 h后，各組大鼠用10%水合氯醛麻醉，用EDTA抗凝管腹主動(dòng)脈取血，取1 mL全血分裝分別測定血漿復(fù)鈣時(shí)間，血小板黏附率，血小板聚集率，血漿黏度。

26礦物成分分析

261偏光顯微鏡分析選擇可供切割的塊狀禹余糧樣品，先用切片機(jī)切割出一平面，用磨片機(jī)磨成光面，用偏光顯微鏡進(jìn)行單偏光和正交偏光分析，結(jié)果見圖1，2。

262X射線衍射分析將巖樣破碎后瑪瑙研缽研磨至200目。測試條件為銅（Cu）靶，電壓 40 kV，電流40 mA，步寬002°，掃描范圍3～60°（2θ）。黏土自然風(fēng)干樣品測試步寬 001°，掃描范圍3～36°（2θ）。利用Jade 60軟件識(shí)別并計(jì)算各礦物衍射峰高度和面積。礦物組成的鑒定以及相對(duì)含量計(jì)算按照Cook等的方法進(jìn)行[14]。

27統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 190統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行雙樣本t檢驗(yàn)及方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。

3結(jié)果

31小鼠華法林鈉出血模型出血時(shí)間和凝血時(shí)間

與空白組比，模型組能延長（P<005）出血時(shí)間，與模型組相比，陽性維生素K、淋濾浸染型水煎液和沉積型水煎液能顯著（P<001）縮短出血時(shí)間，陽性維生素K能顯著（P<001）縮短凝血時(shí)間，淋濾浸染型水煎液、沉積型水煎液和沉積型粉末可（P<005）縮短凝血時(shí)間，結(jié)果見表1。

32大鼠血液指標(biāo)

與空白組比較，淋濾浸染型水煎液低劑量、中劑量和粉末中劑量，以及沉積型水煎液高劑量和藥渣

與空白組比較，禹余糧淋濾浸染型水煎液高劑量組能顯著降低（P<005）血小板黏附率，沉積型水煎液高能顯著增加（P<005）血小板黏附率，淋濾浸染型水煎液高劑量、藥渣高劑量和淋濾浸染型粉末低劑量、藥渣低劑量能降低（P<005）血小板聚集率，沉積型水煎液高劑量、粉末高劑量能增加（P<005）血小板聚集率，結(jié)果見表3。

33礦物成分分析

331偏光顯微鏡分析通過單偏光及正交偏光顯微分析，淋濾浸染型可見石英、極少量絹云母和褐鐵礦等礦物組成；沉積型可見石英、褐鐵礦和少量鈉長石等礦物組成，見圖1。

332X射線衍射分析淋濾浸染型主要礦物成分為高嶺石、石英、針鐵礦、白云母，沉積型主要礦物成分為石英、伊利石、鈉長石、針鐵礦、高嶺石。其中禹余糧主要成分堿式氧化鐵[FeO（OH）]針鐵礦含量沉積型比淋濾浸染型高出許多。礦物組成及組成見圖2，表4。

A 淋濾浸染型，單偏光；B 淋濾浸染型，正交偏光；C 沉積型，單偏光；D 沉積型，正交偏光。

4討論

血漿黏度增大會(huì)增加機(jī)體形成血栓的趨勢，本實(shí)驗(yàn)2種不同成因禹余糧均能不同程度的降低血漿黏度，說明不會(huì)造成淤血傾向。血漿復(fù)鈣時(shí)間未有顯著性差異，均在臨床正常值以內(nèi)，課題組前期對(duì)凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）、纖維蛋白原（FIB）凝血4項(xiàng)測定的結(jié)果表明，兩者也沒有顯著性差異，說明禹余糧的止血機(jī)制不是作用與內(nèi)原性、外源性凝血系統(tǒng)。

血小板黏附率和血小板聚集率的結(jié)果基本一致，均是沉積型水煎液高劑量組增加，淋濾浸染型水煎液降低，說明沉積型成因的止血效果較好，可能是禹余糧作用于血小板相關(guān)功能。沉積型禹余糧的針鐵礦含量比淋濾浸染型含量高近4倍，尚有伊利石和鈉長石組成，其中伊利石與蛋白質(zhì)可以形成復(fù)合物[15]，在體內(nèi)中性、堿性環(huán)境下，蛋白石釋放出來，用來治療疾病，可能是增加止血效果的原因之一。

出血時(shí)間和凝血時(shí)間是檢測止血藥效最直觀的指標(biāo)，研究表明，與血液指標(biāo)的測定結(jié)果基本相符，2種不同礦物成因禹余糧樣品均以水煎液的效果最好。綜合分析，禹余糧的止血作用以沉積型為佳，尚需通過血清藥物化學(xué)等研究方法闡明禹余糧臨床發(fā)揮止血作用的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ)，包括所含金屬離子的種類、價(jià)態(tài)等對(duì)止血作用的干預(yù)作用，并深入探討其作用機(jī)制。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國藥典一部[S] 2015：261

[2]劉圣金，楊歡，徐春祥，等 TGDSC分析法在礦物藥禹余糧質(zhì)量控制中的應(yīng)用[J]中藥材，2016，39（1）：121

[3]劉圣金，楊歡，林瑞超，等 礦物藥禹余糧微波消解/ICPAES無機(jī)元素分析及綜合評(píng)價(jià)[J]中國現(xiàn)代中藥，2015，17（9）：899

[4]王明芳，孟祥龍，何美菁，等.赤石脂和禹余糧作為灶心土替代品的分析[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（6）：23.

[5]LIU Sheng jin，YANG Huan，WU De kang，et alApplication of fourier transform infrared spectra （FTIR） fingerprint in the quality control of mineral Chinese medicine Limonitum[J]Spectrosc Spect Anal，2015，35（4）：909

[6]楊歡，劉圣金，吳德康，等礦物藥禹余糧 X 射線衍射 Fourier 指紋圖譜研究[J]藥物分析雜志，2014，34（12）：2171

[7]Liu Shengjin， Yang Huan， Wu Dekang，et alAnalysis of inorganic elements in mineral Chinese medicine Limonitum before and after processing[J]Lat Am J Pharm，2014，33（8）：1245

[8]吳德康，王春根，任仁安 九種禹糧石的鑒定[J]南京中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1991，7（4）：228

[9]吳德康，陸平成，王春根，等 禹糧石不同炮制品的抑菌、止血實(shí)驗(yàn)研究[J]中藥材，1991，14（4）：27

[10]李鴻超 中國礦物藥[M] 北京：地質(zhì)出版社，1988：173

[11]胡魁 禹余糧的醫(yī)藥地質(zhì)學(xué)研究[J] 中國礦業(yè)，2004，13（12）：1

[12]曹成 禹糧石的礦物學(xué)研究[J] 礦物學(xué)報(bào)，1983（2）：132

[13]陳泣 大薊炭止血藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及止血增效作用機(jī)制研究[D]北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2014

[14]Peltonen C，Marcussen ，Bjrlykke K，et al Clay mineral diagenesis and quartz cementation in mudstones： the effects of smectite to illite reaction on rock properties[J] Marine Petro Geol，2009，26（6）：887

[15]Suresh R， Borkar S N， Sawant V A， et al Nanoclay drugdelivery system[J]Int J Pharm Sci Nanotechnol， 2010，3（2）：901

[責(zé)任編輯孔晶晶]