陳 志
(福建省淡水水產(chǎn)研究所,福建 福州 350002)
溫度、鹽度和pH對(duì)雙線(xiàn)紫蛤幼貝生長(zhǎng)率的聯(lián)合效應(yīng)
陳 志
(福建省淡水水產(chǎn)研究所,福建 福州 350002)
為探究雙線(xiàn)紫蛤(Sanguinolariadiphos)幼貝最適生長(zhǎng)條件,采用響應(yīng)面法研究了溫度(24℃、27℃、30℃)、鹽度(20、25、30)和pH(7.3±0.03,8.3±0.03,9.3±0.03)對(duì)雙線(xiàn)紫蛤幼貝日生長(zhǎng)率的聯(lián)合效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1)溫度對(duì)幼貝生長(zhǎng)率影響極顯著(P<0.01),3種生態(tài)因子對(duì)幼貝生長(zhǎng)率影響程度大小順序是:溫度>鹽度>pH;2)通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),得出雙線(xiàn)紫蛤幼貝最適生長(zhǎng)環(huán)境組合是溫度為26.43℃、鹽度為25、pH為8.3,理論最佳日生長(zhǎng)率為2.90%。經(jīng)模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后,得到的日生長(zhǎng)率為2.76%。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果較接近,響應(yīng)面分析法可靠。研究結(jié)果為雙線(xiàn)紫蛤池塘大面積養(yǎng)殖的推廣提供科學(xué)參考依據(jù)。
響應(yīng)面分析法;雙線(xiàn)紫蛤幼貝;日生長(zhǎng)率;溫度;鹽度;pH
雙線(xiàn)紫蛤(Sanguinolariadiphos)屬軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、簾蛤目(Veneroida)、紫云蛤科(Psammobiidae)、紫蛤?qū)?Sanguinolaria),廣泛分布于印度至西太平洋海域,是一種極具養(yǎng)殖前景的海洋雙殼貝類(lèi)。近年來(lái),生態(tài)環(huán)境的惡化致使雙線(xiàn)紫蛤資源分布范圍縮小,加上受經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使的漁民濫采亂捕更造成資源量銳減,因此雙線(xiàn)紫蛤被列入福建省水生野生重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物名錄。
近年來(lái),國(guó)內(nèi)諸多學(xué)者均開(kāi)展了雙線(xiàn)紫蛤的研究工作,主要多集中于形態(tài)學(xué)[1]、發(fā)育生物學(xué)[2]和人工育苗技術(shù)[3]等方面。由于育苗技術(shù)突破時(shí)間晚、人工育苗量少等原因,有關(guān)人工增養(yǎng)殖方面的研究少見(jiàn)報(bào)道。溫度、鹽度和pH是重要的海洋環(huán)境因子,其對(duì)貝類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要,前期進(jìn)行單因子梯度實(shí)驗(yàn)研究,發(fā)現(xiàn)單因子實(shí)驗(yàn)存在無(wú)法考慮各因子之間的交互作用、不能建立有效的模型進(jìn)行連續(xù)預(yù)測(cè)等缺陷[4],而多因子聯(lián)合效應(yīng)的研究則可以有效彌補(bǔ)以上缺陷,實(shí)驗(yàn)環(huán)境更接近實(shí)際養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境,為生產(chǎn)提供準(zhǔn)確預(yù)測(cè)。響應(yīng)面分析法具有次數(shù)少、周期短、所得回歸方程精度高等優(yōu)點(diǎn)[5],本研究利用響應(yīng)面分析法,研究溫度、鹽度和pH對(duì)雙線(xiàn)紫蛤幼貝生長(zhǎng)的聯(lián)合效應(yīng),構(gòu)建雙線(xiàn)紫蛤幼貝生長(zhǎng)模型并優(yōu)化其生長(zhǎng)條件,以期更好地促進(jìn)雙線(xiàn)紫蛤在沿海適宜地區(qū)進(jìn)行中試,健全雙線(xiàn)紫蛤大規(guī)模人工養(yǎng)殖理論數(shù)據(jù)。
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
采用幼貝均來(lái)自福建省淡水水產(chǎn)研究所海水育苗場(chǎng),2016年6月人工繁育成功,選取殼長(zhǎng)相近的幼貝用于實(shí)驗(yàn),隨機(jī)抽取10粒幼貝測(cè)量殼長(zhǎng),測(cè)得平均殼長(zhǎng)為(14.92±0.21)mm。響應(yīng)面驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)選取同批次人工育苗幼貝,規(guī)格與響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)基本相同。
1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
1.2.1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)
在掌握單因子實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,研究溫度(A)、鹽度(B)和pH(C)三者的聯(lián)合效應(yīng),利用Box-Benhnken的中心實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行3因素3水平(表1)組合實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因子點(diǎn)數(shù)12個(gè),在中心點(diǎn)重復(fù)5次,共17組(表2),探索雙線(xiàn)紫蛤幼貝生長(zhǎng)的最優(yōu)條件。實(shí)驗(yàn)在塑料箱(長(zhǎng)40 cm×寬20 cm×高30 cm)中進(jìn)行,底部鋪設(shè)10 cm厚的細(xì)沙,各實(shí)驗(yàn)組投放幼貝100粒,溫度梯度分別用海水冷卻機(jī)、恒溫棒加以控制[6],鹽度梯度設(shè)置可通過(guò)在天然海水中添加曝氣淡水,不同pH梯度通過(guò)1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)[7],實(shí)驗(yàn)為期20 d,早晚各投喂蝦池混合藻類(lèi)一次,投餌藻液量相同,不同鹽度實(shí)驗(yàn)組在投餌前將藻液鹽度調(diào)至相同。響應(yīng)面分析方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表1 響應(yīng)面3因素3水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
表2 設(shè)計(jì)方案與實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.2.2 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
以響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果為實(shí)驗(yàn)條件,設(shè)置3個(gè)平行,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時(shí)間與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)相同,為期20 d,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算處理與響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)相同。
1.3 計(jì)算公式與數(shù)據(jù)分析
日生長(zhǎng)率(Rg):Rg(% )= [(Lt/L0)1/t- 1]×100%
公式中,Rg表示日生長(zhǎng)率(%);Lt表示終末平均殼長(zhǎng)(mm);L0為初始平均殼長(zhǎng)(mm);t代表實(shí)驗(yàn)天數(shù)(d),幼貝殼長(zhǎng)均采用游標(biāo)卡尺(精度0.1 mm)測(cè)量。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用軟件Excel進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算,采用軟件SPSS19.0進(jìn)行單因素方差A(yù)NOVA分析,獨(dú)立樣本均數(shù)進(jìn)行T檢驗(yàn),其中P<0.05表示顯著差異,P<0.01表示差異極顯著。采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合、顯著性檢測(cè)、方差分析和響應(yīng)面分析[8]。
2.1 回歸方程系數(shù)的方差分析和顯著性檢驗(yàn)
利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的各組合試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多元回歸分析(表3)。
表3 二次多項(xiàng)式模型方差分析和多元回歸分析
通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件的響應(yīng)面回歸過(guò)程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,建立二次響應(yīng)面回歸模型,求出最優(yōu)響應(yīng)因子水平。擬合得到的二次響應(yīng)面回歸方程如下:
Y=2.90-0.085A-0.052B+0.012C-0.075AB+0.065AC+0.000BC-0.46A2-0.17B2-0.20C2
2.2 雙線(xiàn)紫蛤生長(zhǎng)率響應(yīng)曲面分析
隨溫度、鹽度和pH的改變,雙線(xiàn)紫蛤幼貝日生長(zhǎng)率變化趨勢(shì)可以通過(guò)二維等高線(xiàn)圖和三維響應(yīng)面直觀顯示。從圖1可以看出,響應(yīng)面分析圖呈現(xiàn)出了山丘形曲面,等高線(xiàn)圖呈橢圓形,溫度和鹽度交互顯著,在保持pH一定時(shí),隨著溫度和鹽度的不斷升高,日生長(zhǎng)率呈現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì),等高線(xiàn)圖顯示日生長(zhǎng)率有極大值的存在。從圖2可知,響應(yīng)面分析圖也呈現(xiàn)山丘形曲面,等高線(xiàn)呈橢圓形,溫度和pH交互作用顯著,保持鹽度一定時(shí),隨著溫度和pH的升高,幼貝生長(zhǎng)率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì),等高線(xiàn)圖顯示幼貝生長(zhǎng)率有極大值的存在。從圖3可知,響應(yīng)曲面圖略呈現(xiàn)山丘形,鹽度和pH變化幅度明顯縮小,鹽度和pH交互作用不顯著,保持溫度一定時(shí),鹽度和pH的持續(xù)升高使日生長(zhǎng)率表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì),等高線(xiàn)圖顯示幼貝生長(zhǎng)率有極大值的存在。
根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件模擬得出的等高線(xiàn)圖和響應(yīng)曲面圖進(jìn)行綜合分析,經(jīng)過(guò)計(jì)算,ABC三個(gè)編碼值對(duì)應(yīng)的的實(shí)際值溫度為26.43℃,鹽度為25,pH為8.3,理論最佳生長(zhǎng)率為2.90%,滿(mǎn)意度為100%。
2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行,實(shí)驗(yàn)條件均按照響應(yīng)面優(yōu)化得出的最適生態(tài)環(huán)境條件進(jìn)行,驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)開(kāi)展和響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)時(shí)間相同,均為20 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下(表4)。
表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證
注:同列中不同字母代表差異顯著(P<0.05),否則差異不顯著(P>0.05)。
Notes:Values in the same line without a common superscript were significant difference,in contrast it was not.
比較驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與響應(yīng)面預(yù)測(cè)結(jié)果,由表5可知,驗(yàn)證結(jié)果和預(yù)測(cè)結(jié)果僅相差0.14%,數(shù)值較為接近,響應(yīng)面分析方法可靠。
表5 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果與響應(yīng)面預(yù)測(cè)結(jié)果的對(duì)比
溫度、鹽度和pH等環(huán)境因子對(duì)貝類(lèi)的存活和生長(zhǎng)有著重要的影響,尤其在貝類(lèi)胚胎發(fā)育、變態(tài)附著過(guò)程中至關(guān)重要,不同貝類(lèi)對(duì)溫度、鹽度和pH的適應(yīng)范圍有所差異,國(guó)內(nèi)學(xué)者研究也較為深入,如對(duì)西施舌(Coelomactraantiquata)[9]、尖刀蟶(Cultellesscalprum)[10]、皺紋盤(pán)鮑(Haliotisdiscushannai)[11]和菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[12]等研究,但往往多集中于單因子實(shí)驗(yàn)分析。作者對(duì)雙線(xiàn)紫蛤幼貝存活及生長(zhǎng)進(jìn)行了單因子實(shí)驗(yàn)研究,得出雙線(xiàn)紫蛤最適生長(zhǎng)鹽度范圍為20~25,最適養(yǎng)殖密度范圍為500~1 000 ind/m2,最佳養(yǎng)殖底質(zhì)為細(xì)沙底質(zhì)[13]。林祥志等[14]研究認(rèn)為雙線(xiàn)紫蛤稚貝在鹽度為15~25時(shí)成活率最高,鹽度為20~25時(shí)特定生長(zhǎng)率最高。溫度為20℃時(shí)實(shí)驗(yàn)組成活率最高,30℃時(shí)實(shí)驗(yàn)組生長(zhǎng)率最高。溫度和鹽度對(duì)特定生長(zhǎng)率和成活率均存在明顯的交互作用影響。雙線(xiàn)紫蛤?qū)俾駰拓愵?lèi),一般生活在潮間帶至淺海細(xì)沙或泥沙質(zhì)海底中,對(duì)溫度和鹽度的適應(yīng)范圍較廣。鹽度的變化影響貝類(lèi)滲透壓的穩(wěn)定性,在適宜鹽度范圍內(nèi),貝類(lèi)可通過(guò)自身調(diào)節(jié)保持滲透壓的穩(wěn)態(tài)。較成貝而言,幼貝自身調(diào)節(jié)能力相對(duì)較差,適鹽范圍較成貝也相對(duì)縮小。溫度和pH主要影響消化酶活性進(jìn)而影響個(gè)體新陳代謝和生長(zhǎng)發(fā)育,酶類(lèi)活性存在最適溫度和最適pH,不同種類(lèi)的酶最適溫度和最適pH有所差異,在最適條件下,貝類(lèi)消化道內(nèi)的胃蛋白酶、胰蛋白酶等活性最強(qiáng),有助于腸道內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收,滿(mǎn)足貝類(lèi)生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求[15];過(guò)高或過(guò)低的溫度和pH均會(huì)導(dǎo)致酶活力下降,降低幼貝攝食和消化能力。在本實(shí)驗(yàn)中,為了更加貼近養(yǎng)殖實(shí)際環(huán)境,采用凡納濱對(duì)蝦高位水泥池的高濃度混合藻液作為餌料,浮游植物種類(lèi)較多,藻類(lèi)光合作用可能導(dǎo)致養(yǎng)殖水體pH有一定程度的偏高[16]。
本研究采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),利用響應(yīng)面法分別建立了雙線(xiàn)紫蛤日生長(zhǎng)率對(duì)溫度、鹽度和pH的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)回歸模型,不但找到了適宜生長(zhǎng)的溫度、鹽度和pH值范圍,而且得到了最佳溫度、鹽度和pH組合[17]。對(duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)P瓦M(jìn)行分析得出預(yù)測(cè)決定系數(shù)predR2=0.852 9,決定系數(shù)為R2=0.984 3,失擬項(xiàng)F=0.328 5,P>0.05,表明所建立的模型可用于預(yù)測(cè)。目前,關(guān)于環(huán)境因子對(duì)雙線(xiàn)紫蛤幼貝生長(zhǎng)影響的研究中,暫未發(fā)現(xiàn)建立模型;本實(shí)驗(yàn)建立了溫度、鹽度和pH值對(duì)雙線(xiàn)紫蛤幼貝生長(zhǎng)的二次多項(xiàng)回歸模型,填補(bǔ)了無(wú)模型的空白。在交互項(xiàng)研究中,溫度和鹽度對(duì)幼貝生長(zhǎng)影響極顯著(P<0.05),而鹽度和pH、溫度和pH影響不顯著(P>0.05),說(shuō)明溫度對(duì)幼貝的生長(zhǎng)尤為重要,其次為鹽度、pH。運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)行分析,擬合得到日生長(zhǎng)率的二次響應(yīng)面回歸方程,模擬分析后,得出雙線(xiàn)紫蛤幼貝最佳環(huán)境因子組合是溫度為26.43℃、鹽度為25、pH為8.3,理論最佳日生長(zhǎng)率為2.90%,經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后,得到的日生長(zhǎng)率為2.76%,與理論值較為接近,證實(shí)了響應(yīng)面模型能較好地優(yōu)化雙線(xiàn)紫蛤幼貝的生長(zhǎng)條件。
在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中,為獲得最大的經(jīng)濟(jì)利益,致力尋求雙線(xiàn)紫蛤最大生長(zhǎng)率。經(jīng)響應(yīng)面分析優(yōu)化得出最佳生長(zhǎng)環(huán)境條件在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程是可以實(shí)現(xiàn)的。在大規(guī)模養(yǎng)殖推廣過(guò)程中,對(duì)養(yǎng)殖池塘水質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè),將溫度、鹽度和pH穩(wěn)定在適宜范圍內(nèi)在技術(shù)上是可以做到的,日常管理可以結(jié)合常見(jiàn)疾病防治,確保池塘健康養(yǎng)殖。在眾多養(yǎng)殖環(huán)境因子中,除了溫度、鹽度和pH外,餌料、養(yǎng)殖密度、溶氧等各種內(nèi)外環(huán)境因子與雙線(xiàn)紫蛤生長(zhǎng)均有一定程度的關(guān)聯(lián),在今后研究過(guò)程需要進(jìn)一步加深上述因子聯(lián)合影響的研究,為實(shí)際生產(chǎn)提供更加科學(xué)的理論依據(jù)。
[1]孫成波,劉建勇,陳枯.北部灣4個(gè)自然群體雙線(xiàn)紫蛤形態(tài)差異與判別分析[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào),2010,19(5):583-587.
[2]林天喜,閔志勇.雙線(xiàn)紫蛤排放精卵后的營(yíng)養(yǎng)成分分析[J].科技資訊,2010,(19):218-219.
[3]黃建輝.雙線(xiàn)紫蛤Sanguinolariadiphos(Linnaeus)規(guī)模化繁育技術(shù)研究[J].福建水產(chǎn),2013,35(5):375-380.
[4]朱曉聞.溫度、鹽度、pH對(duì)馬氏珠母貝稚貝生理學(xué)特征的聯(lián)合效應(yīng)研究[D].廈門(mén):廈門(mén)大學(xué),2012.
[5]汪仁官.試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析[M].北京:中國(guó)統(tǒng)計(jì)出版社,1998.
[6]栗志民,劉志剛,徐法軍,等.溫度、鹽度、pH和餌料密度對(duì)皺肋文蛤清濾率的影響[J].漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展,2011,32(4):55-61.
[7]楊鳳,曾超,王華,等.環(huán)境因子及規(guī)格對(duì)菲律賓蛤仔幼貝潛沙行為的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(3):795-802.
[8]陳志.波紋巴非蛤幼蟲(chóng)附著變態(tài)的誘導(dǎo)及幼貝生長(zhǎng)的研究[D].福州:福建師范大學(xué),2016.
[9]董志國(guó),李家樂(lè),李曉英,等.溫度和攝食作用對(duì)西施舌胃蛋白酶活力的影響[J].上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,14(4):397-401.
[10]方軍,李磊,陳琛,等.幾種生態(tài)因子對(duì)尖刀蟶幼貝存活率和生長(zhǎng)率的影響[J].臺(tái)灣海峽,2011,30(1):86-91.
[11]孔寧.溫度、鹽度對(duì)皺紋盤(pán)鮑“97”選群生長(zhǎng)發(fā)育的影響[D].北京:中國(guó)科學(xué)院大學(xué),2016.
[12]桑士田,閆喜武,楊鵬,等.菲律賓蛤仔稚貝最適生長(zhǎng)環(huán)境條件的響應(yīng)面法分析[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2012,36(9):1410-1418.
[13]陳志.鹽度、密度和底質(zhì)對(duì)雙線(xiàn)紫蛤幼貝存活及生長(zhǎng)的影響[J].漁業(yè)研究,2017,39(1):34-39.
[14]林祥志.幾種頭足類(lèi)遺傳多樣性及真蛸與雙線(xiàn)紫蛤的繁育生物學(xué)研究[D].廈門(mén):廈門(mén)大學(xué),2007.
[15]陳志,高如承,胡青,等.溫度、鹽度和密度交互作用對(duì)波紋巴非蛤幼貝生長(zhǎng)的影響[J].海洋科學(xué),2013,37(8):56-62.
[16]申玉春,熊邦喜,葉富良,等.凡納濱對(duì)蝦高位池養(yǎng)殖系統(tǒng)的水質(zhì)理化狀況[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)),2006,26(2):16-21.
[17]彭俊.幾種環(huán)境因子對(duì)尼羅羅非魚(yú)受精、孵化及幼魚(yú)生長(zhǎng)的聯(lián)合效應(yīng)研究[D].湛江:廣東海洋大學(xué),2011.
Combined effects of temperature,salinity and pH on the growth rate ofSanguinolariadiphosjuveniles
CHEN Zhi
(Freshwater Fishery Research Institute of Fujian Province,F(xiàn)uzhou 350002,China)
In order to explore the optimum growth conditions ofSanguinolariadiphosjuveniles,response surface methodology was used to study the interactions of temperature(24℃,27℃,30℃),salinity(20,25,30),pH(7.3±0.03,8.3±0.03,9.3±0.03)onSanguinolariadiphosjuveniles daily growth rate.The results showed:1)The effect of temperature on the growth rate was the most significant(P<0.01),and the order of three ecological factors effects was temperature(A)>salinity(B)>pH(C).2)By means of Design-Expert 8.0.6 software,the optimum growth environment conditions ofSanguinolariadiphosjuveniles were as follows:temperature 26.43℃,salinity 25 and pH 8.3,and theoretical optimal growth rate was 2.90%.After experimental verification,the real growth rate was 2.76% under the theoretical condition,suggesting RSM was reliable.The research results provided a theoretical references forSanguinolariadiphosartificial aquaculture in the pond.
response surface methodology;Sanguinolariadiphosjuveniles;growth rate;temperature;salinity;pH
2017-06-26 基金資助:福建省海洋高新產(chǎn)業(yè)發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目[2013]029號(hào);福建省省屬公益類(lèi)科研院所基本科研專(zhuān)項(xiàng)(2015R1002-6).
陳 志(1987-),男,碩士,助理工程師,主要從事水生動(dòng)物繁育及貝類(lèi)增養(yǎng)殖研究.E-mail:465887787@qq.com
P735
A
1006-5601(2017)04-0264-08
陳 志.溫度、鹽度和pH對(duì)雙線(xiàn)紫蛤幼貝生長(zhǎng)率的聯(lián)合效應(yīng)[J].漁業(yè)研究,2017,39(4):264-271.