楊本勇 ， 曹 東 ， 顧貴波 ， 趙曉彤 ， 趙鳳菊 ， 于學(xué)武 ， 關(guān) 淼 ，李樹博 ， 王克才 ， 李井春 ， 魏 澍

(遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心遼寧省動物醫(yī)學(xué)研究院 ， 遼寧沈陽110164)

天津株(TJM-F92)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫后病毒血癥和抗體消長規(guī)律的試驗報告

楊本勇 ， 曹 東 ， 顧貴波 ， 趙曉彤 ， 趙鳳菊 ， 于學(xué)武 ， 關(guān) 淼 ，李樹博 ， 王克才 ， 李井春 ， 魏 澍

(遼寧省動物疫病預(yù)防控制中心遼寧省動物醫(yī)學(xué)研究院 ， 遼寧沈陽110164)

高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株引起的一種急性高致死性疫病。發(fā)病主要特征為懷孕母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、木乃伊胎等，母豬流產(chǎn)率可達30%以上；仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道癥狀，感染率可達100%，死亡率在50%以上[2-3]。目前我國使用的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗均為活疫苗，據(jù)報道活疫苗免疫后可在動物體內(nèi)復(fù)制并持續(xù)存在。為摸清高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗免疫后在豬體內(nèi)的存在時間，我們進行了本試驗，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗豬 在某豬場選擇28～30日齡、未進行高致病性豬繁殖與呼吸綜合征免疫的長白仔豬15頭，經(jīng)熒光RT-PCR檢測，豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、2型圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病病毒均為陰性，實驗豬編號為A1-A15。

1.1.2 疫苗 天津株(TJM-F92株)高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗，政府招標(biāo)采購。

1.1.3 RT-PCR試劑 鑒別檢測豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)高致病性強毒和致弱TJM-F92株疫苗毒的RT-PCR引物，由華威特生物科技有限公司提供，擴增片段位于NSP2基因；dNTP、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、ExTaq聚合酶等，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.4 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測試劑盒 購自北京天之泰生物科技有限公司，法國LSI公司生產(chǎn)。

1.1.5 核酸提取試劑 核酸提取試劑盒(磁珠法)，購自西安天隆生物科技有限公司。

1.1.6 試驗器材 eppendorf微量移液器，PCR儀，電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)，西安天隆生物科技有限公司NP968核酸提取儀，伯樂iMark酶標(biāo)儀。

1.2 方法

1.2.1 免疫注射 按疫苗說明書提供的免疫劑量和注射部位對試驗豬進行免疫注射。

1.2.2 采血 試驗豬在免疫前采血1次；免疫后每隔1周采血1次，連續(xù)采10周；以后每隔2周采血1次，連續(xù)采4次。無菌分離血清，進行高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒(TJM-F92株)核酸檢測和抗體檢測。

1.2.3 高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(TJM-F92株)核酸檢測 用RT-PCR方法進行檢測。

1.2.3.1 核酸提取 在96孔核酸提取板的第1列孔及第7列孔中分別加入200 μL血清，10 μL Proteinase K，4 μL Acryl Carrier，然后將板放入核酸提取儀中，按說明書程序進行自動化提取。

1.2.3.2 反轉(zhuǎn)錄 樣品RNA 5 μL，反轉(zhuǎn)錄引物 1 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，5×Buffer 4 μL，M-MLV 1 μL，RNA酶抑制劑1 μL，DEPC水5 μL?；靹?，42 ℃水浴1小時，70 ℃水浴15分鐘后冰上冷卻，得到cDNA溶液用于PCR擴增。

1.2.3.3 PCR擴增 cDNA 2 μL，10×Buffer 2 μL，2.5 mmol/L dNTP 1.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ExTaq聚合酶0.5 μL，雙蒸水13 μL?；靹蚝髮⒈”赑CR管放入PCR儀中，按如下程序擴增：首先95 ℃預(yù)變性5 min；然后94 ℃ 30 s,56 ℃ 60 s,72 ℃ 45 s,35個循環(huán)。最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓 100 V,電泳20 min。電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)觀察。若擴增出約644 bp的特異性條帶，則高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗毒(TJM-F92株)核酸陽性。

1.2.4 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測 按試劑盒說明書的步驟和要求操作。阻斷率(IRPC)大于20%為抗體陽性，阻斷率越大，抗體水平越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 TJM-F92株疫苗核酸檢測結(jié)果(表1)由表1可知，免疫前疫苗毒核酸均為陰性。在免疫后1周時有4頭豬疫苗毒核酸為陽性，陽性率27%(4/15)，免疫后2周時陽性率13%(2/15)，在免疫后第3周時陽性率最高，為47%(7/15)，此后開始下降，至第6周時只有7%(1/15)。從第7周開始再沒有檢出陽性，表明，TJM-F92株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒的病毒血癥時間最長為6周。

表1 血清中TJM-F92株疫苗毒核酸檢測結(jié)果

2.2 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測結(jié)果 見表2。從表2可以看出，由于母源抗體的存在，免疫前抗體陽性率達到87%，免疫后抗體陽性率開始下降，至免疫后第2周時下降至33%，隨后開始緩慢上升，至免疫后第3周時上至47%，第4周時升至53%，到免疫后第5周時突然上升至100%，并一致持續(xù)到第12周，隨后開始稍有下降。抗體平均阻斷率在免疫前也處在較高水平，達到72%，免疫后開始下降，至免疫后第2周時降至最低，只有18%，為陰性。此后開始慢慢上升，至免疫后第6周時達到最高值78%，此后開始緩慢下降。

3 討論

3.1 從實驗豬血清中TJM-F92株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗毒存在時間的變化規(guī)律可以看出，不同豬只病毒血癥的持續(xù)時間差異較大，有的沒有出現(xiàn)病毒血癥，有的只存在1周，最長的可以達到免疫后第6周。因此TJM-F92株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗免疫后病毒血癥持續(xù)時間為6周。

3.2 本試驗的抗體檢測結(jié)果表明，疫苗免疫后，豬體內(nèi)的母源抗體會明顯下降，降到合格臨界值附近，這一低水平的抗體一直持續(xù)至免疫后第4周，從第5周開始疫苗免疫產(chǎn)生的抗體水平明顯上升，至第6周時達到最高水平，并維持在一個平臺到免疫后第16周，本試驗的結(jié)果表明，無論仔豬的母源抗體水平高低，免疫后大約都需要經(jīng)過4周左右的時間才能產(chǎn)生較高的抗體水平。因此免疫后的第1周至第4周抗體水平比較低，是比較危險的時期[4]。

表2 豬繁殖與呼吸綜合征抗體檢測結(jié)果

3.3 比較實驗豬的病毒血癥陽性率與平均抗體水平的變化規(guī)律(見圖1)可以發(fā)現(xiàn)，病毒血癥的嚴(yán)重程度與抗體水平的高低呈負(fù)相關(guān)，即抗體水平低時，病毒血癥就比較嚴(yán)重，隨著抗體水平的不斷上升，病毒血癥逐漸減弱，當(dāng)抗體維持在較高水平時，病毒血癥消失[1]。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，可能是動物體內(nèi)疫苗毒同抗體之間“互相斗爭”的結(jié)果，疫苗免疫后刺激動物機體產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生的抗體又不斷的將活疫苗毒中和。而隨著免疫時間的延長，抗體水平進一步提高，疫苗毒不斷的被中和，以致無法被檢測到[3]。

圖1 病毒血癥陽性率與平均抗體水平變化曲線

[1] 黃名英,傅安靜,劉平，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染早期體內(nèi)增殖規(guī)律調(diào)查[J].畜牧與獸醫(yī),2013,45(2):50-54.

[2] 李明義,白志娟,王莉娟，等.豬瘟滅活疫苗抗體消長規(guī)律動態(tài)研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2005,27(5):385-388.DOI:10.3969/j.issn.1008-0589.2005.05.017.

[3] 魏園園，顧貴波，申冠男，等.高致病性豬繁殖與呼吸綜合征疫苗(JXA1-R株)免疫后病毒血癥和抗體消長規(guī)律[J].中國獸醫(yī)雜志，2016,52(4):44-45.

2016-04-13

遼寧省重大動物疫病病原變異與綜合防控技術(shù)研究(2011214001)；高致病性豬藍耳病綜合防控與免疫凈化技術(shù)推廣[遼財指農(nóng)(2013)1334號]

楊本勇(1973- )，男，高級獸醫(yī)師，本科，從事動物疫病防控工作,E-mail：benyong@tom.com

顧貴波，E-mail：guguibo8888@126.com

S852.65+9

B

0529-6005(2017)07-0056-02