趙明娟

(北京市懷柔區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京懷柔101400)

反復凍融對血清樣品中三型口蹄疫免疫抗體效價的影響

趙明娟

(北京市懷柔區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京懷柔101400)

為了研究反復凍融對血清樣品中免疫抗體效價的影響，隨機采集50份采用口蹄疫O型、A型、亞洲1型三價滅活疫苗進行過多次口蹄疫免疫的健康奶牛血清樣品，采用液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗分別檢測其中口蹄疫O型、A型、亞洲1型免疫抗體的效價。每份樣品檢測4次，檢測時間分別為采樣后、反復凍融1次后、反復凍融2次后、反復凍融3次后。冷凍條件為-20℃冷凍24 h，融解溫度為25 ℃。統(tǒng)計分析樣品4次檢測的口蹄疫O型、A型、亞洲1型免疫抗體效價變化，采用單因素方差分析進行差異顯著性分析。結(jié)果顯示，采樣后、反復凍融1次、反復凍融2次、反復凍融3次所測得的口蹄疫O型、A型、亞洲1型免疫抗體效價差異均不顯著，表明反復凍融3次以內(nèi)不會影響血清樣品中免疫抗體效價。

反復凍融 ； 血清樣品 ； 免疫抗體效價

畜禽免疫抗體監(jiān)測是畜禽重大動物疫病防控工作的重要環(huán)節(jié)，通過免疫抗體監(jiān)測，不僅可以直接有效地反映畜禽體內(nèi)免疫抗體水平，評估疫苗免疫質(zhì)量和效價，制定科學的免疫程序[1]，同時也為動物疫病風險評估提供可靠依據(jù)，根據(jù)監(jiān)測結(jié)果及時對不合格場戶進行補免，預(yù)防群體發(fā)病，降低疫情發(fā)生風險，保障養(yǎng)殖戶經(jīng)濟效益[2]。

作為實驗室檢驗人員，正確地保存和處理送檢樣品、嚴格地試驗操作都是確保試驗結(jié)果準確性的必要條件[3]。根據(jù)《2015年國家動物疫病監(jiān)測與流行病學調(diào)查計劃》，每種送檢動物血清樣品的抗體檢測項目也包括3種以上，例如豬血清樣品需檢測的免疫抗體項目包括豬瘟、高致病性豬藍耳病、口蹄疫O型等，奶牛血清樣品需檢測口蹄疫O型、亞洲1型、A型等，雞血清樣品需檢測高致病性禽流感H5N1 Re-6株、H5N1 Re-7株、新城疫等。在基層實驗室，由于人力和設(shè)備的不足，很難一次完成所有項目的檢測工作，待檢血清樣品反復凍融在所難免。

本試驗通過研究反復凍融3次的奶牛血清樣品中口蹄疫O型、亞洲1型、A型免疫抗體效價的變化，進一步揭示反復凍融血清樣品對其中抗體效價會產(chǎn)生何種影響，以期為廣大實驗室工作人員合理安排免疫抗體檢測試驗提供參考，確保試驗結(jié)果的準確性及有效性。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗樣品隨機采集50份采用口蹄疫O型、A型、亞洲1型三價滅活疫苗進行過多次口蹄疫免疫的健康奶牛血清樣品，所使用的口蹄疫三價滅活疫苗由金宇寶靈生物藥品有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗設(shè)計，試驗樣品采集后，未經(jīng)冷凍，第1次檢測其中三型口蹄疫的免疫抗體效價，記錄結(jié)果；血清樣品經(jīng)-20 ℃ 第1次冷凍24 h后，于25 ℃充分融解，第2次檢測其中三型口蹄疫的免疫抗體效價，記錄結(jié)果；血清樣品經(jīng)-20 ℃第 2次冷凍24 h后，于25 ℃充分融解，第3次檢測其中三型口蹄疫的免疫抗體效價，記錄結(jié)果；血清樣品經(jīng)-20 ℃ 第3次冷凍24 h后，于25 ℃充分融解，第4次檢測其中三型口蹄疫的免疫抗體效價，記錄結(jié)果。

1.3 試驗試劑口蹄疫A型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號20151027103-1，抗原批號15081003，抗原使用濃度1∶6；口蹄疫亞洲1型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號20150901102-1，抗原批號14122402，抗原使用濃度1∶6；口蹄疫O型抗體液相阻斷ELISA檢測試劑盒，中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，批號20151016101-7，抗原批號15080401，抗原使用濃度1∶15。

1.4 試驗儀器與設(shè)備30～300 μL 12道移液器，5～50 μL 12道移液器，5～50 μL 單道移液器，1～10 mL 單道移液器，生產(chǎn)廠家均為Thermo。電熱恒溫培養(yǎng)箱，生產(chǎn)廠家Boxun，型號BPX-162。純水儀，生產(chǎn)廠家HITECH，型號Master-S。自動洗板機，生產(chǎn)廠家BioTek，型號405LSRS。酶標儀，生產(chǎn)廠家Thermo，型號MULTISKAN MK3。

1.5 試驗方法，血清樣品三型口蹄疫免疫抗體檢測均采用液相阻斷ELISA方法開展，試驗嚴格按照GB/T18935-2003口蹄疫診斷技術(shù)和試劑盒說明書進行操作。

1.6 試驗結(jié)果統(tǒng)計分析，對4組試驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析的方法進行統(tǒng)計學分析，研究其差異顯著性。

2 試驗結(jié)果，見表1。

表1 三型口蹄疫免疫抗體監(jiān)測結(jié)果及分析統(tǒng)計

2.1 三型口蹄疫免疫抗體檢測結(jié)果分析 通過觀察與實驗原始數(shù)據(jù)，每份樣品4次檢測的三型口蹄疫免疫抗體效價基本一致，偶爾有個別效價出現(xiàn)偏差，并未呈現(xiàn)規(guī)律性下降，分析原因可能是由于試驗誤差所致。

50份樣品4次檢測的三型口蹄疫免疫抗體效價平均值變化不大，相差在一個滴度內(nèi)。

2.2 三型口蹄疫免疫抗體檢測結(jié)果差異顯著性分析 采用單因素方差分析對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示，三型口蹄疫免疫抗體檢測結(jié)果P值均大于0.05，差異不顯著，表明反復凍融3次以內(nèi)不會造成待檢血清樣品中的三型口蹄疫免疫抗體效價產(chǎn)生變化。

3 討論

3.1 鐘錦輝(2013)通過實驗證明，多次凍融不會造成血清豬瘟抗體效價的顯著降低[4]。本試驗結(jié)果表明，反復凍融3次以內(nèi)不會對血清樣品中的口蹄疫O型、亞洲1型、A型免疫抗體效價造成影響。在實驗室人員和設(shè)備不足的情況下，將送檢樣品適當凍融不會造成檢測結(jié)果的偏差，仍然具有可信度。值得注意的是，融解血清樣品的溫度不宜太高，本試驗選擇的是25 ℃，屬于一般試驗反應(yīng)的正常溫度，若融解溫度高于37 ℃，可能引起樣品變質(zhì)，造成抗體效價降低。

3.2 疫苗免疫屬于人工主動免疫，在畜禽體內(nèi)產(chǎn)生的抗體主要成分為免疫球蛋白IgG。IgG在動物體內(nèi)含量高、持續(xù)時間長，具有抗菌、中和病毒和毒素等免疫學活性，是畜禽機體內(nèi)抗感染免疫的主力，也是血清學診斷和疫苗免疫后監(jiān)測的主要抗體。由于免疫球蛋白屬于大分子蛋白質(zhì)，引起待檢血清中免疫抗體效價降低的原因，可能是抗體在某些物理或化學因素作用下，其特定的空間結(jié)構(gòu)被破壞，導致理化性質(zhì)改變和生物學活性的喪失，即蛋白質(zhì)發(fā)生變質(zhì)。引起蛋白質(zhì)變性的原因包括物理因素和化學因素兩類。物理因素有加熱、振蕩、紫外線照射、超聲波作用等；化學因素有強酸、強堿、重金屬鹽等。冷凍屬于低溫因素，并不是引起蛋白質(zhì)變性的主要因素。有研究顯示，血清樣品，在2 ℃～8 ℃的冰箱中，可保存15 d，-15 ℃以下冷凍可保存2年[5]，因此，少次的反復凍融并不會對待檢血清樣品中的免疫抗體效價產(chǎn)生影響。

3.3 根據(jù)北京市動物疫病預(yù)防控制中心發(fā)布的《關(guān)于做好2016年動物防疫工作的通知》(京疫控〔2016〕16號)2016年北京市強制免疫動物疫病種類有7種，包括高致病性禽流感、口蹄疫、高致病性豬藍耳病、豬瘟、狂犬病、小反芻獸疫和羊布魯菌?。桓鶕?jù)《2016年北京市動物疫病監(jiān)測計劃實施方案》(京疫控〔2016〕15號)2016年動物疫病監(jiān)測種類包括免疫抗體檢測和病原學監(jiān)測兩大類。根據(jù)文件要求，每份待檢血清樣品檢測項目都在5項左右，不需要反復凍融多次。本試驗從實際出發(fā)，本著應(yīng)用性強的原則，只研究了反復凍融3次以內(nèi)血清樣品中口蹄疫O型、亞洲1型、A型免疫抗體效價的變化情況，結(jié)果顯示不受影響，但并不表明多次反復凍融不會導致血清樣品中抗體效價降低，具體影響如何還有待進一步研究。

3.4 本試驗只研究了反復凍融3次以內(nèi)對待檢血清樣品中口蹄疫O型、亞洲1型、A型免疫抗體效價不會產(chǎn)生影響，在工作實踐中，一份待檢血清樣品需要檢測多種抗體效價的情況還包括豬、羊、犬、雞、鴨、鵝等畜禽的血清樣品。由于抗體的成分都是免疫球蛋白，其生物學特性基本相似，推斷此試驗的結(jié)論也應(yīng)該適用于其他抗體檢測試驗，實際如何有待進一步驗證。

[1] 劉永波，宋春蓮，謝相悅，等.云南4 個規(guī)?；i場豬瘟抗體水平監(jiān)測及免疫效果分析[J].中獸醫(yī)學雜志，2017，1: 84-86.

[2] 馬 琪，韓冬林. 畜禽免疫抗體監(jiān)測工作存在的問題及對策[J]. 養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2011，12: 195.

[3] 田肖，紀高華，任友安. 影響動物免疫抗體檢測結(jié)果的因素分析[J]. 湖北畜牧獸醫(yī)，2017，38(1): 39-40.

[4] 鐘錦輝，張海明，段曉冬，等. 血清凍融次數(shù)對豬瘟抗體效價的影響[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技 ，2013，38(1): 17-19.

[5] 羅承金. 畜禽免疫抗體監(jiān)測血樣采集與血清分離保存技術(shù)[J]. 山東畜牧獸醫(yī) ，2012，33(2): 48-49.

2016-12-31

趙明娟(1981-)，女，高級獸醫(yī)師，碩士，從事動物疫病監(jiān)測和檢測研究，E-mail: zmj168_ren@163.com

S852.5

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0529-6005(2017)07-0095-02