劉永平，魏來，陳文雁，孔高茵，劉景詩

（湖南省人民醫(yī)院 麻醉醫(yī)學中心，湖南 長沙 410005）

PPARγ1基因轉(zhuǎn)染對心肌缺血再灌注后的影響和意義*

劉永平，魏來，陳文雁，孔高茵，劉景詩

（湖南省人民醫(yī)院 麻醉醫(yī)學中心，湖南 長沙 410005）

目的 探討心肌細胞過表達過氧化物酶體增殖物激活受體γ1（PPARγ1）基因后對缺血再灌注損傷導致的血流動力學、心肌梗死（心梗）面積、血清肌鈣蛋白I（cTnI）及心肌基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）濃度的變化及意義。方法 30只SD大鼠隨機分成3組（n=10）：SHAM組、MIRI組及PPARγ1組。SHAM組和MIRI組開胸經(jīng)冠狀動脈（冠脈）轉(zhuǎn)染攜帶綠色熒光蛋白的腺病毒載體（Ad-EGFP），PPARγ1組轉(zhuǎn)染攜帶PPARγ1基因的腺病毒載體（Ad-PPARγ1）至心肌組織。穩(wěn)定3 d后重新開胸，SHAM組只過線，不接扎；MIRI組及PPARγ1組結(jié)扎冠脈左前降支30min，再灌注120min。觀察缺血前（T0）、缺血30min（T1）、再灌注30min（T2）、再灌注120 min（T3）時的心率（HR）、平均動脈壓（MAP）、左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP），左室壓最大上升和下降速率（±dp/dt max）；再灌注120 min時檢測心梗面積、血清心肌肌鈣蛋白I（cTnI）和組織MMP-9濃度的變化。結(jié)果 與T0時比較，T1～T3時MIRI組、PPARγ1組LVEDP升高，HR減慢，LVSP和（±dp/dt max）降低，MAP除PPARγ1組在T3時差異無統(tǒng)計學意義，也明顯降低（P＜0.05）；與SHAM組比較，T1～T3時MIRI組、PPARγ1組LVEDP升高，HR減慢，LVSP和（±dp/dt max）降低，MAP除PPARγ1組在T3時差異無統(tǒng)計學意義，也明顯降低（P＜0.05）；與MIRI組比較，PPARγ1組±dp/dt max升高，LVSP在T2、T3時升高，MAP在T3時升高（P＜0.05）；SHAM組無心肌梗死，MIRI組和PPARγ1組的缺血面積差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而MIRI組和PPARγ1組心肌梗死面積、cTnI和MMP-9均高于SHAM組，PPARγ1組低于MIRI組（P＜0.05）。結(jié)論 過表達PPARγ1基因能通過減輕缺血再灌注過程中血流動力學紊亂、減少心梗面積、降低血清cTnI及組織MMP-9的濃度，從而起到保護心肌的作用。

心肌缺血再灌注損傷；過氧化物酶體增殖物激活受體γ1；血流動力學；心肌梗死面積；心肌肌鈣蛋白I；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

近年來，老齡化及老年人伴隨高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┘疤悄虿〉然A疾病日趨嚴重，日常生活中急性心肌缺血引起的血流動力學紊亂、心律失常、心肌梗死（心梗）及心力衰竭等嚴重威脅著此類患者的生命安全，盡早恢復缺血區(qū)的血液灌注是搶救的關(guān)鍵，但灌注的同時亦帶來更嚴重的損傷，這種恢復血液灌注而進一步加重心肌損傷的現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）。MIRI在臨床上十分常見，如心梗后溶栓及支架植入術(shù)、體外循環(huán)下心內(nèi)直視手術(shù)及冠狀動脈（冠脈）搭橋術(shù)等。為達到更好的療效，減輕再灌注后所帶來的損傷是眾多學者研究的焦點問題?；蛑委熤苯幼饔糜谑軗p基因，是對疾病根源的治療，有文獻[1-2]報道，運用基因治療的方法可以達到防治MIRI目的，也成為近年研究的熱點。本實驗前期研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染過氧化物酶體增殖物激活受體γ1 （peroxisom eproliferator-activated receptor γ1，PPARγ1）通過抑制炎癥反應、抑制凋亡等起到心肌保護的作用[3-4]，而直接調(diào)控PPARγ1基因是否通過改變心肌基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloprotein 9，MMP-9）目前尚未有相關(guān)研究結(jié)果，本研究旨在通過冠脈轉(zhuǎn)染PPARγ1基因后，使其在心肌過表達，分析心肌缺血再灌注后血流動力學、心梗面積及MMP-9等指標的變化，探討其保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料及分組

健康成年雄性SD大鼠30只。無特定病原體級；月齡2～3月；體重200～250 g（長沙斯萊克景達公司提供）。攜帶綠色熒光腺病毒（Ad-EGFP）載體和攜帶PPARγ1的腺病毒（Ad-PPARγ1）載體（由上海吉凱基因技術(shù)有限公司提供），使用時稀釋滴度至1×109/（PFU/ml）。大鼠隨機分為3組，每組10只：①SHAM組：冠脈轉(zhuǎn)染Ad-EGFP 0.1ml，穩(wěn)定3d后，冠脈左前降支只過線，不結(jié)扎；②MIRI組：冠脈轉(zhuǎn)染Ad-EGFP 0.1 ml，穩(wěn)定3 d后，結(jié)扎左前降支30 min，再灌注120min；③PPARγ1組：冠脈轉(zhuǎn)染Ad-PPARγ 1 0.1 ml，穩(wěn)定3 d后，結(jié)扎左前降支30 min，再灌注120 min。

1.2 動物模型及實驗過程

基因轉(zhuǎn)染實驗過程參照文獻[5]，本實驗采用短暫阻斷主動脈和肺動脈，通過增加冠脈灌注壓力進行基因轉(zhuǎn)染。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后固定，氣管插管控制呼吸；左胸部消毒、鋪巾，胸骨左緣3、4肋間進胸，必要時切除部分胸腺，打開心包，充分暴露心臟，分離主、肺動脈根部并在其下方過1根10號線，將線拉緊阻斷主、肺動脈，同時心尖部用27#針頭注入0.1 ml各組相應試劑至左心室腔，10 s后，將線松開，通過心臟的跳動，使試劑通過冠脈循環(huán)進行充分的心肌分布，期間密切觀察心臟變化，如無異常充分膨肺后關(guān)胸。肌內(nèi)注射青霉素10萬u，預防感染。術(shù)畢，呼吸穩(wěn)定后拔管。

MIRI模型參照文獻[6-7]，本實驗采用比較常見的阻斷大鼠冠脈左前降支復制缺血再灌注模型。大鼠基因轉(zhuǎn)染3 d后，用同樣的方法麻醉、固定、控制呼吸、接生理記錄儀，右頸動脈置管并用BL-420F系統(tǒng)（四川省成都泰盟科技有限公司）記錄血流動力學指標。原切口開胸，以6-0線于左心耳下緣2 mm處連同心大靜脈一起結(jié)扎左前降支，以結(jié)扎線以下心肌組織變紫、心電圖ST段弓背抬高為結(jié)扎成功標志，結(jié)扎30 min，再灌注120 min。

1.3 指標檢測及方法

1.3.1 血流動力學 BL-420F系統(tǒng)記錄并觀察缺血前（T0）、缺血 30 min（T1）、再灌注 30 min（T2）、再灌注120 min（T3）時的心率（heart rate，HR）、平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）、左室收縮壓（left ventricular systolic pressure，LVSP）、左室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure，LVEDP）、左室壓最大上升和下降速率（±dp/dt max）。

1.3.2 心梗面積 MIRI組及PPARγ1組各取6只大鼠，用EB-TTC雙染色+圖像分析計算梗死面積。實驗末，再次結(jié)扎冠脈左前降支，經(jīng)心室腔注入2%伊文藍（Evan's blue，EB）2 ml用于區(qū)分缺血區(qū)與正常心肌，30s立即剪下心臟，僅留下左心室，速凍20min，自心尖向心底部切成厚約2 mm的切片，1%氯化四唑染色區(qū)分梗死區(qū)與非梗死區(qū)。此時心臟切片呈現(xiàn)3種顏色，藍色為非缺血區(qū)心肌，紅色為危險區(qū)心肌，白色為梗死心肌。

1.3.3 心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）測定再灌注末，取動脈血3 ml，3 000 r/min離心10 min，留取上清液置于-20℃冰箱冷凍保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法按說明書測定cTnI的濃度。

1.3.4 MMP-9測定 實驗末，立即剪下缺血區(qū)0.1 g左室心肌組織，4℃冷生理鹽水中漂洗除去血液，濾紙拭干，盡量取相同部位，加入1ml磷酸鹽緩沖溶液，制成勻漿，離心，取上清液，使用Rat MMP-9 ELISA（美國Rapidbio Lab）試劑盒，按說明書操作測定心肌組織中MMP-9的含量。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，組內(nèi)比較用重復測量設計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗動物死亡情況

本實驗過程中，其中SHAM組和MIRI組各有1只大鼠死于基因轉(zhuǎn)染實驗后，可能與心尖部注射試劑時用力不恰當導致術(shù)后心包填塞有關(guān)；另外，MIRI組和PPARγ1組分別有2只和1只大鼠死于MIRI實驗后，可能與急性心梗導致的惡性心律失常、急性肺水腫和心力衰竭等因素有關(guān)。

2.2 3組血流動力學指標變化情況

HR、MAP、LVSP、LVEDP 及±dp/dt max等指標采用重復測量設計的方差分析。指標HR結(jié)果表明：①不同時間有差異（F=83.16，P=0.002）；②不同組有差異（F=4.53，P=0.001），其中 MIRI組明顯減慢；③不同組不同時間的變化趨勢不同（F=16.26，P=0.002）。指標MAP結(jié)果表明：①不同時間有差異（F=116.92，P=0.002）；②不同組有差異（F=13.78，P=0.001），其中MIRI組降低；③不同組時間的變化趨勢不同（F=52.13，P=0.002）。指標LVSP結(jié)果表明：①不同時間有差異（F=146.52，P=0.001）；②不同組有差異（F=93.2，P=0.000），其中 MIRI組降低；③不同組不同時間的變化趨勢不同（F=8.23，P=0.001）。指標LVEDP結(jié)果表明：①不同時間有差異（F=210.35，P=0.000）；②不同組有差異（F=28.47，P=0.000），其中 SHAM組上升較慢；③不同組不同時間的變化趨勢不同（F=32.82，P=0.000）。指標 +dp/dt max 結(jié)果表明：①不同時間有差異（F=221.76，P=0.000）；②不同組有差異（F=63.94，P=0.000），其中 MIRI組下降最快；③不同組不同時間的變化趨勢不同（F=83.69，P=0.000）；指標-dp/dt max結(jié)果表明：①不同時間有差異（F=65.51，P=0.000）；②不同組有差異（F=12.6，P=0.000），其中MIRI組下降最快；③不同組時間的變化趨勢不同（F=59.32，P=0.000）。見表 1。

2.3 3組心梗面積、cTnI及MMP-9情況

以心肌缺血危險區(qū)（area at risk，AAR）/左心室（left ventricu-lar，LV）重量百分比為缺血面積，以心梗區(qū)（isfarctsize，IS）/AAR重量百分比為梗死面積。SHAM組無心肌梗死，MIRI組和PPARγ1組的缺血面積差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明實驗過程中造模基本穩(wěn)定，具有可比性。而PPARγ1組心梗面積比MIRI組小，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

與 SHAM組比較，MIRI組和 PPARγ1組的cTnI均升高（P＜0.05）；與 MIRI組比較，PPARγ1組的cTnI則降低（P＜0.05）。見表 2。

MIRI組的 MMP-9 含量為（240.8±45.8）ng/ml，PPARγ1組為（172.5±37.2）ng/ml，均高于 SHAM 組（30.9±10.5）ng/ml（P＜0.05）；PPARγ1組又低于MIRI組（P＜0.05）。見表 2。

表1 3組大鼠HR、MAP、LVSP、LVEDP及（±dp/dt max）變化情況 （±s）

表1 3組大鼠HR、MAP、LVSP、LVEDP及（±dp/dt max）變化情況 （±s）

指標 組別T0T1T2T3SHAM 組 394.6±13.8 400.6±12.4 398.5±14.9 391.7±11.6 HR/（次/min）MIRI組399.5±14.7332.1±10.2338.9±9.81340.5±12.5 PPARγ1組 403.7±18.6 346.8±16.3 350.1±15.2 355.6±17.2 SHAM 組 109.1±7.6 112.6±8.5 107.9±7.1 115.7±9.8 MAP/mmHg MIRI組 111.4±6.9 75.2±4.1 79.1±5.6 81.1±6.2 PPARγ1組 116.1±8.8 88.2±5.3 92.3±6.8 103.5±7.1 SHAM 組 131.6±15.3 128.2±15.6 122.6±13.9 120.2±13.1 LVSP/mmHg MIRI組 128.5±15.4 76.1±5.3 80.5±6.1 83.8±6.5 PPARγ1 組 121.6±10.5 80.4±6.1 98.4±6.9 103.4±6.7 SHAM 組 3.1±0.4 3.0±0.5 3.1±0.6 3.2±0.6 LVEDP/mmHg MIRI組 3.2±0.5 18.9±3.5 29.7±5.1 22.3±4.8 PPARγ1 組 2.9±0.4 15.6±3.9 23.8±5.41 19.5±4.9 SHAM 組 954.0±168.0 935.0±136.0 946.0±149.0 965.0±174.0（±dp/dt max）/（Hg/s）MIRI組940.0±143.0439.0±58.0406.0±51.0394.0±49.0 PPARγ1組 929.0±151.0 512.0±71.0 507.0±64.0 498.0±57.0 SHAM 組 646.0±84.0 659.0±81.0 632.0±75.0 667.0±79.0-dp/dt max/（Hg/s）MIRI組652.0±78.0312.0±46.0329.0±47.0337.0±53.0 PPARγ1組 669.0±76.0 394.0±57.0 399.0±56.0 413.0±60.0

表2 各組心肌缺血、梗死面積分析及cTnI、MMP-9的結(jié)果

3 討論

眾所周知，MIRI是一個多因素參與的復雜的病理生理過程，目前為止尚未有一種很好的辦法防治MIRI，一直困擾著臨床醫(yī)生。隨著MIRI機制的深入研究及各種安全、高效及可控的病毒載體被不斷研發(fā)，基因治療可能為解決該問題帶來新的希望。HINKEL等[8]研究認為，轉(zhuǎn)染血紅素加氧酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）基因通過降低IL-6和細胞黏附分子-1的表達，從而減輕炎癥反應，進而起到心肌保護作用。CHEN[9]等研究認為，構(gòu)建PPENKMIDGE-NLS基因載體遞送前腦啡肽原（Preproenkephalin，PENK）基因通過增加內(nèi)源性腦啡肽的表達，從而對大鼠缺血再灌注心肌起保護作用。

PPAR是核受體超家族成員，有多種亞型，其中PPARγ是近年來最受關(guān)注的亞型，是由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，位于通路的上游，能夠激活下游通路一系列基因的表達，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控多種細胞增殖、侵襲、分化和凋亡，對調(diào)節(jié)體內(nèi)的多種病理生理過程有重要作用。其活化與腫瘤、糖尿病、動脈粥樣硬化和脂質(zhì)代謝等[10]多種疾病有關(guān)。YUE等[11]通過大鼠心臟缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)給予羅格列酮（PPAR γ配體）后可以減少梗死面積，改善心功能，且能減輕缺血區(qū)白細胞和巨噬細胞的聚積，抑制缺血再灌注誘導的D11b/CD18、ICAM-1和MCP-1表達的上調(diào)和L-選擇素的下調(diào)。王峰等[12]研究認為，羅格列酮可以減輕心肌缺血再灌注損傷后大鼠的胰島素抵抗，抑制炎癥反應，改善內(nèi)皮細胞功能而起到心肌保護作用。PPARγ作為對抗缺血再灌注損傷基因治療的新靶點，可能對防治MIRI帶來新的希望。

LVSP、+dp/dt max主要反映左心室的收縮功能，升高代表收縮能力增強，反之則減弱；LVEDP、+dp/dt max則與左心室容積、舒張功能、心室順應性有關(guān)，LVEDP升高、-dp/dt max降低則說明左心室舒張功能減退。本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌在遭遇缺血再灌注損傷后，LVSP、±dp/dt max降低，LVEDP則升高，同時HR減慢，MAP降低，說明大鼠左心室無論收縮功能還是舒張功能均減弱，對心肌造成很嚴重的損傷。而過表達PPARγ1能有效地改善血流動力學指標，減輕損傷。離體心臟實驗[13]也證明，激活PPARγ1對心臟有直接的正性變力、正性松弛、負性變時等效應。

MIRI組和PPARγ1組的缺血面積差異無統(tǒng)計學意義，說明實驗過程中結(jié)扎冠脈左前降支成功且穩(wěn)定，具有可比性。心梗范圍能直接反映心肌損傷程度，實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過缺血再灌注損傷后，MIRI組和PPARγ1組的梗死面積分別為（42.8±2.2）%、（32.7±1.9）%，說明大鼠心肌受到嚴重損傷。然而對兩組進行比較，差異有統(tǒng)計學意義，說明過表達PPARγ1基因能夠減少心梗面積而起到心肌保護的作用。

心肌cTnI是心肌細胞損傷的高度敏感和高度特異性指標，受損后2 h即可增高，臨床上檢測十分常見。實驗結(jié)果顯示，再灌注120 min時大鼠動脈血中的cTnI含量MIRI組和PPARγ1組高于SHAM組，而PPARγ1組低于MIRI組。說明心肌在遭受缺血再灌注損傷后，細胞膜受損，通透性增加，大量cTnI釋放入血。而過表達PPARγ1基因能夠通過提高膜穩(wěn)定性、減輕細胞變性壞死而起到心肌保護作用。

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）[14]是一類活性依賴于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶，主要由巨噬細胞、內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和中性粒細胞等產(chǎn)生，其主要的生理作用是降解細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM），在冠心病、MIRI及心室重建等疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中扮演著很重要的角色。目前，人類已發(fā)現(xiàn)23種MMPs，MMP-9是研究較多的一種，主要水解變性膠原和基膜的主要成分Ⅳ型膠原。實驗結(jié)果顯示，MIRI組和PPAR γ1組心肌組織中的MMP-9含量高于SHAM組，而PPARγ1組低于MIRI組。說明心肌在遭受缺血再灌注損傷過程中，釋放大量的炎癥細胞和細胞因子等，分泌或激活MMPs，其參與并介導MIRI的發(fā)生、發(fā)展過程。而過表達PPARγ1基因能夠早期抑制炎癥細胞和細胞因子的釋放，進而減輕后期內(nèi)源性炎癥因子的“瀑布效益”而起到心肌保護的作用。這與戴啟宇等[15]研究觀點一致。

MIRI是一個復雜的病理生理過程，本實驗表明過表達PPARγ1基因能夠保護缺血再灌注心肌，機制可能與穩(wěn)定心肌細胞膜、抑制炎癥因子的釋放、減少cTnI和MMP-9的表達等有關(guān)。隨著各種安全、高效的載體被不斷地研發(fā)，基因治療在MIRI的診療過程中必將發(fā)揮更大的作用。

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Effect of myocardialPPARγ1gene transfection in rat after myocardial ischemia reperfusion injury*

Yong-ping Liu,Lai Wei,Wen-yan Chen,Gao-yin Kong,Jing-shi Liu
(Department of Anesthesiology,Hunan Provincial People's Hospital,Changsha,Hunan 410005,China)

ObjectiveTo investigate the effects of overexpression of peroxisome proliferator-activated receptor γ1(PPARγ1)gene in myocardial cells on the changes of hemodynamics,the myocardial infract areas and the concentrations of inserum cTnI and tissue MMP-9 in rats after myocardial ischemia-reperfusion injury.MethodsThirty SD rats were randomly divided into three groups (n=10):SHAM group,MIRI group and PPARγ1 group.In the SHAM group and the MIRI group,myocardial tissues were transfected with recombinant adenovirus vector encoding enhanced green fluorescent protein (Ad-EGFP)via coronary artery.InPPARγ1 group,myocardial tissues were transfected with recombinant adenovirus vector mediated human PPARγ1 gene (Ad-PPARγ1).Three days after gene transfection,rats were operated for MIRI experiment.In group MIRI and PPARγ1,rats were subjected to 30 min of ischemia induced by ligating the left anterior descending branch (LADB)followed by 120 min of reperfusion.In the SHAM group,the rats only underwent open-chest surgery without ligation on the LADB.The HR,MAP,LVSP,LVEDP and (±dp/dt max)were observed at T0(before ligation),T1(ligation after 30 min),T2(reperfusion after 30 min),T3(reperfusion after 120 min).The myocardial infract areas,concentrations of cTnI in serum and MMP-9 in myocardial tissue were also assessed at 120 min after reperfusion.ResultsHR,LVSP,MAP(excepted at T3)and(±dp/dt max)were significantly reduced and LVEDP was increased in the MIRI group and PPARγ1 group compared to T0(P ＜0.05).HR,LVSP,MAP(excepted at T3)and(± dp/dt max)in the MIRI group and PPARγ1 group were significantly decreased compared to the SHAM group (P＜0.05). (±dp/dt max),LVSP at T2and T3,MAP at T3in the PPARγ1 group showed a significant increase compared with the MIRI group.There was no myocardial infarction in the SHAM group,and there was no significant difference in the myocardial ischemia area between MIRI group and PPARγ1 group (P＞0.05).The myocardial ischemia areas and the concentration of cTnI in serum and MMP-9 in myocardial tissue in the MIRI group and PPARγ1 group were significantly higher than those of the SHAM group,meanwhile these results in PPARγ1 group were significantly less than the MIRI group (P＜0.05).Conclusions Overexpression of PPARγ1 gene could protect myocardial by improving hemodynamic parameters,decreasing the infarct size and reducing the concentration of cTnI in serum and MMP-9 in tissue when myocardial ischemia-reperfusion injury happens.

myocardial ischemia-reperfusion injury;peroxisome proliferator-activated receptor γ1;hemodynamic;myocardial infarction size;cardiac troponin I;myocardial matrix metalloproteinase-9

R542.2

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.11.004

1005-8982（2017）11-0020-06

2016-08-02

湖南省教育廳科研項目（No：16C0971）

魏來，E-mail：27466226@163.com