李昌健，席世兵，李濤

? 論著 ?

窒息對新生小鼠心肌β受體表達的影響

李昌健1，席世兵1，李濤1

目的 探討窒息對新生小鼠心肌β受體表達的影響及β 2受體激動劑的干預效果。方法 清潔級出生3 d的ICR小鼠108只，雌雄不限，采用隨機數字表法分為：正常組（n=36）僅置于廣口瓶中，未給予處理；窒息組（n=36）參照文獻方法制備新生鼠常壓窒息模型；干預組（n=36）處理同窒息組，但在窒息前2 h單次腹腔注射非諾特羅。干預后分別于小鼠出生后3、5、7、14、21、28 d隨機從各組取6只，測定心電圖，處死，計算心重指數（HW/BW）。留取心臟組織，免疫組化法和蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測β1、β2受體表達。結果 正常小鼠心肌組織β1受體免疫組化染色，可見心肌細胞排列整齊，細胞核清晰，細胞膜完整，無炎性細胞浸潤。細胞核膜及胞漿著色，隨著小鼠日齡（3～28 d）增加，黃染逐漸變深。Western blot結果顯示28 d小鼠心肌β1受體相對表達量明顯高于3 d的小鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。β2受體主要為細胞核膜及胞漿著色，隨著日齡增加，著色變淺，Western blot顯示28 d小鼠心肌β2受體相對表達量明顯低于3 d的小鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與正常組3 d小鼠比較，窒息處理后，小鼠心肌β1、β2受體免疫組化染色變淺，表達均明顯下降，且窒息組心肌細胞排列紊亂，有少許炎性細胞滲出。Western blot結果顯示，窒息組較正常組心肌β1、β2受體相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。與正常組28 d小鼠相比，干預組及窒息組小鼠心肌β1、β2受體相對表達量均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。干預組28 d小鼠心肌β1、β2受體相對表達量相比于窒息組有升高趨勢。28 d小鼠中，窒息組較正常組HW/BW升高，干預組較窒息組HW/BW降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。結論 未成熟心肌發(fā)育過程中，正常小鼠β1受體表達升高，β2受體表達下降，窒息會導致β1、β2受體表達均下降，而特異性β2受體激動劑非諾特羅預處理，可促進β1、β2受體表達恢復。

窒息；心肌細胞；β腎上腺素受體；β2腎上腺素受體激動劑

腎上腺素能系統(tǒng)在調節(jié)心血管的穩(wěn)態(tài)上起重要作用。內源性的兒茶酚胺腎上腺素和去甲腎上腺素通過活化9種不同的腎上腺素受體亞型發(fā)揮調節(jié)作用，心肌細胞表達α受體（α1，α2）和β受體（β1，β2，β3），α受體具有正性肌力作用（效應明顯小于β受體）。心臟β1受體的表達量約占70%～80%，β2受體的表達量約20%～30%，β3受體含量較少，主要存在于哺乳動物的脂肪組織和胃腸道。

不同物種不同生長環(huán)境，心肌細胞發(fā)育、成熟的時限不一致，早產兒、足月兒及嬰幼兒心肌細胞稱為未成熟心肌細胞[1]。未成熟心肌細胞β受體表型分布及功能均不同于成熟心肌細胞，主要表現為未成熟心肌細胞β2受體為主，介導心肌收縮[2]，而在成熟心肌細胞中，以β1受體為主，介導心肌收縮。成熟心肌細胞在心肌梗死或心力衰竭時，β1受體密度下調，其下調程度與疾病的嚴重程度明顯相關，而β2受體密度并無明顯變化[3]。未成熟心肌細胞缺氧損傷后，β受體分布是否發(fā)生變化，甚至影響發(fā)育過程。窒息是新生兒圍產期嚴重并發(fā)癥之一，對心臟、大腦、腎臟等重要器官均可造成損傷。目前窒息對新生兒心臟β受體影響的研究較少。本研究分析了窒息新生小鼠β受體及心臟功能變化，為臨床上新生兒窒息心肌損傷治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑 清潔級出生3 d的ICR小鼠108只，雌雄不限，體重2～4（2.99±0.42）g，由湖北醫(yī)藥學院動物中心提供。凝膠制備試劑盒、彩色Marker（碧云天公司），兔抗小鼠β1、β2抗體（博奧森公司），Anti-GAPDH、二抗pv-6000 山羊抗兔/小鼠聚合物（中杉金橋公司），氫溴酸非諾特羅標準溶液（阿拉丁公司）。

1.2 動物模型制備、分組以及處理 采用隨機數字表法分為：對照組（CTL組，n=36）僅置于廣口瓶中，未給予處理；窒息組（AS組，n=36）參照文獻[4]方法制備新生鼠常壓窒息模型，將新生小鼠置于磨口瓶中，內裝0.005 kg鈉石灰，待小鼠安靜后，塞緊瓶塞，密閉30 min，立即吸氧120 min，放回籠中由母鼠哺乳飼養(yǎng)；干預組（FEN組，n=36）處理同窒息組，但在窒息前2 h單次腹腔注射非諾特羅（125 μ g/kg）。干預完，分別于小鼠出生后3、5、7、14、21、28 d隨機從各組取6只，測定體重（BW），麻醉后行心電圖檢測，處死，開胸取心臟組織，去除大血管及心外膜脂肪組織，用預冷的PBS緩沖液清洗干凈后濾紙吸干，稱全心重量（HW），計算心重指數（HW/BW）。將部分心肌組織投入10%中性福爾馬林液中固定，行病理組織學檢測，部分心肌組織保存于-80℃冰箱，用于免疫蛋白印跡檢測。

1.3 免疫組化檢測小鼠心肌β受體表達 心臟組織經乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，石蠟切片（5 μ m）脫蠟至水。室溫孵育，蒸餾水沖洗，PBS浸泡抗原修復，滴加一抗（腎上腺素β1受體濃度1：400，β2受體1：600，PBS為陰性對照），室溫孵育1 h后于4 ℃過夜。PBS沖洗3次，滴加二抗，孵育60 min。再次沖洗后顯色劑（DAB）顯色3～15 min，自來水沖洗，復染，脫水，透明，封片，顯微鏡拍照。

1.4 蛋白免疫印記法檢測小鼠心肌β受體表達 提取并測定蛋白濃度，制備電泳上樣樣品。制膠（12%分離膠，5%濃縮膠）后拔去梳子，按照順序加入Marker和樣品，濃縮膠恒壓80 V，時間約30 min；分離膠恒壓 120 V，時間約60 min。恒流200 mA，轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗（GAPDH濃度為1：5000，β1受體1：500，β2受體1：400），4 ℃過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加入1：5000的二抗，室溫孵育2 h。遮光配制化學發(fā)光液，在凝膠成像儀上顯影。掃描儀掃描圖像，圖像處理軟件定量分析目的條帶，測定光密度值，目的條帶與GAPDH光密度值之比為相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學分析 所有數據用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數±標準差（±s）表示，多組間均數的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 正常組小鼠心肌β受體表達變化 正常小鼠心肌組織β1受體免疫組化染色，可見心肌細胞排列整齊，細胞核清晰，細胞膜完整，無炎性細胞浸潤，無心肌細胞水腫及壞死。細胞核膜及胞漿著色，隨著小鼠日齡（3～28 d）增加，黃染逐漸變深（圖1）。Western blot結果顯示28 d小鼠心肌β1受體相對表達量明顯高于3 d的小鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。β 2受體主要為細胞核膜及胞漿著色，隨著日齡增加，著色變淺（圖3），Western blot顯示28 d小鼠心肌β2受體相對表達量明顯低于3 d的小鼠，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。以上提示，在小鼠心肌發(fā)育過程中，β1受體表達逐漸上調，β2受體表達逐漸下調。

2.2 窒息組小鼠心肌β受體表達變化 與正常組3 d小鼠比較，窒息處理后，心肌組織β1、β2受體免疫組化染色變淺，表達均明顯下降，且窒息組心肌細胞排列紊亂，有少許炎性細胞滲出（圖4）。Western blot結果顯示，窒息組較正常組心肌β1、β2受體相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（圖5）。提示，窒息導致心肌β1、β2受體表達明顯下降。

圖1 正常小鼠心肌β1受體表達變化（400×，免疫組化染色）

圖2 正常小鼠心肌組織β1、β2受體相對表達量（n=6）

圖3 正常小鼠心肌β2受體表達變化（400×，免疫組化染色）

圖4 兩組小鼠心肌β受體表達比較（CTL：正常組；AS：窒息組；400×，免疫組化染色）

圖5 兩組小鼠心肌組織β1、β2受體相對表達量（CTL：正常組；AS：窒息組；n=6）

2.3 干預組小鼠心肌β受體表達變化 與正常組28 d小鼠相比，干預組及窒息組小鼠心肌組織β1、β2受體相對表達量均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。干預組28 d小鼠心肌組織β1、 β2受體相對表達量相比于窒息組有升高趨勢，提示藥物干預β1、β2受體表達有恢復趨勢（圖6）。28 d的小鼠中，窒息組較正常組HW/BW升高，干預組較窒息組HW/BW降低，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）（圖7）；三組心率無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）（圖8）。

3 討論

本研究結果顯示，出生3～28 d，正常小鼠β受體表達發(fā)生動態(tài)變化，β2受體下調，β1受體上調。未成熟心肌細胞表達以β2受體為主，隨著心臟發(fā)育，β2受體下調，β1受體上調，直到成熟，以β1受體為主。而且成熟心肌細胞也存在著動態(tài)變化，有學者發(fā)現，老年人β2受體進一步下調[5]。未成熟心肌細胞、成熟心肌細胞甚至衰老心肌細胞中β受體均不斷變化。

圖6 三組小鼠心肌組織β1、β2受體相對表達量（CTL：正常組；AS：窒息組；FEN：干預組；n=6）

圖7 三組小鼠HW/BW隨時間變化（n=6）

圖8 三組小鼠心率隨時間變化（n=6）

同時選取新生3 d小鼠，窒息處理，結果顯示，較正常小鼠，窒息小鼠心肌β1、β2受體下調。大部分學者在進行成年大鼠、小鼠心肌缺血缺氧損傷研究時發(fā)現，β1受體表達下調明顯，而β2受體表達變化不明顯。有學者培養(yǎng)的新生1～3 d小鼠心肌原代細胞，模擬心肌損傷后，發(fā)現β1、β2受體均下調[2]，新生1～3 d小鼠心肌屬于未成熟心肌細胞，與本研究結果相似。目前認為成熟心肌細胞損傷后β1表達下調的原因，主要是成熟心肌細胞β1受體數量及功能均占主要地位，當心臟損傷時，內源性交感神經系統(tǒng)激活，導致β1受體減少，而內源性兒茶酚胺對β2受體選擇性較低，因而下調不明顯。而在未成熟心肌細胞中，以β2受體介導心肌收縮為主，損傷后，β2受體出現下調，而且較β1受體更明顯。因此推測心肌細胞損傷后β受體變化與心肌細胞本身β受體表達量和功能相關。

由于本研究時間較短，存在以下不足之處：① 制備小鼠常壓窒息模型后，由于采血困難，未進行血氣分析及心肌酶檢測，尚不能明確窒息時小鼠血氧變化及心肌酶學變化；② β受體異常是否導致心肌結構和功能異常尚未闡述清楚。

[1] 吳益平,陳道中. 未成熟心肌的特點及未成熟心肌保護的研究進展[J]. 湖南醫(yī)學,2009,20(6):138-41.

[2] Leon LP,Srivastava S,Coetzee WA,et al. β 2-Adrenergic receptor agonists stimulate L-type calcium current independent of PKA in newborn rabbit ventricular myocytes[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,293(5):2826-35.

[3] Bristow MR,Anderson FL,Port JD,et al. Differences in β-adrenergic neuroeffector mechanisms in ischemic versus idiopathic dilated cardiomyopathy[J]. Circulation,1991,84(3):1024-39.

[4] XU Shu-zhen,WANG Cai-xia,ZHAO Wei,et al. Influence of Matrix Met-alloproteinase on myocardial Remodeling in Neonatal rats after Asphyxia[J]. Journal of Applied Clinical Pediatrics, 2006,21(18):1214-6.

[5] Khan m,Mohsin s,Avitabile D,et al. β-Adrenergic Regulation of Cardiac Progenitor Cell Death Versus Survival and Proliferation[J]. Circ Res,2013,112(3):476-86.

本文編輯：姚雪莉

Influence of asphyxia on myocardial β-adrenergic receptor in neonatal mice

Li Changjian*, Xi Shibing, Li Tao.*Children's Medical Center, Taihe Hospital of Hubei University of Medicine, Shiyan 442000, China.

Li Tao, E-mail: 317371983@qq.com

Objective To investigate the influence of asphyxia on expression of myocardial β-adrenergic receptor and interventional effect on β2-adrenoceptor agonist in neonatal mice. Methods Clean ICR mice (n=108, male or female) born for 3 d were randomly divided into normal group put into wide-mouth bottle without any treatment, asphyxia group prepared to ordinary pressure asphyxia model according to literature method, and intervention group given intraperitoneal injection of fenoterol 2 h before asphyxia (each n=36). The mice (n=6) were randomly chosen from each group on the 3rd d, 5th d, 7th d, 14th d, 21st d and 28th d for detecting electrocardiogram (ECG) and calculating heart weight index (HW/BW). The samples of cardiac tissue were collected for detecting the expressions of β1-adrenergic receptor and β2-adrenergic receptor by using immunohistochemistry technique and Western blot. Results The results of immunohistochemistry staining of β1-adrenergic receptor in normal mice showed that alignment myocardial cells, distinct nucleus and intact cell membrane without inflammatory cell infiltration. The staining of cell nuclear envelope and plasma darkened as the age of mice increased (from 3 d to 28 d). The results of Western blot showed that relative expression of β1-adrenergic receptor was significantly higher in 28-d mice than that in 3-d mice (P<0.05). The staining of β2-adrenergic receptor showed that staining of cell nuclear envelope and plasma became shallow as the age of mice increased. The results of Western blot showed that relative expression of β2-adrenergic receptor was significantly lower in 28 d mice than that in 3 d mice (P<0.05). The staining of β1-adrenergic receptor and β2-adrenergic receptor became shallow, and expressions of them decreased significantly in asphyxia group compared with normal group on the 3rd d, and there were malalignment myocardial cells and a few exudate inflammatory cells observed in asphyxia group. The results of Western blot showed that relative expressions of β1-adrenergic receptor and β2-adrenergic receptor decreased in asphyxia group compared with normal group (all P<0.05). The relative expressionsof β 1-adrenergic receptor and β 2-adrenergic receptor decreased in intervention group and asphyxia group compared with normal group on the 28th d (all P<0.05). The relative expressions of β1-adrenergic receptor and β 2-adrenergic receptor had an ascending trend in intervention group compared with asphyxia group on the 28th d. HW/BW increased in asphyxia group compared with normal group, and decreased in intervention group compared with asphyxia group on the 28th d (all P<0.05). Conclusion In the development of immature myocardial cells, the expression of β1-adrenergic receptor increases and expression of β2-adrenergic receptor decreases in normal mice. Asphyxia will induce the decreases of expressions of β1-adrenergic receptor and β2-adrenergic receptor, and fenoterol pretreatment to specific β2-adrenoceptor agonist will improve the recovery of expressions of β1-adrenergic receptor and β2-adrenergic receptor.

Asphyxia; Myocardial cells; β-adrenergic receptor; β2-adrenoceptor agonist

R4

A

1674-4055(2017)07-0800-04

湖北省衛(wèi)生計生科研基金(WJ2017M219)

1442000 十堰,湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院兒童醫(yī)療中心

李濤,E-mail:317371983@qq.com doi：10.3969/j.issn.1674-4055.2017.07.08