李啟紅

[摘要]目的 建立補(bǔ)益類中藥及保健品中非法添加西地那非、氨基他達(dá)拉非、伐地那非的快速檢測(cè)方法。方法 采用硅膠GF254薄層板，以乙醇-正己烷（70∶30）為展開劑，展開制備薄層斑點(diǎn)，對(duì)斑點(diǎn)滴加銀膠測(cè)定其SERS圖譜。結(jié)果 該方法用于檢測(cè)3種PDE5抑制劑的專屬性較好，并檢測(cè)出7種補(bǔ)益類中藥及保健品中有3種非法添加了那非類成分。結(jié)論 TLC-SERS聯(lián)用法簡(jiǎn)便、快速，可用于補(bǔ)益類中藥及保健品中非法摻入的3種PDE5抑制劑的快速檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞]中藥及保健品；非法添加；PDE5抑制劑；TLC-SERS

[中圖分類號(hào)] R917 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）07（c）-0085-04

Detection study for 3 kinds inhibitor of PDE5 illegally added into health products and traditional Chinese medicine using TLC-SERS

LI Qi-hong

Food and Drug Inspection Center of Dongying City in Shandong Province，Dongying 257091，China

[Abstract]Objective To establish a rapid screenning method for tonic traditional Chinese medicines and to products with illegally added chemicals such as Sidenafil，Amino Tadalafil，Vardenafil.Methods The thin-layer spots was prepared by slica gel GF254 thin layer developing in ethanol-hexane （70∶30），and SERS spectrum was determined via adding silver glue on it.Results This metod was applied to the detection of seven tonic traditional Chinese medicines and health products，and three were detected with sidenafil drμgs.Conclusion This TLC-SERS rapid method is simple and rapid，and can be use to detect the three PDE5 inhibitors illegally added into tonic traditional Chinese medicine and health products.

[Key words]Health products and traditional Chinese Medicine；Illegally added；Inhibitor of PDE5；TLC-SERS

中成藥、保健品非法添加化學(xué)藥品現(xiàn)象在我國(guó)屢見不鮮[1-2]，對(duì)食藥非法添加的專項(xiàng)整治一直以來都是各地市食藥監(jiān)督稽查的重點(diǎn)，西地那非、他達(dá)拉非、伐地那非均為磷酸二酯酶5抑制劑，是補(bǔ)腎類或緩解體力疲勞類保健食品中最常添加的3種壯陽類化學(xué)成分。臨床研究表明，其可以增強(qiáng)硝酸酯類藥物的降壓作用，過度服用會(huì)使心血管疾病患者受到嚴(yán)重傷害。

目前常用檢測(cè)方法有高效液相色譜法（HPLC）[3]、液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）[4-5]等。以上常規(guī)檢測(cè)方法復(fù)雜繁瑣，儀器復(fù)雜，不適于快速檢測(cè)；薄層色譜法（TLC）是目前快檢領(lǐng)域常用檢測(cè)方法，具有分離與鑒定的雙重功能，常用于定性初篩；表面增強(qiáng)拉曼光譜法（SERS）[6]是一種高靈敏、高專屬的新型譜學(xué)技術(shù)，對(duì)樣品純度有一定要求，將TLC法與SERS法相結(jié)合，利用TLC法對(duì)待檢成分富集，SERS法進(jìn)行定性鑒別，該方法靈敏度高，數(shù)據(jù)處理簡(jiǎn)單，己廣泛應(yīng)用于色素、農(nóng)藥殘留與污水中污染物等的檢測(cè)研究[7-8]。

本研究采用TLC-SERS法對(duì)中成藥、保健品非法添加化學(xué)藥品進(jìn)行研究[9-12]，優(yōu)化薄層條件及SERS檢測(cè)條件，以期建立非法添加化學(xué)藥品的快速有效的檢測(cè)方法，從而保障消費(fèi)者用藥安全。

1儀器與試劑

便攜式拉曼光譜儀（Metage，Opal3000），LDZ5-2型離心機(jī)（雷勃爾），TU-1901型紫外分光光度計(jì)（普析通用），CPX5800H-C型超聲波清洗器（美國(guó)branson），ZF-6型紫外分析儀（上海嘉鵬）。

西地那非、伐地那非、氨基他達(dá)拉非對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定研究院提供；硝酸銀、檸檬酸三鈉（AR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；GF254硅膠薄層板（青島海洋化工）；實(shí)驗(yàn)用水為重蒸餾水；補(bǔ)益類中藥及保健品包括百邦天元膠囊（20160802）、幸福來蛋白粉（201701001）、厚豐牌博旺膠囊（02160129）、美國(guó)一號(hào)膠囊（20151218）、喜力來膠囊（20151132）、安泰核酸原液（20160525）、龍邦原液（20160402），以上樣品均來自于東營(yíng)市食品藥品稽查局。

2.方法與結(jié)果

2.1溶液制備

2.1.1對(duì)照品溶液的制備 精密稱取西地那非、伐地那非、氨基他達(dá)拉非對(duì)照品10 mg，加入甲醇-水-氨水（75∶25∶1）溶液10 ml，超聲使溶解，即得。

2.1.2模擬陽性樣品溶液制備 取幸福來膠囊（經(jīng)檢測(cè)無非法添加）一粒，分別添加10 mg（參考西地那非臨床推薦劑量的1/10）上述對(duì)照品固體粉末，加甲醇-水-氨水（75∶25∶1）的溶液10 ml，超聲10 min，離心5 min（3000 r/min），取上清液備用。

2.1.3陰性樣品溶液制備 取幸福來膠囊一粒，加甲醇-水-氨水（75∶25∶1）的溶液10 ml，超聲10 min，離心取上清液備用。

2.2銀膠制備

銀納米溶膠采用微波加熱法配制[13]，精密稱取AgNO3固體37 mg，置于500 ml燒杯中，加超純水100 ml，加入1%檸檬酸三鈉溶液2.6 ml，置微波爐中加熱4 min，冷卻備用。

2.3檢測(cè)方法

取對(duì)照品溶液和樣品溶液各2 μl，點(diǎn)于GF254硅膠薄層板上，以乙醇-正己烷（70∶30）為展開劑，氨蒸氣預(yù)飽和10 min后展開，取出晾干，置254 nm紫外燈下檢視定位.在陽性樣品色譜條帶中與對(duì)照品相同處，處滴加銀膠溶液5 μl，采用拉曼光譜儀對(duì)點(diǎn)位進(jìn)行測(cè)量，其中掃描時(shí)間設(shè)置為10 s，激光功率為75 mW。

2.4銀膠的紫外可見光譜表征

銀納米粒子的特征可用紫外可見光譜譜峰的最大吸收位置來粗略表征，譜峰的波長(zhǎng)越大，相應(yīng)的粒子半徑也越大[7]；自制銀納米粒子溶膠的紫外可見光譜中銀膠溶液在423 nm處有最大吸收，可知該銀膠粒徑較小且均為球形納米粒子[14-15]。

圖 1 銀膠UV-Vis光譜

2.5銀膠滴加量的選擇

分別在薄層板三唑侖斑點(diǎn)上滴灑2、5、10、20、50 μl納米銀溶膠后，測(cè)其拉曼光譜，以其1169 cm-1處峰高為參考，具體見圖2。結(jié)果顯示，隨著納米銀溶膠量的加大，樣品分子拉曼圖譜逐漸增大至恒定，樣品分子拉曼光譜特征更加清晰。滴加量的增加有利于銀膠與樣品分子的結(jié)合，形成更多SERS“熱點(diǎn)”，同時(shí)激光加熱揮發(fā)部分水分使銀膠濃度相對(duì)增大，使樣品分子的拉曼峰加強(qiáng)，但由于薄層板的負(fù)載問題，滴加過多的銀膠會(huì)形成咖啡環(huán)效應(yīng)，擴(kuò)散帶走部分樣品分子，使得測(cè)試結(jié)果不準(zhǔn)確（建議測(cè)量咖啡環(huán)邊緣），因此本實(shí)驗(yàn)選擇滴灑5 μl納米銀溶膠。

圖2 銀膠滴加量的影響

2.6薄層色譜條件的優(yōu)化

薄層色譜的展開效果是檢測(cè)的重要干擾因素之一，因而本研究對(duì)薄層色譜的條件進(jìn)行了優(yōu)化，參照相關(guān)文獻(xiàn)方法[8]，選擇了乙醇-正己烷（70∶30）分離效果較好且試劑毒性較低。西地那非、氨基他達(dá)拉非、伐地那非的RF值分別為0.51、0.70、0.85，模擬陽性樣品溶液中其他組分對(duì)三種對(duì)照品斑點(diǎn)無干擾，陰性樣品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上無斑點(diǎn)（圖3）。

1.西地那非；2.氨基他達(dá)拉非；3.伐地那非；4.模擬陽性樣品；5.陰性樣品

圖3 模擬陽性樣品和對(duì)照品的薄層色譜

2.7最低檢測(cè)限考察

精密稱取三種對(duì)照品適量，按照“2.1”項(xiàng)下方法制備摻偽量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）分別為2.00%、1.00%、0.40%、0.20%、0.10%、0.05%、0.01%的模擬陽性樣品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下方法檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示。西地那非、氨基他達(dá)拉非、伐地那非的最低檢出限[信噪比（S/N）3∶1]分別為0.05%、0.10%、0.05%。對(duì)應(yīng)的點(diǎn)樣沉積量分別為0.05、0.10、0.05 μg。

2.8模擬陽性樣品檢測(cè)

將實(shí)驗(yàn)室制備的模擬壯陽陽性樣品按照“2.3”項(xiàng)下的方法進(jìn)行檢測(cè)，得到結(jié)果如圖5所示。西地那非的SERS特征峰為1583、1528、1485、1399、1234、927、816、649，氨基他達(dá)拉非的SERS特征峰為1601、1500、1367、1327、1246、1166、1112、1008、927、870、817、793、757、718、689、623、584、533、477、363，伐地那非的SERS特征為1625、15871419、1396、1300124、930、817、650、542，均可對(duì)應(yīng)于其固體樣品的拉曼光譜中的特征信號(hào)。

采用微波加熱法制備的銀膠獲得的3種PDE5抑制劑的SERS圖譜，含有豐富的特征信息與其固體拉曼圖譜一致，可用于樣品的定性鑒別，準(zhǔn)確性較高，進(jìn)一步提高了對(duì)中藥及保健品中非法添加3種PDE5抑制劑檢測(cè)的專屬性。

2.9真實(shí)樣品檢測(cè)

取百邦天元膠囊、安泰核酸原液、幸福來蛋白粉、博旺膠囊、美國(guó)一號(hào)膠囊、龍邦原液、喜力來膠囊7種樣品進(jìn)行檢測(cè)，從薄層色譜圖（圖6）中可看出，樣品4（美國(guó)一號(hào)）和樣品6（龍邦原液）與西地那非對(duì)照品展開斑點(diǎn)Rf值相近處出現(xiàn)可疑斑點(diǎn)，樣品7（喜力來膠囊）與氨基他達(dá)拉非對(duì)照品展開斑點(diǎn)Rf值相近處出現(xiàn)可疑斑點(diǎn)?？沙醪秸J(rèn)定樣品4（美國(guó)一號(hào)）和樣品6（龍邦原液）中疑似添加了西地那非，樣品7中（喜力來膠囊）疑似添加了氨基他達(dá)拉非。對(duì)上述可疑斑點(diǎn)滴加銀膠進(jìn)行SERS考察，并與相應(yīng)對(duì)照品的SERS譜進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，樣品4（美國(guó)一號(hào)）、樣品6（龍邦原液）樣品的SERS譜圖與西地那非對(duì)照品相一致，樣品7（喜力來膠囊）的SERS譜圖與氨基他達(dá)拉非對(duì)照品相一致。

3討論

在對(duì)上述7種真實(shí)樣品檢測(cè)過程中，薄層展開在紫外254 nm下檢視，發(fā)現(xiàn)7號(hào)樣品在與氨基他達(dá)拉非對(duì)照品相同Rf值處的斑點(diǎn)顯色微弱，肉眼幾乎不能辨別，無法定性。采集其SERS譜才出現(xiàn)明顯的氨基他達(dá)拉非對(duì)照品的特征峰，可能是氨基他達(dá)拉非量過少，中藥基質(zhì)有干擾，導(dǎo)致目視無法定性。因此，本研究在其他樣品與對(duì)照品Rf值相同處滴加銀膠采集SERS譜，以降低漏檢風(fēng)險(xiǎn)，最終無明顯對(duì)照品特征峰，并通過HPLC方法進(jìn)一步檢測(cè)，判定只有4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)樣品有壯陽類成分添加，從而證明該方法的準(zhǔn)確性。

本文建立的TLC-SERS方法成功檢測(cè)出中藥及保健品中非法添加3種PDE5抑制劑成分，具有良好的可行性，預(yù)處理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，對(duì)非法添加的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)有一定的參考意義。

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（收稿日期：2017-03-31 本文編輯：祁海文）