張俏　史文靜　杜文娟

[摘要] 目的 研究D-900陰離子交換樹脂對救必應(yīng)中紫丁香苷的純化工藝。 方法 采用高效液相色譜法和紫外分光光度法，以紫丁香苷保留率和溶液脫色率為指標(biāo)，對樹脂純化條件進行考察。 結(jié)果 D-900陰離子交換樹脂純化最佳工藝為樹脂重量和樣品體積比為1∶5，樹脂柱徑高比為1∶5，上柱流速為2 BV/h，在此條件下紫丁香苷保留率達(dá)80%以上，溶液脫色率達(dá)30%以上。 結(jié)論 紫丁香苷粗分離液通過樹脂純化的工藝，簡單易行。

[關(guān)鍵詞] D-900陰離子交換樹脂；救必應(yīng)；紫丁香苷；純化

[中圖分類號] R284 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（a）-0016-04

[Abstract] Objective To research the method for purification technology of syringin in Cortex Ilicis Rotundae by D-900 resin. Methods The purification conditions of the resin were investigated by high performance liquid chromatography and ultraviolet spectrophotometry. The retention rate of syringin and the decolorization rate of the solution were investigated. Results The purification parameters of D-900 resin was as following： resin weight and sample volume ratio of 1∶5， resin column diameter and high ratio of 1∶5， adsorption velocity of 2 BV/h. The retention rate of syringin was above 80% and the decolorization rate of the solution was above 30% under these conditions. Conclusion The purification technology of syringin is simple and feasible.

[Key words] D-900 resin； Cortex Ilicis Rotundae； Syringin； Purification

救必應(yīng)又名白木香、白皮冬青、熊膽木等，為冬青科植物鐵冬青（Ilex rotunda Thunb.）的干燥樹皮[1]，始載于《嶺南采藥錄》，稱“白木香、味苦、清熱毒”，其味苦，性寒，歸肺、胃、大腸、肝經(jīng)，具有清熱解毒、利濕止痛等功效，常用于咽喉腫痛、風(fēng)濕痹痛、濕疹等，《中國藥典》（2015年版一部）收載了該藥材。據(jù)文獻(xiàn)報道，救必應(yīng)中所含主要化學(xué)成分為黃酮苷、酚類、三萜苷等，大多具有清熱解毒、消腫止痛的功效[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，紫丁香苷、長梗冬青苷以及其總黃酮類、總皂苷類成分為救必應(yīng)主要有效成分，此類成分在心血管疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、抗炎抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等方面表現(xiàn)出了極強的生理活性[3-12]。并且紫丁香苷和長梗冬青苷在救必應(yīng)中含量很高，其中紫丁香苷在藥典中的含量限度是同為藥典收載品種的刺五加紫丁香苷含量限度的20倍，具有開發(fā)中藥一類新藥的資源優(yōu)勢[13-19]。

本實驗采用D-900陰離子交換樹脂對救必應(yīng)中紫丁香苷的純化工藝進行研究，通過對救必應(yīng)中紫丁香苷粗分離液色素的靜態(tài)吸附、動態(tài)吸附性能等因素進行考察[20-29]，以確定樹脂脫色的最佳工藝參數(shù)，為救必應(yīng)中紫丁香苷純化研究提供參考。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料與試劑

救必應(yīng)藥材（產(chǎn)地廣西，購自陜西鐸耀中藥飲片有限公司，經(jīng)陜西中藥研究所趙新禮研究員鑒定）經(jīng)檢驗均符合《中國藥典》（2015年版）有關(guān)規(guī)定；紫丁香苷對照品（批號：111574-200603，供含量測定用，中國食品藥品檢定研究院）；D-900型大孔吸附樹脂（批號：20140410，陜西藍(lán)深特種樹脂有限公司提供）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher scientific）；甲醇（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（可變波長紫外檢測器，美國安捷倫）；Cary50紫外分光光度計（美國瓦里安公司）；電子分析天平（AG-135、PB3002-S，梅特勒-托利多儀器有限公司）；KH3200SP超聲波清洗機（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；純水器（美國Millipore）。

2 方法與結(jié)果

2.1 考察指標(biāo)

2.1.1 紫丁香苷保留率 在相應(yīng)的色譜條件下檢測紫丁香苷含量，通過樣品中紫丁香苷含量的變化考察樹脂的吸附效果。紫丁香苷保留率=樣品脫色后紫丁香苷含量/樣品脫色前紫丁香苷含量×100%。

2.1.2 脫色率 將紫丁香苷粗分離液加水稀釋25倍，在200～800 nm波長范圍內(nèi)對其進行光譜掃描，確定適合的檢測波長，通過樣品吸光度變化考察樹脂的脫色效果[30]。脫色率=（樣品脫色前溶液吸光度-樣品脫色后溶液吸光度）/樣品脫色前溶液吸光度×100%。

2.2 紫丁香苷含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm， 5 μm）；流動相：乙腈-水（1∶9）[31]；檢測波長265 nm；理論塔板數(shù)按紫丁香苷峰計算應(yīng)不低于5000。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取紫丁香苷對照品7.5 mg，置50 mL量瓶中，加入甲醇制成0.15 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 紫丁香苷粗分離液的制備 取救必應(yīng)藥材2 kg，加30%乙醇10倍量，提取2次，每次1.5 h，提取液減壓濃縮，干燥，粉碎，得救必應(yīng)浸膏粉480 g，備用。取救必應(yīng)浸膏粉300 g，加9000 mL熱水充分?jǐn)嚢?，減壓抽濾，取續(xù)濾液，經(jīng)大孔吸附樹脂吸附后，5%乙醇溶液除雜，30%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液（紫丁香苷含量1.614 mg/mL），即得。

2.2.4 供試品溶液制備及含量測定 精密吸取樣品溶液適量，加水稀釋10倍，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)法計算紫丁香苷含量。

2.3 吸光度測定

取“2.2.4”項下供試品溶液加水稀釋2.5倍，以相應(yīng)的試劑為空白，采用紫外-可見分光光度法（《中國藥典》2015年版四部通則0401），在已選擇的波長處測定吸光度，即得。

2.4 樹脂的預(yù)處理

取D-900樹脂適量，將其置于相當(dāng)于被處理樹脂體積2倍量的飽和食鹽溶液中，浸泡20 h，放盡食鹽水，用水漂洗干凈（至排出水不帶黃色）；然后將其置于5% HCl溶液中，浸泡6 h，放盡酸液，用水清洗至中性；最后將其置于3% NaOH溶液中，浸泡6 h，放盡堿液，用水清洗至中性，備用。

2.5 紫丁香苷粗分離液色素的脫色考察

2.5.1 D-900樹脂對紫丁香苷粗分離液色素的靜態(tài)吸附試驗 精確稱取預(yù)處理好的樹脂2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 g，置于錐形瓶中，分別精密加入25 mL紫丁香苷粗分離液，振蕩4 h后，過濾，取濾液置于250 mL量瓶，加水定容，測定其紫丁香苷含量。分別取該溶液20 mL加水定容至50 mL，測定該溶液脫色后的吸光度。分別計算紫丁香苷保留率和脫色率，結(jié)果見圖1。

由圖1可見，呈現(xiàn)出隨著樹脂用量增加，所得樣品溶液脫色率逐漸升高、紫丁香苷保留率逐漸降低的趨勢，為后續(xù)試驗提供一定的依據(jù)，并希望通過進一步的研究尋求兩指標(biāo)的平衡點。

2.5.2 D-900樹脂對紫丁香苷粗分離液色素的動態(tài)吸附試驗 將預(yù)處理好的樹脂10 g以濕法裝入層析柱中，紫丁香苷粗分離液以流速2 BV/h通過交換柱，收集流出液，每5毫升一份，加水定容至50 mL，測定其紫丁香苷含量，取該溶液20 mL加水定容至50 mL，測定溶液脫色后的吸光度。分別計算紫丁香苷保留率和脫色率，結(jié)果見圖2。

由圖2可見，D-900樹脂動態(tài)吸附脫色率由100%逐漸降低，在第10號其趨勢平穩(wěn)，其后實驗中脫色率無明顯變化；紫丁香苷保留率逐漸升高，在第9號其趨勢平穩(wěn)，接近100%。綜合考慮，確定D-900樹脂在該條件下上樣量為50 mL。

2.5.3 樹脂徑高比考察 將預(yù)處理好的樹脂以濕法裝入層析柱中，徑高比分別為1∶3、1∶5、1∶8、1∶10、1∶15，各加入一定量的紫丁香苷粗分離液，以流速2 BV/h通過樹脂交換柱，具體見表1。分別收集流出液加水定容，測定其紫丁香苷含量。精密吸取該溶液20 mL，加水定容至50 mL，測定溶液脫色后的吸光度，分別計算紫丁香苷保留率和脫色率，結(jié)果見圖3。

由圖3可見，隨徑高比的增加，脫色率小幅提升，保留率略有下降。因此，依據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果及常規(guī)生產(chǎn)條件，確定D-900樹脂徑高比一般為1∶5左右。

2.5.4 流速考察 將預(yù)處理好的樹脂10 g以濕法裝入層析柱（柱內(nèi)徑1.6 cm）中，加入紫丁香苷粗分離液50 mL，分別以流速1、2、3、4 BV/h通過樹脂交換柱，收集各柱流出液，并加水定容至500 mL，測定紫丁香苷含量。精密吸取該溶液20 mL，加水定容至50 mL，測定溶液脫色后的吸光度，分別計算紫丁香苷保留率和脫色率，結(jié)果見圖4。

由圖4可見，隨著流速的加快，脫色率呈現(xiàn)下降趨勢，紫丁香苷保留率略有升高。因此，依據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果及常規(guī)生產(chǎn)條件，確定上樣液流速為2 BV/h。

2.6 工藝驗證

將預(yù)處理好的樹脂10 g以濕法裝入層析柱（柱內(nèi)徑1.6 cm）中，平行3份，分別加入紫丁香苷粗分離液50 mL，以流速2 BV/h通過樹脂交換柱，收集各柱流出液加水定容至500 mL，測定其紫丁香苷含量。精密吸取該溶液20 mL，加水定容至50 mL，測定溶液脫色后的吸光度，計算紫丁香苷保留率分別為83.92%、85.14%、85.56%，脫色率分別為33.93%、32.20%、35.30%。結(jié)果表明，采用D-900樹脂純化救必應(yīng)中紫丁香苷的工藝重現(xiàn)性良好。

3 討論

3.1 柱洗脫方法對比

D-900陰離子交換樹脂主要用于天然藥物及糖類食品的脫色精制，其最大優(yōu)點是可在醇溶液的情況下直接上柱脫色，這樣既可簡化工序，又減少目標(biāo)成分的損失。筆者曾對同種大孔樹脂（制備粗分離液時所用）二次上柱分離和上D-900脫色柱的效果進行比較，雖然所得濃縮液中紫丁香苷含量相差不大，但二次上柱洗脫分離明顯步驟復(fù)雜；其濃縮液仍呈棕褐色，而上脫色柱濃縮液呈深青色；從直接析出晶體的質(zhì)量上，明顯上脫色柱遠(yuǎn)高于二次上柱分離的效果，證明本實驗采用D900樹脂純化救必應(yīng)中紫丁香苷的工藝可行性強。

3.2 D-900樹脂紫丁香苷解吸附

通過保留率數(shù)據(jù)可知，樹脂柱上殘余約15%的紫丁香苷，考慮加洗脫液解吸附，以保證產(chǎn)品收率。經(jīng)對不同濃度乙醇溶液洗脫效果考察，最終確定3倍量30%乙醇溶液為最佳樹脂殘留紫丁香苷解吸附的洗脫液及體積。并經(jīng)考察，將兩部分洗脫液合并，可使?jié)饪s液中紫丁香苷保留率高達(dá)98%以上，且脫色效果良好，濃縮液析晶穩(wěn)定，考慮將該環(huán)節(jié)納入純化工藝。

3.3 樹脂循環(huán)使用周期

D-900樹脂具有再生效率高、洗脫效果好等特點。但隨著樹脂的反復(fù)使用，樹脂的吸附性能會有所下降，通過對樹脂循環(huán)使用次數(shù)考察，該樹脂使用6個周期后，雖然脫色液中紫丁香苷含量不受影響，但其脫色效果下降了近40%，需要對樹脂進行再生處理。

3.4 資源開發(fā)

救必應(yīng)藥材的原植物在我國南方各地區(qū)分布廣泛，來源豐富，現(xiàn)已運用該藥材研發(fā)出救必應(yīng)胃痛片、腹可安片、復(fù)方救必應(yīng)膠囊等多種中成藥，但其有效部位尚未得到充分開發(fā)。目前紫丁香苷的分離純化工藝僅能滿足制備不同含量的有效部位及小劑量單體，并且普遍存在紫丁香苷的流失大、溶劑殘留毒性大、純化過程漫長、工藝復(fù)雜、成本較高等問題。為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本實驗?zāi)康脑谟谔峁┮环N制備紫丁香苷的純化方法，該方法操作簡單、安全有效，制備的紫丁香苷收率大、純度高，力求研制出工藝簡單、適合工業(yè)大生產(chǎn)的紫丁香苷分離純化工藝，并將其進一步開發(fā)利用。

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（收稿日期：2017-03-10 本文編輯：程 銘）