夏滿瓊　徐瑤　王玉霞

[摘要] 目的 探討“焦三仙”炮制過程中5-羥甲基糠醛（5-HMF）的變化規(guī)律。 方法 分別于不同炮制時間炒制“焦三仙”樣品，采用高效液相色譜法（HPLC）檢測各樣品中5-HMF含量。Agilent C18，色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），乙腈-水（8∶92）為流動相，檢測波長為283 nm。 結(jié)果 5-HMF在0.2～64.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r = 0.9997），平均回收率為99.74%，RSD值為1.37%。其中山楂、麥芽分別炒制8 min和6 min后5-HMF含量急劇升高，六神曲5-HMF含量則無明顯變化。 結(jié)論 “焦三仙”在炮制過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生了共性成分5-HMF；山楂和麥芽5-HMF含量隨炮制時間延長而增加，六神曲變化不明顯。

[關(guān)鍵詞] 焦三仙；美拉德反應(yīng)；5-羥甲基糠醛；高效液相色譜法

[中圖分類號] R284.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（a）-0008-05

[Abstract] Objective To investigate the change rule of 5-hydroxymethyl furfural （5-HMF） in the processing of "Jiao Sanxian". Methods The samples of "Jiao Sanxian" were fired with different processing time and the contents of 5-HMF in each sample were detected by high performance liquid chromatography （HPLC）. The HPLC analysis was performed on an Agilent C18， column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） and the mobile phase consisted acetonitrile-water （8∶92）， the detection wavelength was set at 283 nm. Results The linear range of 5-HMF was in the range of 0.2-64.0 μg/mL （r = 0.9997）， average recovery was 99.74%， and RSD was 1.37%. The contents of 5-HMF were increased remarkably at the 8 min and 6 min for Fructus Crataegi and Fructus Hordei Germinatus， respectively， while it showed a steady pattern for medicated leaven. Conclusion "Jiao Sanxian" has a Maillard reaction in the processing， which produces common element 5-HMF. The contents of 5-HMF in Fructus Crataegi and Fructus Hordei Germinatus are increased obviously with the extension of processing time， while it is not obvious for medicated leaven.

[Key words] Jiao Sanxian； Maillard reaction； 5-hydroxymethyl furfural； High performance liquid chromatography

中醫(yī)處方中常見到“一味”藥——焦三仙，指的是焦山楂、焦麥芽及焦六神曲。這三味藥用于消食化積時療效突出，又因它們各具特色療效，臨床上常被合用并被冠以“焦三仙”的美名，意在用于消化的“仙藥”。美拉德反應(yīng)主要是指氨基酸、還原糖和蛋白質(zhì)之間的復(fù)雜反應(yīng)[1-2]。5-羥甲基糠醛（5-HMF）為糖的熱降解產(chǎn)物，是美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物之一，現(xiàn)已成為中藥炮制原理研究的熱點之一[3-5]。目前，針對“焦三仙”炮制過程中美拉德反應(yīng)多集中在炒制前后指標成分的變化[6-9]，而對其炮制過程中的共性成分變化報道較少。已有文獻報道5-HMF為焦香氣味的主要成分，具有一定的健脾作用[7]。本研究以5-HMF為指標，研究三味中藥在炮制過程中的變化，為“焦香醒脾”理論提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 試藥

生山楂、生麥芽飲片均購自四川北京同仁堂有限責任公司，批號分別為20150514、20150118；生六神曲飲片，購于四川弘升藥業(yè)有限公司，批號20150212；5-HMF對照品購于成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-15051212，純度≥98%，供含量測定用；甲醇，乙腈，HPLC級，美國Fisher公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

電子天平：艾德姆衡器（武漢）有限公司；LX-02利祥多功能粉碎機：上海江信科技有限公司；LC-20AT液相色譜儀，CBM-102色譜工作站：日本島津公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 “焦三仙”不同炮制品的制備

分別取200 g凈山楂、凈麥芽、凈六神曲，參照《中國藥典》（2015年版）四部炒法，控制火候為中火（380～450℃），分別炒至0、2、4、6、8、10、12 min，冷卻，粉碎，過60目篩，備用。本研究以山楂為模型藥物，建立5-HMF的含量測定方法并開展方法學研究。山楂炮制品分別編號為S0、S1、S2、S3、S4、S5、S6。

2.2 “焦三仙”炮制過程中5-HMF的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取5-HMF對照品20 mg，置于100 mL量瓶中，制成每毫升含0.2 mg的溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取山楂樣品S0～S6各0.5 g，加入40%甲醇溶液20 mL，超聲40 min，冷卻后補足質(zhì)量，搖勻，過微孔濾膜，制成供試品溶液。

2.2.3 色譜條件 色譜柱Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相乙腈-水（8∶92），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長283 nm，進樣量10 μL。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密稱取5-HMF對照品5 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度搖勻，作為標準曲線溶液。以峰面積為縱坐標（Y）、濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線（圖1），標準曲線方程為：Y = 1.5650×105X-5431（r = 0.9997），5-HMF在0.2～64.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖2）。

2.2.5 精密度實驗 精密吸取5-HMF對照品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，分別測定峰面積，RSD值為1.37%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性實驗 取供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h后進樣，測定峰面積值，計算RSD值為0.64%，表明5-HMF對照品在24 h內(nèi)檢測穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性實驗 取山楂樣品（S5）0.5 g，按“2.2.2”項條件制備供試品溶液，平行6份，按“2.2.3”項色譜條件測定，平均含量為0.81 mg/g，RSD值為0.65%（n = 6），表明本研究方法重復(fù)性良好（圖3）。

2.2.8 加樣回收實驗 精密稱取山楂樣品（S5）6份，每份約0.25 g，分別加入5-HMF對照品溶液6.5 mL（C = 32 μg/mL），按“2.2.3”項色譜條件，進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

2.2.9 “焦三仙”樣品測定 按“2.2.3”色譜條件檢測山楂、麥芽和六神曲各炮制品中5-HMF含量，結(jié)果顯示，“焦三仙”中山楂、麥芽和六神曲在炮制過程中均產(chǎn)生5-HMF。其中，山楂中的5-HMF含量隨時間變化較明顯，隨著炒制時間的延長，5-HMF含量呈上升趨勢，炮制至8 min時出現(xiàn)“拐點”，并在10 min時達到最高值，隨后又出現(xiàn)下降趨勢。麥芽中的5-HMF含量在炮制6 min時開始明顯上升，10 min后含量達到較高值，在12 min時達到最高值。六神曲中的5-HMF含量隨著炮制的進行而緩慢增加，沒有出現(xiàn)明顯的“拐點”。見表2。

3 討論

3.1 “焦三仙”炮制共性成分分析

通過測定發(fā)現(xiàn)，山楂、麥芽、六神曲在炮制前含少量或不含5-HMF，經(jīng)過不同時間的炒制后，5-HMF含量逐漸增加，可見5-HMF為“焦三仙”炮制過程中的共性成分之一，可證明“焦三仙”在炮制過程中發(fā)生了美拉德反應(yīng)?！敖谷伞痹谂谥七^程中出現(xiàn)了焦香氣味，并呈焦褐色，與美拉德反應(yīng)最終產(chǎn)物類黑素，并伴有焦香氣味基本一致。

3.2 “焦三仙”炮制過程中5-HMF含量對比分析

“焦三仙”炮制過程中產(chǎn)生的5-HMF含量不同，與美拉德反應(yīng)發(fā)生所需的糖類和氨基酸有關(guān)。其中，山楂中含有較多糖類[10]和氨基酸，結(jié)果顯示，山楂產(chǎn)生的5-HMF含量最高，與其所含葡萄糖和果糖關(guān)系最密切，果糖結(jié)構(gòu)類型為呋喃型，較容易脫水合成5-HMF，而葡萄糖結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，其結(jié)構(gòu)中的氫鍵需在負離子作用下發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移，使α-葡萄糖旋光異構(gòu)成β-葡萄糖，再生成烯醇式化合物，從而使葡萄糖異構(gòu)成果糖，再由果糖脫水生成5-HMF，故葡萄糖生成5-HMF較果糖復(fù)雜[11]。山楂在炮制10 min時含量達到最大值，可能是山楂中葡糖糖此時全部生成5-HMF有關(guān)，與劉苗苗等[12]報道的結(jié)果一致。

麥芽中也含有糖類[13]和少量氨基酸[14-15]，由于麥芽中糖類成分比較單一，與山楂相比，麥芽炮制后產(chǎn)生5-HMF含量較少，與已有文獻報道一致[16]。六神曲中幾乎不含糖類和氨基酸，美拉德反應(yīng)程度較小，故六神曲炮制中產(chǎn)生的5-HMF含量較低。同時，美拉德反應(yīng)會產(chǎn)生焦香氣味，結(jié)果顯示反應(yīng)劇烈程度依次為山楂>麥芽>六神曲，而實際山楂炒制過程中所產(chǎn)生的焦香氣味最濃烈，六神曲最微弱，與本研究結(jié)果一致。

3.3 山楂、麥芽5-HMF含量出現(xiàn)“拐點”原因分析

本研究中，山楂炒制0～8 min和麥芽炒制0～6 min過程中，5-HMF含量變化平緩，可推測此階段為美拉德反應(yīng)的第一階段。隨著炒制時間的延長，山楂炮制至8 min時，5-HMF含量出現(xiàn)“拐點”并急劇增加，可推測炒制8 min是美拉德反應(yīng)的關(guān)鍵時間點，此時的溫度、時間等條件有利于美拉德反應(yīng)的快速發(fā)生，參與反應(yīng)的還原糖和氨基酸大量消耗，5-HMF含量急劇增加，此階段可能為美拉德反應(yīng)的第二階段，其反應(yīng)產(chǎn)物以5-HMF為主，而10 min后可能為美拉德反應(yīng)的第三階段，此階段反應(yīng)產(chǎn)物以5-HMF為輔，故有所下降。同理，麥芽在生品時含有微量的5-HMF，表明麥芽在干燥過程中會發(fā)生美拉德反應(yīng)，0～6 min為反應(yīng)的第一階段，炮制至6 min時出現(xiàn)拐點，5-HMF含量急劇增加，此階段可能為美拉德反應(yīng)的第二階段。山楂、麥芽在炮制過程中5-HMF含量的這種變化與文獻[17]報道的美拉德反應(yīng)結(jié)果基本一致。

“焦三仙”作為臨床常用中藥，檢測其炮制過程中5-HMF的含量變化，對探究“焦三仙”與美拉德反應(yīng)之間的關(guān)系具有一定的參考意義。

[參考文獻]

[1] Hodge JE. Dehydrated foods，chemistry of browning reactions in model systems [J]. J Agric Food Chem，1953，1（15）：928-943.

[2] 周逸群，賀福元，楊巖濤，等.美拉德反應(yīng)研究現(xiàn)狀及對中藥炮制和制劑工藝研究方法的影響[J].中草藥，2014， 45（1）：125-130.

[3] 趙穎，張璐欣，李越.5-羥甲基糠醛的研究概況[J].醫(yī)學綜述，2016，22（17）：3431-3434.

[4] 趙玲，周臣清，朱婉清，等.5-羥甲基糠醛的生物安全性和生物活性研究進展[J].食品工業(yè)科技，2016，37（11）：372-377.

[5] 劉月新，潘雪，鄒茜，等.探討5-羥甲基糠醛在中藥及復(fù)方中的存在意義[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2013，7（15）：3-5.

[6] 劉玉杰，仲瑞雪，楊添均，等.中藥炒焦物質(zhì)基礎(chǔ)及其質(zhì)量評價研究思考與實踐[J].中國中藥雜志，2014，39（2）：338-342.

[7] 張韻.山楂炒焦機理及其焦香氣味物質(zhì)基礎(chǔ)研究[D].成都：西南交通大學，2016.

[8] 張韻，萬軍，周霞.炒焦對山楂中氨基酸含量的影響分析[J].氨基酸和生物資源，2013，35（3）：28-31.

[9] 黎量，楊詩龍，胥敏，等.基于顏色及成分動態(tài)變化的山楂炮制機理初探[J].中成藥，2015，37（7）：1530-1533.

[10] 齊秀娟，李作軒，徐善坤.山楂果實中可溶性糖與果皮色素的關(guān)系[J].果樹學報，2005，22（1）：81-83.

[11] Li C，Zhang Z，Zhao ZK. Direct conversion of glucose and cellulose to 5-hydroxymethylfurfural in ionic liquid under microwave irradiation [J]. Tetrahedron Letters，2009，50（38）：5403-5405.

[12] 劉苗苗，陳祥勝，陳琪瑤，等.蒼術(shù)麩炒過程中5-羥甲基糠醛的轉(zhuǎn)化機制研究[J].中草藥，2016，47（8）：1327-1331.

[13] 王云庭，杜杰，金鋒，等.不同產(chǎn)地六神曲麥芽低聚糖酶活力實驗比較研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2016，18（7）：814-817.

[14] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：156.

[15] 凌俊紅.麥芽的化學成分及炮制學研究[D].沈陽：沈陽藥科大學，2005.

[16] 楊華生，吳維剛，譚麗霞，等.麥芽炒制過程中近紅外在線監(jiān)測模型的建立及“炒香”終點判斷研究[J].中國中藥雜志，2017，42（3）：478-485.

[17] 楊華生，譚麗霞，吳維剛，等.麥芽炒香過程中有效成分與無效成分動態(tài)變化規(guī)律研究[J].中國中藥雜志，2016， 41（23）：4382-4388.

（收稿日期：2017-03-22 本文編輯：張瑜杰）