朱敬麗 路趙碩 吳越 徐彥吉 姚建 王鑫鑫 王德才

銅、鐵、鋅、鋁通過Akt/GSK-3β信號通路誘導SH-SY5Y細胞的凋亡

朱敬麗 路趙碩 吳越 徐彥吉 姚建 王鑫鑫 王德才

目的 探究銅、鐵、鋅、鋁對人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)的神經毒性作用和機制。 方法 采用50、200、400 μmol/L CuSO4,1、2、4 mmol/L FeSO4和AlCl3,50、100、200 μmol/L ZnSO4分別作用于SH-SY5Y細胞,通過噻唑藍(MTT)法檢測細胞生長活性。采用ELISA法檢測細胞內Akt、磷酸化Akt(Ser473)、GSK-3β及磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白的表達。采用Annexin-V/PI雙染法檢測細胞凋亡率。 結果 銅、鐵、鋅、鋁能明顯抑制細胞活性,并呈劑量依賴性,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。鐵和鋁各劑量組Akt表達較對照組降低(P<0.05);各劑量組GSK-3β表達無明顯差異(P>0.05);各劑量組Akt及GSK-3β的磷酸化水平低于對照組(P<0.05)。細胞凋亡率隨染銅、鐵、鋅、鋁劑量的加大而升高(P<0.05)。 結論 銅、鐵、鋅、鋁可引起神經細胞毒性,抑制Akt活性,激活蛋白激酶GSK-3β,導致細胞凋亡。

銅; 鐵; 鋅; 鋁; SH-SY5Y神經細胞; Akt; GSK-3β

阿爾茨海默病(AD),是一種以腦內膽堿能神經元的大量缺失和死亡為特點的神經退行性疾病。PI3K/Akt通路是一條重要的細胞存活信號通路,參與調節(jié)許多細胞凋亡的過程。通過PI3K通道,Akt在Ser473位點發(fā)生磷酸化,介導了Akt的激活[1],從而對神經元具有保護作用[2]。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是最早發(fā)現的Akt的直接底物之一,活化的Akt與GSK-3β結合,使GSK-3β在Ser9位點上發(fā)生磷酸化,抑制GSK-3β的活性。Jayapalan等[3]的實驗顯示GSK-3β通過磷酸化Tau蛋白導致AD的發(fā)生。

研究表明,在Aβ、tau蛋白聚集區(qū)發(fā)現有高濃度的金屬離子,包括銅、鐵、鋅、鋁等[4]。銅、鐵、鋅、鋁在阿爾茨海默病中的神經毒性作用是否通過Akt/GSK-3β信號通路誘導?為此,本研究以人神經母細胞瘤細胞為模型,評價銅、鐵、鋅、鋁的神經毒性作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)由北京協(xié)和細胞資源中心提供,1640RPMI培養(yǎng)基購自Hyclone公司,胎牛血清購自Gibco公司,MTT購自碧云天生物技術研究所,Phospho-Akt (S473) Cell-Based Colorimetric ELISA Kit和Phospho-GSK3β (S9) Cell-Based Colorimetric ELISA Kit 購自美國ImmunoWay公司,FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I購自美國BD公司。細胞培養(yǎng)箱(美國TE-HER),倒置顯微鏡(日本OLYMPUS),醫(yī)用超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司),流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 細胞的培養(yǎng)及分組 實驗分為對照組,銅、鐵、鋅、鋁(高、中、低)劑量組:銅(50、200、400) μmol/L,鐵(1、2、4) mmol/L,鋅(50、100、200) μmol/L,鋁(1、2、4) mmol/L,共計13個劑量組。細胞用含15%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,置于C02培養(yǎng)箱(37 ℃,5%C02,100%濕度)中進行培養(yǎng)。

1.3 細胞活性測定(MTT法) SH-SY5Y細胞以2×105/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中:① 對照組:不加入藥品;② 實驗組:銅、鐵、鋅、鋁分組給藥,每組設6個平行孔,培養(yǎng)24 h,每孔加10 μL5 mg/mLMTT,置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h,每孔加入100 μL的DMSO,振蕩10 min,使結晶物充分溶解。于570 nm波長處測定其吸光度(OD),細胞存活率(%)=(細胞處理組OD值-空白孔OD值)/(細胞對照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.4 ELISA檢測P-Akt,Akt和GSK-3β、p-GSK-3β 取對數生長期的細胞接種在96孔板中,待細胞長到75%-90%融合時,按實驗分組進行染毒。染毒24 h后,每孔加100 μL4%甲醛固定25 min。每孔加100 μLQuench buffer,室溫25 min。每孔加100 μLBlocking buffer,室溫1.5 h,洗滌細胞三次。每孔加50 μL第一抗體,封板膜封板,4 ℃冰箱過夜,(注:陰性對照孔不加第一抗體)。每孔加50 μL酶標抗體,室溫在振動篩上輕輕振1.5 h。每孔加50 μL底物液TMB,室溫避光顯色15 min,每孔加50 μL終止液,450 nm處測定各孔吸光度值。讀板后,每孔加50 μL結晶紫,室溫振動篩上振30 min,每孔加100 μL1%SDS,振動篩上室溫振動1 h。595 nm處測定內參值,測定的相對值=(細胞內OD450-陰性對照OD450)/(內參OD595-內參陰性對照OD595)。

1.5 細胞凋亡率測定 神經細胞處理與染毒同前,于接種后24 h做檢測。用0.25%胰酶-EDTA 消化細胞,于4 ℃ 1300 r/min離心 5 min,100 μL1XBinding Buffer重新懸浮細胞。將用來做補償的細胞分到3管中,每管105個。FITC標記的Annexin-V 5 μL,再加入PI 5 μL,避光反應 15 min 后,加入400 μL Binding Buffer。立即用FACSCalibur進行流式細胞術定量檢測(一般不超過 1 h), 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。

2 結果

2.1 銅、鐵、鋅、鋁對SH-SY5Y細胞活力的影響 隨銅、鐵、鋅、鋁濃度的增加,細胞活力逐漸降低。染銅組細胞活力均低于對照組 (P<0.05);200、400 μmol/L組細胞活力低于50 μmol/L組 (P<0.05)。2、4 mmol/L FeSO4組細胞活力低于對照組和1 mmol/L組 (P<0.05)。染鋅組細胞活力低于對照組(P<0.05);100、200 μmol/L組細胞活力低于50 μmol/L組 (P<0.05)。4 mmol/L AlCl3組細胞活力低于對照組和1 mmol/L組(P<0.05);2 mmol/L組細胞活力低于對照組(P<0.05),見表1。

表1 銅、鐵、鋅、鋁對SH-SY5Y細胞存活率影響%, n=6)

注:與對照組相比,*P<0.05;與低劑量組相比,△P<0.05;低、中、高劑量金屬組:CuSO4分別為50、200、400 μmol/L,FeSO4分別為1、2、4 mmol/L,ZnSO4分別為50、100、200 μmol/L,AlCl3分別為1、2、4 mmol/L。

2.2 Akt與磷酸化Akt(Ser473)蛋白表達結果 隨銅濃度的增加,各劑量組Akt蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);200、400 μmol/L組Akt磷酸化水平低于對照組和50 μmol/L組 (P<0.05)。隨鐵濃度增加,各劑量組Akt蛋白表達均低于對照組(P<0.05),但各劑量組間未見明顯趨勢變化;2、4 mmol/L組Akt磷酸化水平低于對照組和1 mmol/L組(P<0.05)。隨鋅濃度的增加,各劑量組之間Akt蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);各劑量組Akt磷酸化水平均低于對照組(P<0.05),100、200 μmol/L組磷酸化水平低于50 μmol/L組 (P<0.05)。隨鋁濃度增加,1、2 mmol/L組Akt蛋白表達低于對照組(P<0.05),呈逐漸降低趨勢;各劑量組Akt磷酸化水平低于對照組(P<0.05),4 mmol/L組磷酸化水平低于1 mmol/L組 (P<0.05),見表2。

組別p?Akt(Ser473)AktCuSO4對照組0 189±0 0090 301±0 017低劑量組0 182±0 0240 286±0 013中劑量組0 112±0 018?△0 271±0 024高劑量組0 065±0 011?△0 277±0 012FeSO4對照組0 189±0 0090 301±0 017低劑量組0 177±0 0060 264±0 017?中劑量組0 115±0 011?△0 259±0 019?高劑量組0 066±0 008?△0 264±0 018?ZnSO4對照組0 189±0 0090 301±0 017低劑量組0 164±0 012?0 261±0 03中劑量組0 089±0 011?△0 246±0 013高劑量組0 073±0 009?△0 258±0 026AlCl3對照組0 189±0 0090 301±0 017低劑量組0 137±0 028?0 266±0 004?

續(xù)表：

組別p?Akt(Ser473)Akt中劑量組0 109±0 011?0 260±0 015?高劑量組0 075±0 005?△0 259±0 015

注:與對照組相比,*P<0.05;與低劑量組相比,△P<0.05;低、中、高劑量金屬組:CuSO4分別為50、200、400 μmol/L,FeSO4分別為1、2、4 mmol/L,ZnSO4分別為50、100、200 μmol/L,AlCl3分別為1、2、4 mmol/L。

2.3 GSK-3β和磷酸化GSK-3β(Ser9)蛋白表達結果 隨銅、鐵、鋅、鋁濃度的增加,各劑量組GSK-3β蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。200、400 μmol/L CuSO4組GSK-3β磷酸化水平低于對照組和50 μmol/L組 (P<0.05)。各染鐵組GSK-3β磷酸化水平均低于對照組(P<0.05),2、4 mmol/L FeSO4組磷酸化水平低于1 mmol/L組 (P<0.05)。100、200 μmol/L ZnSO4組GSK-3β磷酸化水平低于對照組和50 μmol/L組 (P<0.05)。2、4 mmol/L AlCl3組磷酸化水平低于對照組和1 mmol/L組 (P<0.05),見表3。

組別p?GSK?3β(Ser9)GSK?3βCuSO4對照組3 144±0 0993 200±0 099低劑量組3 061±0 2323 154±0 363中劑量組2 373±0 194?△3 014±0 192高劑量組1 898±0 094?△3 120±0 343FeSO4對照組3 144±0 0993 200±0 099低劑量組2 432±0 202?3 105±0 183中劑量組1 836±0 130?△3 124±0 077高劑量組1 498±0 260?△3 192±0 230ZnSO4對照組3 144±0 0993 200±0 099低劑量組3 128±0 2433 063±0 137

續(xù)表：

組別p?Akt(Ser473)Akt中劑量組2 215±0 245?△3 251±0 128高劑量組1 335±0 176?△3 053±0 311AlCl3對照組3 144±0 0993 200±0 099低劑量組2 782±0 2963 186±0 273中劑量組1 956±0 249?△3 014±0 110高劑量組1 367±0 206?△3 172±0 188

注:與對照組相比,*P<0.05;與低劑量組相比,△P<0.05;低、中、高劑量金屬組:CuSO4分別為50、200、400 μmol/L,FeSO4分別為1、2、4 mmol/L,ZnSO4分別為50、100、200 μmol/L,AlCl3分別為1、2、4 mmol/L。

2.4 細胞凋亡率測定結果 隨染銅、鐵、鋅、鋁濃度的增加,細胞凋亡率均高于對照組(P<0.05)。 各染銅組細胞凋亡率高于對照組(P<0.05),200、400 μmol/L組細胞凋亡率高于50 μmol/L組 (P<0.05)。2、4 mmol/L FeSO4組細胞凋亡率高于對照組和1 mmol/L組 (P<0.05)。100、200 μmol/L ZnSO4組細胞凋亡率高于對照組和50 μmol/L組 (P<0.05)。2、4 mmol/L AlCl3組細胞凋亡率高于對照組和1 mmol/L組 (P<0.05),見表4。

表4 銅、鐵、鋅、鋁對SH-SY5Y細胞凋亡率影響

注:與對照組相比,*P<0.05;與低劑量組相比,△P<0.05;低、中、高劑量金屬組:CuSO4分別為50、200、400 μmol/L,FeSO4分別為1、2、4 mmol/L,ZnSO4分別為50、100、200 μmol/L,AlCl3分別為1、2、4 mmol/L。

3 討論

現有研究表明,體內微量元素動態(tài)平衡的紊亂可能與AD的形成和病理改變有關,在AD病人腦組織老年斑內存在高濃度的金屬離子,主要包括銅、鋁、鋅、鐵等[4]。GSK-3β作為多條信號通路的主要調控酶,它活性的高低與體內穩(wěn)態(tài)以及疾病的發(fā)生、發(fā)展有關, GSK-3β的活化參與AD的病理生理過程[5]。GSK-3β在Ser9位點發(fā)生磷酸化后,GSK-3β的活性降低。Akt(又名蛋白激酶B,PKB)作為重要的抗凋亡調節(jié)因子, 能介導多種生物學效應。通過PI3K通道,Akt在磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDKl)作用下,促使Thr308位點發(fā)生磷酸化;Akt在PDK2作用下,使Ser473位點發(fā)生磷酸化。研究表明,抑制PI3K/Akt通道可引起GSK-3β的激活[6],GSK-3β的激活可導致酶的失活以及細胞凋亡[7],同時可抑制蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)活性,從而導致神經元功能、結構改變,學習、記憶障礙。同時研究證實,AD病人體內GSK-3β磷酸化水平增高時,可抑制tau蛋白的過度磷酸化,改善NFTs和Aβ的聚集[8]。

有研究表明,在SH-SY5Y細胞內攝入大量銅,會抑制GSK-3β磷酸化水平[9];Lovell等[10]報道給予Fe2+可提高大鼠皮質神經元tau蛋白過度磷酸化的程度和GSK-3β的活性;鐵和Aβ的存在能夠顯著減少蛋白激酶C(PKC),降低Akt的活性[11]。景小鵬[12]研究發(fā)現,在小鼠體內攝入大量鋅,GSK-3β絲氨酸 9位點磷酸化水平顯著降低;Singla等[13]提出過量鋁可以上調GSK-3β的表達,同時Zhao等[14]研究也發(fā)現,鋁可以上調GSK-3β的表達,下調PP2A的表達,從而使tau蛋白異常磷酸化。

銅、鐵、鋅、鋁作用于SH-SY5Y細胞后表現出一定的神經毒性。銅、鐵、鋅、鋁進入細胞后,激活了蛋白激酶GSK-3β,下調了Akt及GSK-3β的磷酸化水平,其機制與PI3K-AKT/PKB-GSK3β信號通路有關。隨銅、鐵、鋅、鋁濃度的增加,細胞凋亡率呈逐漸增高趨勢。由此可見,銅、鐵、鋅、鋁可通過Akt/GSK-3β信號通路誘導SH-SY5Y細胞的凋亡。因此,對于Akt及GSK-3β的活性調節(jié),可作為AD發(fā)病機制和藥物靶向治療等方面的研究重點。雖然目前金屬離子在AD病理過程中的作用還沒有最后定論,但是,金屬離子和AD密切相關是毋庸置疑的, 測定體內金屬離子的含量可能作為無創(chuàng)性預防AD癡呆前階段(pre-MCI、MCI)患病風險的重要評估指標, 同時調節(jié)金屬離子穩(wěn)態(tài)對預防AD、研究其發(fā)病機制和研發(fā)治療藥物等都具有重要意義。

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Copper, iron, zinc and aluminum induce the apoptosis of SH-SY5Y cells through Akt/GSK-3β signaling pathways

ZHUJing-li,LUZhao-shuo,WUYue,XUYan-ji,YAOJian,WANGXin-xin,WANGDe-cai.
DepartmentofNutritionandFoodHygiene;XUYan-ji.DepartmentofToxicology,PublicHealthCollege,HarbinMedicalUniversity,Harbin150081,China

Objective To explore the effects of copper, iron, zinc and aluminum on the neurotoxi-city and mechanism in SH-SY5Y cells. Methods SH-SY5Y cells were treated with different concentrations of copper sulfate (50,200,400μmol/L),iron sulfate and aluminum chloride (1,2,4 mmol/L),and zinc sulfate(50,100,200 μmol/L) respectively. Cell viabilities were measured by MTT assay. ELISA kit method were performed to evaluate the deliverances of glycogen synthase kinase-3β(GSK-3β), phosphorylation of the sites in GSK-3β-Ser9, Akt and phosphorylated Akt(Ser473). The apoptosis rate of detected cells was by double-staining with Annexin-V and PI. Results With the increase of the concentration of copper, iron, zinc and aluminum increased, the viability of SH-SY5Y cell decreased gradually. The cell viability of each dose group were significantly lower than that of control group(P<0.05). The expressions of Akt were significantly lower in iron and aluminum group, than that in control group (P<0.05). The expression of GSK-3β had no significant difference(P>0.05). The levels of phosphorylation of GSK-3β and Akt in all groups were significantly lower than those of control group(P<0.05). With the concentration of copper, iron, zinc and aluminum increased, the apoptosis rates were significantly higher than that of control group (P<0.05). Conclusions Copper, iron, zinc, aluminum could induce neurotoxicity, inhibit the activity of Akt, activate the glycogen synthase kinase 3β and lead to the neuronal apoptosis.

copper; iron; zinc and aluminum; SH-SY5Y cell; Akt; GSK-3β

國家自然科學基金(81273193)

150081黑龍江省哈樂濱市，哈爾濱醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學教研室(朱敬麗，路趙碩，吳越，姚建,王鑫鑫，王德才)毒理學教研室(徐彥吉)

王德才，Email：decaiwang@live.cn

R 742； R 153.3

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2017.08.007

2016-09-27)