張麗麗+王蘭英+唐萌+楊海茹+胡玲+蔡佳旋+黃艷怡

摘要：采用RAPD分析了5個(gè)不同產(chǎn)地的花臉香蘑（Lepista sordida）菌絲體和子實(shí)體的DNA多樣性。用12種引物分別對(duì)5種樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中選出8種引物擴(kuò)增后的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)算樣品間的遺傳相似系數(shù)（GS值），進(jìn)而根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，花臉香蘑菌絲體和子實(shí)體分為兩個(gè)類群，又將3個(gè)不同產(chǎn)地的菌絲體分為2個(gè)亞群，為花臉香蘑后期研究提供參考。

關(guān)鍵詞：花臉香蘑（Lepista sordida）；DNA多樣性；聚類分析

中圖分類號(hào)：S646 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）14-2758-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.14.041

Abstract： Using RAPD analysis of the five different regions of mycelia and fruiting body of Lepista sordida DNA diversity. Respectively with 12 primers for PCR amplification， five samples selected by 8 primers' amplification result for data analysis， the genetic similarity coefficient between the sample value（GS），and then according to the genetic similarity coefficient matrix， the cluster analysis using UPGMA method. The results showed that RAPD mycelia and fruiting body Lepista sordida method is divided into two groups， and the mycelium of three different regions can be divided into two subsets， it can be seen that the genetic relationship provide reference for later study of Lepista sordida.

Key words： Lepista sordida； DNA diversity； clustering analysis

花臉香蘑（Lepista sordida）又名紫香花臉蘑，隸屬于傘菌目（Agaricales）白蘑科（Tricholomataceae）香蘑屬（Lepista）[1]，花臉香蘑的子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨(dú)特，是一種具有較高開發(fā)價(jià)值的食用菌[2]。但人工栽培的花臉香蘑存在子實(shí)體易碎、不易運(yùn)輸?shù)热毕荩写谕ㄟ^(guò)雜交等育種方式進(jìn)行改良，這就需要對(duì)花臉香蘑種質(zhì)資源進(jìn)行廣泛采集和科學(xué)鑒定，以避免因形態(tài)相似或分離失誤而出現(xiàn)偏差[3]。

本研究利用RAPD技術(shù)，鑒定花臉香蘑菌株，克服傳統(tǒng)的標(biāo)記手段和形態(tài)分類學(xué)的缺點(diǎn)，為花臉香蘑的深入研究提供了強(qiáng)有力的工具和手段，其應(yīng)用和發(fā)展前景廣闊。

1 材料與方法

1.1 材料

花臉香蘑1號(hào)菌種購(gòu)于蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，編號(hào)為BNCC117075，采集地為山東；花臉香蘑2號(hào)菌種購(gòu)于蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司，編號(hào)為BNCC110924，采集地為黑龍江；花臉香蘑3號(hào)菌種由吉林大學(xué)珠海學(xué)院化學(xué)與藥學(xué)系實(shí)驗(yàn)中心提供；花臉香蘑4號(hào)子實(shí)體產(chǎn)地為內(nèi)蒙古大興安嶺阿爾山林區(qū)；花臉香蘑5號(hào)子實(shí)體產(chǎn)地為吉林長(zhǎng)白山地區(qū)，以上5種菌類原始樣品，樣品編號(hào)1～5。

1.2 基因組DNA的提取

采用CTAB法提取樣品基因組DNA，具體步驟參考Zhang等[4]方法進(jìn)行。

1.3 RAPD分析

1.3.1 RAPD反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件 PCR擴(kuò)增體系（20 μL）為DNA模板2 μL、Primer 1 μL、DNA Mix 10 μL、去離子水7 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃變性30 s，36 ℃退出50 s，72 ℃延伸1.5 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[5]。

1.3.2 RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 利用表1中的12種引物對(duì)5個(gè)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物在2.0%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳位置在凝膠某個(gè)相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無(wú)DNA條帶記為0，如表2所示，形成RAPD的表型數(shù)據(jù)矩陣，可以將PCR擴(kuò)增的結(jié)果數(shù)字化，便于后續(xù)的分析。NTSYS軟件計(jì)算相似系數(shù)（DICE系數(shù)），并且按照遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

用CTAB方法提取5種樣本的基因組DNA，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所得的DNA主條帶清晰，沒有出現(xiàn)明顯的拖尾顯現(xiàn)（圖1）。說(shuō)明提取的DNA保持良好的完整性，花臉香蘑菌絲體及子實(shí)體中的多糖等去除的效果良好[7]，可以進(jìn)行下一步RAPD檢測(cè)。

2.2 RAPD分析結(jié)果

利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)5個(gè)樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析，12條引物擴(kuò)增如圖2所示。從圖2中可以看出，選出8種條帶清晰的引物進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選擇的引物代碼為P2、P3、P5、P7、P8、P10、P11、P12。

2.3 8種引物及其擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)

8種引物在5種樣品中共獲得46個(gè)擴(kuò)增條帶，其中多態(tài)性條帶有39個(gè)，擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶百分率為84.78%，說(shuō)明供試的5種樣品具有豐富的遺傳多態(tài)性，對(duì)不同的生存環(huán)境表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)能力，符合花臉香蘑廣泛分布的特點(diǎn)。P7引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)最多（7條），而P3引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶數(shù)最少（2條）。不同引物擴(kuò)增出的清晰條帶數(shù)在4～8之間，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)為5.75條，多態(tài)性條帶數(shù)為4.88條，多態(tài)性條帶百分率為82.90%[8]，表3列出了8種引物對(duì)5種樣品擴(kuò)增的多態(tài)性條帶數(shù)。

2.4 供試材料的親緣關(guān)系分析

利用8種引物在5種樣品中獲得46個(gè)擴(kuò)增片段，如表3所示。在NTSYS軟件中計(jì)算樣品間的遺傳相似系數(shù)（GS值），得到供試材料遺傳相似矩陣。遺傳相似系數(shù)越大，表明親緣關(guān)系越近，遺傳相似系數(shù)越小，表明親緣關(guān)系越遠(yuǎn)[9]。由表4可知，5種樣品的GS值范圍為0.282 6～0.913 0，變幅為0.630 4。其中4號(hào)樣品和5號(hào)樣品之間的遺傳相似系數(shù)最大為0.913 0，表明這兩個(gè)樣品之間的親緣關(guān)系較近，遺傳差異性小。3號(hào)樣品和4、5號(hào)樣品之間的遺傳相似系數(shù)最小為0.282 6，表明3號(hào)樣品與4、5號(hào)樣品之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳差異性較大，存在較高的遺傳多樣性。

2.5 RAPD分子標(biāo)記聚類分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)矩陣，利用UPGMA法進(jìn)行聚類分析，根據(jù)遺傳相似系數(shù)對(duì)各樣品進(jìn)行分類分析，聚類圖如2所示。5種樣品分成2類，樣品1、2、3是第一類，樣品4、5是第二類。其中第一類又分為2個(gè)亞類，第一亞類為1號(hào)樣品，樣品2、3號(hào)為第2亞類[10]。

3 結(jié)論與討論

4號(hào)樣品和5號(hào)樣品之間的親緣關(guān)系較近，遺傳差異性小。3號(hào)樣品與4、5號(hào)樣品之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳差異性較大，存在較高的遺傳多樣性。 5種樣品分成2個(gè)類群，樣品1、2、3是第一類群，樣品4、5是第二類群?？梢?，RAPD將花臉香蘑菌絲體和子實(shí)體分為2個(gè)類群，2號(hào)和3號(hào)菌絲體親緣關(guān)系比與1號(hào)菌絲體親緣關(guān)系近?；樝隳⑦z傳多樣性，是由于自身遺傳體系與產(chǎn)地復(fù)雜變化的自然生態(tài)環(huán)境長(zhǎng)期共同作用的結(jié)果，為花臉香蘑后期開發(fā)提供一定的參考。

參考文獻(xiàn)：

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