張 瑋，魏 群，郭惠芳，鄭桂敏，張蓮之，彭媛媛，劉淑霞

(1.河北醫(yī)科大學(xué) 病理教研室，河北 石家莊 050017；2.河北省人民醫(yī)院醫(yī)院 a.感染管理科；b.免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊 050051；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊 050000)

·論著·

去泛素化酶Usp46基因在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血液中的表達(dá)及意義

張 瑋1，魏 群2a，郭惠芳3，鄭桂敏2b，張蓮之1，彭媛媛1，劉淑霞1

(1.河北醫(yī)科大學(xué) 病理教研室，河北 石家莊 050017；2.河北省人民醫(yī)院醫(yī)院a.感染管理科；b.免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊 050051；3.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 免疫風(fēng)濕科，河北 石家莊 050000)

目的 研究泛素特異性蛋白酶46 (Usp46)基因在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者及健康人外周血中的表達(dá)水平，并探討其在SLE發(fā)病中的作用。方法 收集73例SLE患者及75 例健康人臨床資料，采用Real-timePCR法檢測外周血中Usp46基因mRNA的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系。結(jié)果 與健康對照組相比，SLE患者血液中Usp46基因的mRNA表達(dá)水平明顯升高(Z=-6.98，P<0.01)；在SLE患者中Usp46基因的mRNA表達(dá)水平與紅細(xì)胞沉降率(ESR)、IgG、IgM和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)呈正相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論Usp46基因的mRNA表達(dá)水平在SLE患者血液中明顯增高，提示Usp46基因可能參與SLE疾病的發(fā)生發(fā)展過程。

紅斑狼瘡， 系統(tǒng)性；基因；血沉；泛素特異性蛋白酶46

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種復(fù)雜的自身免疫性疾病，累及多系統(tǒng)、多器官，以自身抗體產(chǎn)生、補體激活、免疫復(fù)合物沉積以及多種組織器官損傷為特征，病死率極高[1]，是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病。SLE的病因至今未明，發(fā)病機制復(fù)雜，已有研究表明SLE的發(fā)生和發(fā)展與激素水平、環(huán)境誘因和遺傳易感性等多種因素有關(guān)[2]。其中免疫系統(tǒng)的過度活化可導(dǎo)致自體抗體的產(chǎn)生、免疫復(fù)合物的沉積以及致炎因子的釋放，最終引發(fā)SLE中各個臟器的損傷[3]。最近研究發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶46 (Usp46)基因作為一種去泛素化酶，通過去泛素化PH結(jié)構(gòu)域富含亮氨酸重復(fù)蛋白磷酸酶1(PHLPP1)參與調(diào)控Akt信號通路[4]，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用，而且新近研究報道該基因與EB病毒核抗原(EBNA)家族一同參與調(diào)控淋巴細(xì)胞的生長和分化[5]，可能在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，然而其是否在SLE的發(fā)病中發(fā)揮作用仍是未知，本研究采用Real-timePCR法檢測SLE患者及健康人外周血中Usp46基因mRNA的表達(dá)情況，分析其表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系，初步探討Usp46基因在SLE患者發(fā)病中的可能作用。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2015年1月至2017年1月在河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院免疫風(fēng)濕科診斷的SLE患者73例，男7例，女66例，年齡(35.0±2.8)歲。SLE診斷均符合美國2009年風(fēng)濕病學(xué)會修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取同期健康獻(xiàn)血者75例作為對照，男10例，女65例，年齡(38.0±1.2)歲。兩組性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。研究對象均已簽署知情同意書且已通過倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法 所有研究對象抽取空腹靜脈血用于紅細(xì)胞沉降率(ESR)、IgA、IgG、IgM、C3、C4及丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測。

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 用PAXgeneBloodRNATubes(Quagen)保存血液，保證血液中RNA的穩(wěn)定性，運用PAXgeneBloodRNAKit(Quagen)試劑盒提取總RNA，檢測其純度和濃度后，采用FastQuantRTKit(天根)試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，本試驗是在河北省腎臟病重點實驗室完成。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)Usp46(NM_022832.3)和內(nèi)參基因GAPDH(NM_002046)基因序列設(shè)計引物，由上海生工生物公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3Real-timePCR檢測Usp46基因表達(dá)水平 用熒光定量PCR檢測儀(AgilentMX3000P，美國)進(jìn)行PCR擴增，Real-time反應(yīng)體系由SYBRGreenMix10μl、上游引物和下游引物各0.5μl(終濃度為12.5μM)、cDNA1μl、無RNA酶的去離子水8μl構(gòu)成20μl體系。反應(yīng)條件為95 ℃ 2分鐘預(yù)變性，95 ℃ 5秒，55 ℃ 30秒，72 ℃ 30秒共40個循環(huán)，同時檢測熔解曲線。確定循環(huán)閾值(Ct)后，目標(biāo)基因Usp46相對于內(nèi)參基因GAPDH進(jìn)行相對定量，采用2-△△Ct法計算相對表達(dá)量，并比較兩組間的基因表達(dá)水平的差異[6-7]。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳以檢測基因特異性。

1.3SLEDAI評分對SLE病情的判斷依據(jù) 0～4分，基本無活動；5～9分，輕度活動；10～14分，中度活動；≥15分，重度活動。

2 結(jié) 果

2.1 臨床指標(biāo)SLE患者SLEDAI評分為中度活動；患者存在血液系統(tǒng)、腎臟、皮膚及神經(jīng)系統(tǒng)損傷；ESR明顯加快，高于正常水平；補體C3、C4低于正常水平，見表2。

表2 73例SLE患者臨床資料

2.2 血液標(biāo)本RNA健康對照組RNA濃度為(48.50±5.28)g/L，純度OD比值為(1.89±0.05)，SLE組RNA濃度為(85.60±7.06)g/L，純度OD比值為(1.98±0.03)，采用1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示18s和28s條帶清晰，28s的亮度是18s的2倍左右，說明完整性良好。

2.3 實時熒光定量PCR實時熒光定量RCR結(jié)果顯示擴增良好(圖1a)；溶解曲線均為單峰(圖1b，左側(cè)為Usp46基因，右側(cè)為GAPDH基因)，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行2.5%瓊脂糖電泳結(jié)果顯示條帶單一、大小正確(圖1c)。

2.4Usp46基因mRNA表達(dá)水平Real-timePCR結(jié)果顯示，兩組均表達(dá)Usp46基因mRNA，SLE組Usp46基因的表達(dá)水平4.22 (1.30，17.02)健康對照組1.00(0.84，1.11)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-6.98，P<0.01)。

2.5 相關(guān)性分析SLE患者Usp46基因的mRNA表達(dá)水平與ESR、IgG、IgM和ALT呈正相關(guān)(P<0.05)，與SLEDAI評分、IgA、C3、C4無相關(guān)性。見圖2。

圖1 GAPDH和Usp46基因?qū)崟r熒光定量PCR結(jié)果 a.擴增曲線；b.融解曲線；c.熒光定量PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果

圖2 SLE患者Usp46基因表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

SLE是目前臨床上最常見的自身免疫性疾病，患者血清中常含有多種自身抗體，病變可以累及體內(nèi)泌尿、神經(jīng)、循環(huán)、運動、呼吸、血液、消化等多個系統(tǒng)，導(dǎo)致患者出現(xiàn)狼瘡性腎炎、狼瘡性腦病、狼瘡性心臟病等多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，如不控制甚至可以威脅患者的生命，然而SLE缺乏早期發(fā)現(xiàn)和早期診斷的分子標(biāo)記物，病情往往進(jìn)展到并發(fā)癥階段，有明顯臨床癥狀后才就醫(yī)，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后及生活質(zhì)量，因而尋找早期分子標(biāo)記物是早診斷、早治療，提高患者生存質(zhì)量的關(guān)鍵。

研究發(fā)現(xiàn)泛素-蛋白酶體通路[8]通過特異性地降解細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)參與調(diào)控多種細(xì)胞進(jìn)程，包括細(xì)胞周期[9]、腫瘤生長[10]及炎癥[11]等，而且還參與免疫反應(yīng)的調(diào)控[12-13]，去泛素化酶是該通路中重要的質(zhì)量控制因子，通過對底物蛋白的去泛素化來調(diào)控蛋白質(zhì)的壽命[14]，去泛素化酶表達(dá)水平、基因突變及功能異常與多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白3(TNFAIP3)基因突變與SLE、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病、淋巴瘤及哮喘等疾病[15-16]，Usp18通過調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶 1(TAK1)及TAB(TAK1 結(jié)合蛋白1)在輔助性T細(xì)胞17(Th17)分化和自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[17]，另外Usp7表達(dá)水平增加及活性增強使多種抑癌基因P53、第10號染色體缺失的磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)穩(wěn)定性下降[18]，而且Usp7還參與調(diào)控核因子κB(NF-κB)信號通路[19-20]。

Usp46基因為人類100多種去泛素化酶[21]中的一種，屬于泛素特異性蛋白酶亞家族，Usp46基因的生理功能目前仍不明確，有研究表明Usp46基因為小鼠“行為抑郁”的責(zé)任基因[22-23]，且通過去泛素化谷氨酸受體α-氨基-3 羥基-5 甲基-4 異惡唑受體(AMPAR)調(diào)控大腦的興奮性突觸傳遞[24]，提示Usp46基因很可能參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。此外研究發(fā)現(xiàn)其在組蛋白H2A和H2B的去泛素化[25]和大腸癌細(xì)胞的Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[4， 26]等方面發(fā)揮重要作用，而且該基因與EB病毒核抗原3(EBNA3)家族中的EBNA3A和EBNA3C相互作用發(fā)揮著調(diào)控淋巴細(xì)胞的生長和分化的作用[5]，提示該基因很可能在免疫系統(tǒng)中也發(fā)揮重要作用，然而其是否在SLE中發(fā)揮作用，仍無報道，本研究發(fā)現(xiàn)與健康人比較，SLE患者外周血中Usp46基因mRNA表達(dá)水平明顯升高，提示該基因可能與SLE的發(fā)病有關(guān)。

那么該基因能否作為SLE早期診斷的分子標(biāo)記物呢？本研究發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)水平與SLE患者多項臨床指標(biāo)存在相關(guān)性。ESR是反應(yīng)炎癥的非特異性指標(biāo)，一般在風(fēng)濕熱、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、血管炎等結(jié)締組織病的活動期升高，可以作為判斷疾病活動及預(yù)后的指標(biāo)，以往研究表明大多數(shù)活動期SLE患者ESR增高，而臨床緩解期SLE患者ESR基本正常，提示ESR檢測可以動態(tài)觀察SLE患者病情活動的變化[27]。本研究顯示Usp46基因mRNA與ESR呈正相關(guān)，提示該基因與SLE疾病進(jìn)展有關(guān)。然而其與SLEDAI評分無相關(guān)性，可能是樣本量較少的原因。

此外，SLE患者早期或活動期會出現(xiàn)血清免疫球蛋白及補體的異常變化[28-30]，當(dāng)自身抗體與組織有免疫反應(yīng)出現(xiàn)時，免疫復(fù)合物增多，補體系統(tǒng)活化并與免疫復(fù)合物結(jié)合，在此過程中補體消耗較多，血液中補體成分降低，下降程度與患者病情活動程度相符，因而免疫球蛋白和補體常與自身抗體一起被用于SLE的臨床診斷及病情療效評估。本研究發(fā)現(xiàn)Usp46基因的表達(dá)水平與IgG、IgM呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示Usp46基因可用于SLE患者的病情評價。本研究還發(fā)現(xiàn)Usp46基因表達(dá)水平與ALT呈正相關(guān)，該基因是否與狼瘡性肝損傷有關(guān)仍有待進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)Usp46基因mRNA表達(dá)水平在SLE患者中明顯升高，約為健康人群的4.22倍，提示Usp46基因可能與SLE的發(fā)病有關(guān)，而且與ESR、IgG、IgM呈正相關(guān)，進(jìn)一步提示Usp46基因與SLE的病情進(jìn)展有關(guān)，然而其是否能作為SLE輔助診斷的分子標(biāo)記物，仍需要進(jìn)一步擴大樣本量進(jìn)行研究。

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Roleofubiquitin-specificproteases46geneinbloodofpatientswithsystemiclupuserythematosus

ZhangWei1，WeiQun2a，GuoHuifang3，ZhengGuimin2b，ZhangLianzhi1，Pengyuanyuan1，LiuShuxia1

1.DepartmentofPathology，HebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050017，China; 2a.DepartmentofNosocomialInfectionControl；2b.DepartmentofRheumatology，HebeiGeneralHospital，Shijiazhuang050051，China; 3.DepartmentofRheumatology，theSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050000，China

LiuShuxia，Email:susanliu1976@163.com

ObjectiveToinvestigatetheroleofubiquitin-specificproteases46 (Usp46)inthebloodofsystemiclupuserythematosus(SLE)patientsandhealthypopulation.MethodsRealtimepolymerasechainreactionanalysiswasusedtodeterminetheUsp46expressioninthebloodof73patientswithSLEand75healthycontrols.ResultsThemRNAexpressionlevelofUsp46wassignificantlyincreased，about4.22(1.30，17.02)folds，insamplesfromSLEpatientscomparedtohealthypopulation(Z=-6.98，P<0.01).Inaddition，therewassignificantlypositivecorrelationbetweentheexpressionlevelofUsp46andESR，IgG，IgMandALT(P<0.05).ConclusionThemRNAexpressionlevelofUsp46wassignificantlyhigherinSLEpatientsthaninhealthypopulation，whichindicatesthatUsp46mayparticipateinthedevelopmentofSLEprocess.

lupuserythematosus，systemic；genes；bloodsedimentation；ubiquitinspecificprotease46

河北省自然科學(xué)基金(H2015206449)；河北省衛(wèi)生廳重點科技研究計劃(ZD20140034)；河北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃(201510089038)

劉淑霞，Email:susanliu1976@163.com

R

A

1004-583X(2017)08-0686-05

10.3969/j.issn.1004-583X.2017.08.010

2017-07-06 編輯:王秋紅