何小琳，張穎，董爽，王迷娟

（1.北京協(xié)和藥廠，北京 102600；2.北京協(xié)和制藥二廠，北京 102600）

HPLC測(cè)定瑞格列奈片的含量

何小琳1，張穎1，董爽2，王迷娟1

（1.北京協(xié)和藥廠，北京 102600；2.北京協(xié)和制藥二廠，北京 102600）

目的：建立瑞格列奈片的含量測(cè)定方法。方法：采用高效液相色譜法對(duì)瑞格列奈成分進(jìn)行含量測(cè)定。色譜柱：DIKMA Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：醋酸銨緩沖液（取醋酸銨3.85 g，加水1000 mL溶解后，用冰醋酸調(diào)pH值至4.0）-甲醇（20∶80）為流動(dòng)相；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長為243 nm；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為20 μL。結(jié)果：瑞格列奈在10～30 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r為0.999 6；平均回收率為100.4%，RSD為1.22%；24 h內(nèi)瑞格列奈溶液穩(wěn)定性良好，RSD為1.08%。結(jié)論：本方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，可用于瑞格列奈片的含量測(cè)定。

高效液相色譜法；瑞格列奈片；含量

瑞格列奈片系德國Boehringer Ingelhei公司研制，由丹麥Novo Nordisk公司開發(fā)并于1998年在美國首次上市，商品名為Prandin。2000年在中國上市，商品名為諾合龍[1-2]，主要成份化學(xué)名稱為：S（＋）-2-乙氧基-4[2-[[3-甲基-1-[2-（1-哌啶基）苯基]-丁基]氨基-2-氧乙基]苯甲酸，分子式為C27H36N2O4，是非磺酰脲類結(jié)構(gòu)的胰島素分泌促進(jìn)劑[3-4]，為新型短效口服促胰島素分泌降糖藥，通過與不同受體結(jié)合關(guān)閉β細(xì)胞膜中ATP-依賴性鉀通道而發(fā)揮降糖作用[5]，用于飲食控制及運(yùn)動(dòng)鍛煉不能有效控制高血糖的2型糖尿?。ǚ且葝u素依賴型）患者，具有良好的降血糖效果?？蓡斡没蚺c其他降糖藥合用，如二甲雙胍[6]等，具有廣泛的應(yīng)用范圍。本文主要研究瑞格列奈片的含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀及其工作站（DAD檢測(cè)器）；Xs 205電子分析天平（瑞士Mettler公司，精密度為十萬分之一）；色譜柱：DIKMA Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；瑞格列奈對(duì)照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100753-200501）；瑞格列奈片為自制片，批號(hào)：101103（規(guī)格：1.0 mg）；瑞格列奈空白片為自制片，批號(hào)：101100。甲醇為色譜純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DIKMA Diamonsil C18（2）（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：醋酸銨緩沖液（取醋酸銨3.85 g，加水1000 mL溶解后，用冰醋酸調(diào)pH值至4.0）-甲醇（20∶80）為流動(dòng)相；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：243 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 供試品溶液制備

取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于瑞格列奈1.0 mg），置50 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸溶液適量，振搖使瑞格列奈溶解，用0.1 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液制備

取瑞格列奈對(duì)照品適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含20 μg的溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取瑞格列奈適量，用磷酸二氫鉀緩沖溶液（取磷酸二氫鉀4.0 g，加水約900 mL溶解后，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.2，再加水至1 000 mL）-乙腈（20:80）溶液溶解并制成每1 mL約含1 mg的溶液，置水浴90℃中加熱至溶劑剩余約20%，將樣品加塞密閉置于90℃烘箱繼續(xù)加熱24 h，冷卻至室溫，用磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈（20∶80）溶解并稀釋，得系統(tǒng)適用性溶液。取系統(tǒng)適用性溶液20 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，降解產(chǎn)物與瑞格列奈依次出峰，其分離度應(yīng)符合要求。瑞格列奈保留時(shí)間為13.5 min，降解產(chǎn)物與瑞格列奈峰分離度為4.3，符合規(guī)定。色譜圖見圖1。

圖1 瑞格列奈及瑞格列奈系統(tǒng)適用性HPLC圖

2.5 線性關(guān)系考察

取瑞格列奈對(duì)照品適量，精密稱定，加0.1 mol/L鹽酸溶解并定量稀釋成每1 mL中約含0.1 mg的貯備液。精密吸取貯備液1.0，1.5，2.0，2.5 mL和3.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加0.1 mol/L鹽酸稀釋至刻度，搖勻，得濃度分別約為10，15，20，25，30 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。以進(jìn)樣濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

y＝30.473x－8.850 4（r＝0.9996，n＝5）。

結(jié)果表明，瑞格列奈濃度在10～30 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.6 儀器精密度實(shí)驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，取供試品溶液1份，按照“2.1”色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，考察主峰峰面積變化情況，考察儀器精密度?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：RSD≤2.0%。結(jié)果，瑞格列奈峰面積RSD＝0.2%。表明方法儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，配制6份相同濃度的供試品溶液，按照“2.1”色譜條件測(cè)定，記錄色譜圖。同時(shí)用對(duì)照品溶液進(jìn)行當(dāng)中測(cè)定，計(jì)算6份供試品溶液的含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，考察方法的重復(fù)性?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：RSD≤2.0%。結(jié)果，含量平均值為101.6%，RSD＝0.55%。

2.8 中間精密度實(shí)驗(yàn)

對(duì)同一批次的瑞格列奈片（批號(hào)：101103），在不同時(shí)間、不同儀器上，由不同實(shí)驗(yàn)員操作，各平行配制6份，測(cè)定含量，對(duì)數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算所得12個(gè)含量數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，驗(yàn)證其中間精密度。可接受標(biāo)準(zhǔn)：RSD≤2.0%。按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件測(cè)定。結(jié)果，含量平均值為100.1%，RSD＝1.81%。表明方法中間精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫放置0，2，4，6，8，10，12，24 h按照“2.1”色譜條件測(cè)定，記錄瑞格列奈峰面積。結(jié)果，瑞格列奈峰面積RSD＝1.08%。表明，瑞格列奈含量測(cè)定供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取等量空白輔料，精密加入一定量的瑞格列奈對(duì)照品，按“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作，使最終的樣品中對(duì)照品濃度為80%，100%，120%，每個(gè)濃度平行操作3份?；旌暇鶆?，按“2.1”色譜條件測(cè)定，考察檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度。范圍：工作濃度的80%～120%?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：RSD≤2.0%。回收率結(jié)果見表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2.11 耐用性實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)考察了不同柱溫、不同流速、不同流動(dòng)相比例、流動(dòng)相A的不同pH值條件，計(jì)算瑞格列奈的含量，驗(yàn)證該方法的耐用性?？山邮軜?biāo)準(zhǔn)：RSD≤2.0%。結(jié)果表明柱溫在±5℃范圍變化、流速在±0.2 mL/min范圍變化、流動(dòng)相比例在±5%范圍變化、流動(dòng)相A的pH值在±0.2范圍變化，瑞格列奈含量穩(wěn)定，RSD均符合規(guī)定。該含量測(cè)定方法的耐用性良好。

2.12 樣品的含量測(cè)定

取“2.2”項(xiàng)下的供試品溶液及“2.3”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液各20 uL，按“2.1”色譜條件測(cè)定。按外標(biāo)法以峰面積分別計(jì)算樣品中的瑞格列奈的含量，平行3份，結(jié)果為99.8%，RSD為1.08%。

3 討論

3.1 系統(tǒng)適用性溶液的制備

經(jīng)實(shí)驗(yàn)，瑞格列奈項(xiàng)下有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)中，供試品溶液經(jīng)90℃水浴中放置24 h并放冷，相對(duì)于瑞格列奈峰保留時(shí)間約為1.1處的雜質(zhì)峰未有檢出?？疾彀l(fā)現(xiàn)，將有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下供試品溶液置水浴90℃中加熱至溶劑剩余約20%，將樣品加塞密閉置于90℃烘箱繼續(xù)加熱24 h，冷卻至室溫，用磷酸二氫鉀緩沖溶液-乙腈（20:80）溶解并稀釋，相對(duì)于瑞格列奈峰保留時(shí)間約為1.1處的雜質(zhì)峰能夠檢出，符合規(guī)定。將按此條件制備的系統(tǒng)適用性溶液用于瑞格列奈片含量測(cè)定中，雜質(zhì)峰檢出明顯，更有利于考察色譜條件的分離效果，確保含量測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 檢測(cè)波長的選擇

采用Agilent工作站的DAD檢測(cè)器全波長對(duì)瑞格列奈溶液進(jìn)行檢測(cè)，瑞格列奈在210，243，296 nm波長處有最大吸收，參考輔料峰的大小，選擇243 nm作為檢測(cè)波長。

3.3 專屬性考察

按“2.2”項(xiàng)下方法，配置瑞格列奈供試品溶液；同法配制不含主藥的空白輔料溶液。按“2.3”項(xiàng)下方法配置瑞格列奈對(duì)照品溶液。分別取空白輔料溶液、供試品溶液和對(duì)照品溶液，按“2.1色譜條件”測(cè)定。結(jié)果，瑞格列奈對(duì)照品溶液的色譜圖中主峰的保留時(shí)間與供試品溶液中瑞格列奈主峰的保留時(shí)間一致；空白輔料溶液色譜圖中在瑞格列奈色譜峰處未見任何相同保留時(shí)間的色譜峰?？瞻纵o料溶液對(duì)瑞格列奈測(cè)定無干擾，方法具有專屬性。

3.4 色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了不同廠家不同品牌的色譜柱，按“2.4”項(xiàng)下系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行降解物與瑞格列奈分離度考察。結(jié)果，迪馬色譜柱分離效果強(qiáng)，各降解峰均能檢出，降解物與瑞格列奈分離度符合規(guī)定。為保證方法的準(zhǔn)確、可靠，本實(shí)驗(yàn)規(guī)定采用DIKMA Diamonsil C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）進(jìn)行含量分析。

[1] 劉萍.糖尿病治療藥-瑞格列奈[J].國外醫(yī)藥-合成藥、生化藥、制劑分冊(cè), 1999,20(4):220-221.

[2] 韓瑩,屠樹滋,王秋娟.治療糖尿病藥物的研究進(jìn)展[J].中國新藥雜志,2000,9(7):442-448.

[3] 潘曉燕,吳文俊,沈飛霞.瑞格列奈治療中重度初診2型糖尿病的療效和安全性[J].中國臨床藥學(xué)雜志,2011,20(1): 24-27.

[4] 劉建朝,嵇汝運(yùn).促胰島素分泌杭糖尿病藥物研究進(jìn)展[J].中國藥學(xué)雜志,2005,40(6):408-410.

[5] 王淑梅,楊蓮英,趙合興.口服降糖藥的臨床應(yīng)用[J].華西藥學(xué)雜志,2004,19(2):158-160．

[6] 金紹禮.瑞格列奈聯(lián)合二甲雙胍治療初發(fā)Ⅱ型肥胖型糖尿病的療效觀察[J].中國藥房,2011,22(20):1876-1877.

本文編輯：魯守琴

Content Determination of Repaglinide Tablets by HPLC

He Xiao-lin1, Zhang Ying1, Dong Shuang2, Wang Mi-juan1
(1. Beijing Union Pharmaceutical Factory, Beijing 102600, China, 2. The Second Union Pharmaceutical Factory of Beijing City, Beijing 102600, China)

Objective：To develop a method for determination of content of repaglinide tablets. Methods：HPLC was used for determination of contents of various components of repaglinide tablets. DIKMA Diamonsil C18(2) column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was adopted serving ammonium acetate buffer (3.85 g ammonium acetate solution dissolved in 1 000 mL of water, of which the pH value was adjusted to 4.0 with acetic acid)-methanol (20∶80) as mobile phase at a fow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 243 nm, while the column temperature was 25℃, and the sample loading was 20 μL. Results：The linear range of repaglinide was 10～30 μg/mL, with a r value of 0.999 6. The average recovery was 100.4%, with a RSD of 1.22%. The repaglinide solution showed good stability within 24 h, with a RSD of 1.08%. Conclusion：This method is simple, accurate and reliable, which is applicable for the quality control of repaglinide tablets.

HPLC; Repaglinide Tablets; Content

R927.2

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.06.019

2017 - 03 - 22

何小琳，化學(xué)制藥工程師。研究方向：藥物分析。通訊作者E-mail：hxlcpu2010@126.com