陳莉，張嘯，劉永革，馮鳳嬌

（1.蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇 蘇州 215104；2.山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，山東 濟(jì)寧272021；3.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198）

動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定注射用鹽酸大觀霉素中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量

陳莉1，張嘯2，劉永革2，馮鳳嬌3

（1.蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇 蘇州 215104；2.山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，山東 濟(jì)寧272021；3.中國(guó)藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198）

目的：為建立注射用鹽酸大觀霉素細(xì)菌內(nèi)毒素定量方法提供參考。方法：建立動(dòng)態(tài)濁度法測(cè)定細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線，驗(yàn)證可靠性，考察樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾情況，確定樣品的最大無干擾濃度，驗(yàn)證方法的精密性和準(zhǔn)確性，并進(jìn)行初步應(yīng)用。結(jié)果：標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠性驗(yàn)證中，相關(guān)系數(shù)r＞0.99，標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠。供試品用苯甲醇注射液溶解后稀釋并添加內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，制成供試品終濃度3.92 mg/mL及內(nèi)毒素終濃度為0.25 Eu/mL的溶液，測(cè)得其回收率接近100%，供試品該濃度對(duì)內(nèi)毒素測(cè)定的干擾較小。方法的精密度驗(yàn)證中，標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)3次測(cè)量結(jié)果的變異系數(shù)均＜10%，供試品加入標(biāo)準(zhǔn)曲線各濃度點(diǎn)的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品后測(cè)定3次，結(jié)果的變異系數(shù)均＜10%。準(zhǔn)確率驗(yàn)證中，供試品中加入內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為1.25，0.25，0.05 Eu/mL時(shí)回收率在91%～107%，加入內(nèi)毒素終濃度為0.01 Eu/mL時(shí)回收率為73%和86%。另外，日常檢測(cè)3批供試品的內(nèi)毒素含量均小于限值，回收率在101%～103%。結(jié)論：動(dòng)態(tài)濁度法可用于定量檢測(cè)注射用鹽酸大觀霉素的細(xì)菌內(nèi)毒素。

動(dòng)態(tài)濁度法；注射用鹽酸大觀霉素；內(nèi)毒素；定量

細(xì)菌內(nèi)毒素是藥品中最普遍和主要的致熱原，可引起機(jī)體發(fā)熱甚至休克[1]。為了保證注射用藥品的安全性，各國(guó)藥典均將內(nèi)毒素檢測(cè)列入檢查項(xiàng)目，內(nèi)毒素含量的控制也成為藥品質(zhì)控的重要對(duì)象之一[2]。

大觀霉素是一種主要用于淋病奈瑟菌所致的尿道炎、前列腺炎、宮頸炎和直腸感染[3]的氨基苷類抗菌藥，臨床常用其鹽酸鹽。《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）收載有鹽酸大觀霉素及注射用鹽酸大觀霉素，其中對(duì)于致熱物質(zhì)的檢查采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法。

目前所使用的內(nèi)毒素檢查法多為凝膠法，但其是一種半定量測(cè)定方法，無法給出準(zhǔn)確的含量，而為了更好滿足藥品檢查和生產(chǎn)過程質(zhì)控的嚴(yán)格要求，內(nèi)毒素檢測(cè)已逐漸向定量方向發(fā)展。動(dòng)態(tài)濁度法是內(nèi)毒素定量方法的一種，具有批量大，靈敏度高，檢測(cè)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)[4]，能較為真實(shí)客觀地反映藥品的質(zhì)量。相較與動(dòng)態(tài)顯色法，動(dòng)態(tài)濁度法不易受樣品干擾的影響，更適用于對(duì)鱟試劑有干擾的樣品[5]。

本文參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行試驗(yàn)，采用動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)注射用鹽酸的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證及初步應(yīng)用，為該品種建立合適的內(nèi)毒素定量方法打下基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 供試品

注射用鹽酸大觀霉素：包含注射用鹽酸大觀霉素1瓶（2 g/瓶，批號(hào)：160304，160305，160306，山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司）和苯甲醇注射液1瓶（3.2 mL/瓶，批號(hào)：1512162311，辰欣藥業(yè)股份有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

Biotek Elx808酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：150601-201581規(guī)格：80 EU/支）；動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1607150，規(guī)格：1.25 mL/支，靈敏度0.01 Eu/mL）；動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)110604，規(guī)格：0.1 mL/支，靈敏度0.5 Eu/mL）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水，湛江安度斯生物有限公司，批號(hào)：1701170，規(guī)格：5 mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定

《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）規(guī)定，注射用鹽酸大觀霉素內(nèi)毒素的限值為每0.075 Eu/mg，試驗(yàn)中注射用鹽酸大觀霉素規(guī)格為2 g/瓶，則限值可表示為150 Eu/mg。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性驗(yàn)證

取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品1支（80 Eu）加入0.8 mL BET水復(fù)溶，濃度為100 Eu/mL的儲(chǔ)備液，將10 Eu/mL標(biāo)準(zhǔn)品用BET水稀釋為1.25，0.25，0.05，0.01 Eu/mL的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素系列溶液。取無熱原微孔板，每孔加入100 μL的BET水作為陰性對(duì)照和各濃度標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)品為平行3個(gè)復(fù)孔，再加入100 μL的動(dòng)態(tài)濁度鱟試劑并混勻，放入酶標(biāo)儀中于37℃孵育70 min，每隔30 s檢測(cè)樣品在405 nm的吸光度。

以反應(yīng)時(shí)間的對(duì)數(shù)LogT為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度的對(duì)數(shù)LogC為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程，

標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性較好，且陰性對(duì)照的反應(yīng)時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低內(nèi)毒素濃度0.01 Eu/mL的反應(yīng)時(shí)間，各平行孔的CV均＜10%，標(biāo)準(zhǔn)曲線成立。

2.3 最大稀釋倍數(shù)（MVD）計(jì)算

注射用鹽酸大觀霉素樣品1瓶（2 g），用苯甲醇注射液3.2 mL復(fù)容后，經(jīng)測(cè)定總體積為5.1 mL，即濃度為392 mg/mL，限值為0.075 Eu/mg，根據(jù)

c為供試品濃度，L為限值，λ為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度0.01 Eu/mL，則MVD＝2 940（0.13 mg/mL）。

2.4 供試品干擾實(shí)驗(yàn)

根據(jù)MVD的結(jié)果，取批號(hào)為160304的供試品，用苯甲醇注射液復(fù)容后，用BET水依次稀釋5倍（78.4 mg/mL），25倍（15.68 mg/mL），50倍（7.84 mg/mL），250倍（1.57 mg/mL）4個(gè)梯度，作為供試品溶液，以制備最終稀釋分別為10倍（39.2 mg/mL），50倍（7.84 mg/mL），100倍（3.92 mg/mL）的供試品回收溶液，選擇0.25 Eu/mL作為靠近曲線中點(diǎn)的內(nèi)毒素濃度λm，將2倍于對(duì)應(yīng)稀釋濃度的供試品稀釋液與0.5Eu/mL的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)液1:1稀釋，制備內(nèi)毒素終濃度為0.25 Eu/mL的供試品回收溶液，陰性對(duì)照和供試品回收溶液均做2個(gè)平行復(fù)孔，置酶標(biāo)儀中孵育并檢測(cè)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)菌內(nèi)毒素的含量和回收率。

表1結(jié)果顯示，在動(dòng)態(tài)濁度法中，供試品濃度為3.92 mg/mL（稀釋100倍）時(shí)，其回收率平均值為100%，在50%～200%范圍內(nèi)，且接近100%，對(duì)檢測(cè)結(jié)果干擾較小，因此采用100倍稀釋液進(jìn)行檢驗(yàn)。

表1 動(dòng)態(tài)濁度法供試品干擾試驗(yàn)結(jié)果

2.5 準(zhǔn)確性驗(yàn)證

在供試品中加入內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，使其終濃度分別為1.25，0.25，0.05，0.01 Eu/mL的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，測(cè)定2個(gè)復(fù)孔，計(jì)算回收率。

檢測(cè)結(jié)果顯示，含有內(nèi)毒素終濃度為1.25，0.25，0.05 Eu/mL的注射用鹽酸大觀霉素供試品的回收率在91%～107%，而內(nèi)毒素終濃度為0.01 Eu/mL時(shí)，回收率較低，為73%和86%，但仍在50%～100%范圍內(nèi)，見表2，表明該方法準(zhǔn)確性較好。

表2 動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)供試品內(nèi)毒素含量的準(zhǔn)確性

2.6 精密性驗(yàn)證

用建立的方法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的各個(gè)濃度（1.25，0.25，0.05，0.01 Eu/mL），每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)3次，計(jì)算變異系數(shù)；在供試品中加入內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，使其終濃度分別為1.25，0.25，0.50，0.01 Eu/mL的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，測(cè)定2個(gè)復(fù)孔，測(cè)定3次，計(jì)算結(jié)果及3次結(jié)果間的變異系數(shù)（CV）。

檢測(cè)結(jié)果顯示，4個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果的CV值均＜10%，見表3；加入各濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的注射用鹽酸大觀霉素供試品檢測(cè)結(jié)果的CV值均＜10%，見表4。表明該方法精密性較好。

表3 動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的精密性

表4 動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)供試品內(nèi)毒素含量的精密性

2.7 方法的初步應(yīng)用

細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品按“2.2”項(xiàng)方法制備細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)系列溶液；三批次注射用鹽酸大觀霉素樣品按“2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并制備含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液（添加的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素終濃度為0.25 Eu/mL），每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行孔；另取2孔加入0.1 mL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照；再向上述各孔中分別加入0.1 mL動(dòng)態(tài)濁度鱟試劑，混勻后放入酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)酶標(biāo)儀的Gen軟件處理數(shù)據(jù)，并自動(dòng)計(jì)算出供試品的內(nèi)毒素含量檢測(cè)結(jié)果以及對(duì)應(yīng)的回收率。

結(jié)果顯示，對(duì)三批注射用鹽酸大觀霉素進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)，均未檢出內(nèi)毒素，見表5，結(jié)果符合規(guī)定。

表5 動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)三批次注射用鹽酸大觀霉素細(xì)菌內(nèi)毒素含量的結(jié)果

3 討論

鹽酸大觀霉素是臨床治療淋病的常用藥物，其內(nèi)毒素含量的準(zhǔn)確測(cè)定不僅是限值的測(cè)定，對(duì)其質(zhì)量控制具有重要意義。因此，本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)濁度法建立注射用鹽酸大觀霉素的內(nèi)毒素定量方法，以期更好的滿足質(zhì)控的要求。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)[6]，在凝膠法中，該品種制劑注射用鹽酸大觀霉素對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)具有一定的干擾，對(duì)此，本實(shí)驗(yàn)參照國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)資料[7-8]，采用動(dòng)態(tài)濁度法，首先考察樣品對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾情況。干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，樣品稀釋至3.92 mg/mL，其回收率在100%左右樣品，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾作用較小，該濃度與文獻(xiàn)報(bào)道中凝膠法測(cè)得的無干擾濃度3.333 mg/mL相一致[6]，所以后續(xù)檢測(cè)均采用此濃度作為供試品終濃度進(jìn)行測(cè)定。隨后對(duì)該方法的精密度進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度在0.01～1.25 Eu/mL范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，r＞0.99。樣品中加入各濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)均＜10%，回收率在50%～200%，表明該方法具有較好的精密性。在方法的準(zhǔn)確性驗(yàn)證中，當(dāng)供試品中添加的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品終濃度在1.25，0.25，0.05 Eu/mL時(shí)，回收率在91%～107%，準(zhǔn)確性較好，但在內(nèi)毒素終濃度在0.01 Eu/mL時(shí)回收率為73%和86%，回收率偏低，但仍在50%～100%范圍內(nèi)，說明該方法準(zhǔn)確性總體較好。本文依舊采用0.01 Eu/mL作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低濃度，是考慮到供試品中內(nèi)毒素含量極低，幾乎檢測(cè)不到，所以需要更低的靈敏度來測(cè)定，測(cè)得的結(jié)果可作為樣品質(zhì)控的參考。而內(nèi)毒素終濃度在0.01 Eu/mL時(shí)回收率偏低的原因，我們推測(cè)可能的原因?yàn)樵搩?nèi)毒素濃度已為動(dòng)態(tài)濁度法鱟試劑的靈敏度下限，導(dǎo)致測(cè)量準(zhǔn)確度偏低。在方法的初步應(yīng)用中，將三批樣品稀釋至終濃度為3.92 mg/mL時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，檢查結(jié)果均小于限值，結(jié)果均符合規(guī)定。

在動(dòng)態(tài)濁度法中，樣品的無干擾濃度與凝膠法一致，但是動(dòng)態(tài)濁度法具有更高靈敏度，能夠更為真實(shí)客觀的反應(yīng)樣品中的內(nèi)毒素含量，更適用于樣品生產(chǎn)過程中的質(zhì)控和對(duì)樣品質(zhì)量的監(jiān)控。

因此，用動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)注射用鹽酸大觀霉素制劑的細(xì)菌內(nèi)毒素含量的方法是可行的，且具有靈敏度高，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，能很好地滿足質(zhì)控的要求，可為完善該品種的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

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本文編輯：魯守琴

Determination of Bacterial Endotoxin Content in Spectinomycin Hydrochloride for Injection by Kinetic Turbidimetric Assay

Chen Li1, Zhang Xiao2, LiuYong-ge2, Feng Feng-jiao3
(1. Suzhou Institute for Drug Control, Jiangsu Suzhou 215104, China; 2. Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., Shangdong Jining, China; 3. China Pharmaceutical University, Jiangsu Nanjing 211198, China)

Objective：To provide a reference for developing a method for determination of bacterial endotoxin content in spectinomycin hydrochloride for injection. Methods：The standard curve for determination of bacterial endotoxin by kinetic turbidimetric assay was plotted and verfieid for reliability. The interference of samples to determination of bacterial endotoxin was investigated to determine the maximum sample concentration without interference. The method was verifed for precision and accuracy, and preliminarily applied. Results：In the reliability experiment of standard curve, all the r values of the curve were more than 0.99, indicating the validity of the standard curve. However, in the interference experiment, the samples were dissolved and diluted with benzil alcohol injection, added with standard endotoxin to prepare a solution at a fnal sample concentration of 3.92 mg/mL and a fnal endotoxin concentration of 0.25 Eu/mL. The recovery rate of endotoxin was nearly 100%, and the samples at the said concentration showed little interference to the determination of endotoxin. The coeffcients of variation of determination results of standard endotoxin at various concentrations in three tests as well as the test samples added with standard endotoxin at varoius concentrations in three tests were less than 10%. In verifcation for accuracy, the recovery rates of test samples added with standard endotoxin to fnal concentrations of 1.25, 0.25 and 0.05 Eu/mL were 91%～107%, while those at fnal endotoxin concentration of 0.01 Eu/mL were 73% and 86%. In addition, allthe endotoxin contents in three batches of samples were less than the limited value by routine test, with recovery rates of 101%～103%. Conclusion：Kinetic turbidimetric assay is applicable to the quantitative determination of bacterial endotoxin in spectinomycin hydrochloride for injection.

Kinetic Turbidimetric Assay; Spectinomycin Hydrochloride for Injection; Endotoxin; Quantitative Determination

R927.11

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.06.014

2017 - 04 - 26

陳莉，女，博士，副主任藥師。研究方向：藥品檢驗(yàn)。通訊作者E-mail:chenli7710@126.com