嚴(yán)紅，任兆瑞，曾溢滔

血友病B基因治療研究進(jìn)展

嚴(yán)紅，任兆瑞，曾溢滔

血友病 B 是一種 X 染色體連鎖的隱性遺傳性出血性疾病，患者多為男性，女性患者極為罕見(jiàn)，男性人群的發(fā)病率約為 1/25000。因患者凝血因子 IX（factor IX，F(xiàn)IX）基因突變導(dǎo)致 FIX 水平缺乏引起，癥狀的嚴(yán)重程度與體內(nèi)FIX 水平相關(guān)；重癥患者血漿 FIX 含量小于正常人的 1%，因而頻繁發(fā)生自發(fā)性出血，如關(guān)節(jié)內(nèi)出血、軟組織血腫、腹腔出血和腦出血等，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的關(guān)節(jié)病、慢性疼痛，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量甚至壽命。目前，血友病 B 的主要療法是靜脈注射 FIX 生物制品，但患者需要頻繁地接受注射，且 FIX 制品價(jià)格昂貴，造成患者及其家庭嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。

自 20 世紀(jì) 80年代 FVIII（凝血因子 VIII）和 FIX基因先后被成功克隆以來(lái)，基因治療一直為血友病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[2-3]。近 30年來(lái)血友病 B 基因治療領(lǐng)域的研究成果尤為突出，臨床研究也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展。下面就血友病 B基因治療的研究進(jìn)展及展望作一評(píng)述。

1 凝血因子 IX 的結(jié)構(gòu)和功能

FIX 是一類具有絲氨酸蛋白酶活性的凝血因子，主要由肝臟產(chǎn)生并以無(wú)活性的酶原形式分泌入血漿，它在血漿中濃度較低（2.5～5 mg/L），半衰期僅為 24 h[4]。全長(zhǎng) FIX 蛋白共含有 461 個(gè)氨基酸，其中包括一段 28 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和一段 18 個(gè)氨基酸的前肽。與凝血因子 VII 和 X一樣，F(xiàn)IX 是維生素 K 依賴性蛋白，含有一個(gè) γ-羧基谷氨酸（GLA）區(qū)域，該區(qū)域包含 12 個(gè) γ-羧基化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的正確羧基化是維持 FIX 活性所必需的[5]。血液凝集過(guò)程中，F(xiàn)IX 可被凝血因子 XIa 或組織因子/凝血因子VIIa 激活，形成活性形式 FIXa；隨后在 Ca2+和磷脂存在的條件下，F(xiàn)IXa 與 FVIII 的活性形式 FVIIIa 共同激活下游的凝血因子 X，最終導(dǎo)致血液凝集。

圖1 FIX 基因及蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

FIX 基因位于 X 染色體上，全長(zhǎng)約 33.5 kb，由 8 個(gè)外顯子和 7 個(gè)內(nèi)含子組成，mRNA 全長(zhǎng) 2802 bp。FIX 基因的 8 個(gè)外顯子共編碼蛋白的 6 個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，外顯子1 和 2 分別編碼信號(hào)肽和前肽；外顯子 3 編碼 GLA 結(jié)構(gòu)域；外顯子 4 和 5 編碼表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域（EGF-1 和EGF-2）；外顯子 6 編碼活化結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域在 FIX 被激活時(shí)被切割，從而變成 FIX 的活性形式；外顯子 7 和 8編碼催化結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域在激活 FIX 過(guò)程中起著十分重要的作用，F(xiàn)IX 基因及蛋白結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。血友病 B 主要因患者 FIX 基因突變導(dǎo)致的 FIX 蛋白活性不足而引發(fā)，其中點(diǎn)突變是最常見(jiàn)的基因突變類型（約占總突變的64%）[4]。根據(jù)血友病 B 患者體內(nèi) FIX 水平的不同，可以將患者分為 3 類：當(dāng) FIX 水平低于正常水平 1% 時(shí)為重型，患者會(huì)頻繁發(fā)生自發(fā)性出血，通常需要經(jīng)常輸注外源性FIX 控制出血；當(dāng) FIX 水平在 1%～5% 之間時(shí)為中間型，患者有自發(fā)性出血傾向，小手術(shù)或外傷后可發(fā)生嚴(yán)重出血；當(dāng) FIX 水平在 5%～40% 之間時(shí)，為輕型，患者通常只在大手術(shù)或外傷時(shí)可致嚴(yán)重出血，罕有自發(fā)性出血發(fā)生[1]。基因突變不僅可引起 FIX 凝血活性的降低，也可增加 FIX的凝血活性。我們?cè)缙诘难芯堪l(fā)現(xiàn)，當(dāng) FIX 蛋白 338 位由精氨酸變?yōu)楸彼幔≧338A）時(shí)，F(xiàn)IX 的體內(nèi)外凝血活性可提高 2.5～3 倍[6]。在一個(gè)意大利家族中也發(fā)現(xiàn)一類 FIX功能獲得性突變，F(xiàn)IX 蛋白的 338 位由精氨酸變?yōu)榱涟彼幔≧338L，也被稱為 FIX Padua），該突變導(dǎo)致 FIX 凝血活性增加 5～10 倍。這些功能獲得性突變的研究對(duì)血友病 B的基因治療和藥物開(kāi)發(fā)都起到重要的作用[7]。

FIX 的結(jié)構(gòu)及其作用特征使血友病 B 具有以下特點(diǎn)而成為研究基因治療的理想疾病模型：①由單基因突變引起，致病機(jī)制明確；② FIX 的 cDNA 長(zhǎng)度較短，便于載體攜帶；③ FIX 水平少量提高即能顯著改善疾病癥狀，據(jù)現(xiàn)有臨床研究報(bào)告，血漿 FIX 提高至正常血漿水平的 1% 以上即可顯著降低重癥患者自發(fā)性出血事件發(fā)生率；④ FIX治療的有效范圍較寬（達(dá)到正常血漿水平的 1%～100% 均可），不需對(duì) FIX 表達(dá)水平進(jìn)行嚴(yán)格控制；⑤ FIX 的主要表達(dá)器官是肝臟，但多種組織細(xì)胞都能正確地表達(dá)和修飾FIX，并分泌進(jìn)入血液；⑥已建立良好的模型動(dòng)物，包括大動(dòng)物（血友病 B 犬）和小動(dòng)物（血友病 B 小鼠）模型。

2 血友病 B 基因治療現(xiàn)狀

早在 2000年，美國(guó)費(fèi)城兒童醫(yī)院的研究人員就用腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）作為載體，向重型血友病 B 患者的骨骼肌細(xì)胞導(dǎo)入了正常人 FIX 基因。研究選擇骨骼肌細(xì)胞主要出于安全性考慮，注射處的骨骼肌可在發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)時(shí)被切除以及時(shí)終止研究，保證受試者的安全；且骨骼肌細(xì)胞雖并非人 FIX 的主要表達(dá)細(xì)胞，但體外研究表明骨骼肌細(xì)胞可以正確表達(dá)并修飾 FIX 蛋白[8]。相關(guān)臨床前研究中骨骼肌表達(dá)的 FIX 實(shí)現(xiàn)了對(duì)血友病 B 小鼠和犬的表型糾正并能維持相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間（血友病 B 小鼠中治療效果維持超過(guò) 12 個(gè)月，血友病 B 犬中治療效果維持超過(guò) 2.5年），但在此次臨床試驗(yàn)中參加研究的 3 例血友病 B 患者均未顯示同樣的治療效果[9]。后續(xù)研究表明人骨骼肌注射位點(diǎn)處可檢測(cè)到 FIX 的表達(dá)，并且表達(dá)可持續(xù)超過(guò) 10年，但產(chǎn)生的 FIX 總量不足以起到治療效果，接受治療后患者血漿 FIX 濃度仍然 ＜ 1%[10-11]；而每個(gè)注射位點(diǎn)的注射劑量和注射次數(shù)均有限制，無(wú)法通過(guò)反復(fù)注射進(jìn)一步增加骨骼肌 FIX 的表達(dá)[12]。此次試驗(yàn)的嘗試雖未獲得治療效果，但研究中也未出現(xiàn)嚴(yán)重安全問(wèn)題，這為后續(xù)臨床研究的開(kāi)展奠定了基礎(chǔ)。

此后，有 10 項(xiàng)血友病 B 基因治療的研究方案陸續(xù)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段（表 1）。吸取之前基因治療研究的經(jīng)驗(yàn)，后續(xù)的研究均將靶器官設(shè)定為 FIX 的主要表達(dá)器官——肝臟，并利用 AAV 病毒作為載體實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞特異性地表達(dá)人 FIX，和上次試驗(yàn)不同之處在于使用的載體或表達(dá)的目的基因有相應(yīng)的優(yōu)化。其中，由圣裘德兒童研究醫(yī)院發(fā)起的臨床研究（clinicaltrials.gov，編號(hào)：NCT00979238）首先傳來(lái)捷報(bào)。該項(xiàng)研究利用 FIX 密碼子優(yōu)化的、自互補(bǔ)（self-complementary）AAV（scAAV2/8-LP1-hFIXco）作為載體，對(duì) 10 名重癥患者進(jìn)行了臨床研究。相比之前研究采用的載體，scAAV2/8-LP1-hFIXco 的不同之處在于用雙鏈、互補(bǔ)的 DNA 代替 AAV 原本的單鏈 DNA，因此 AAV 感染細(xì)胞后無(wú)需依賴宿主細(xì)胞將單鏈基因組轉(zhuǎn)變?yōu)橛修D(zhuǎn)錄活性的雙鏈基因組，從而大幅增加了感染效率；除此之外還對(duì)目的基因 FIX 進(jìn)行了密碼子的優(yōu)化以增加表達(dá)量。先期披露的結(jié)果顯示，scAAV2/8-LP1-hFIXco 可增加患者體內(nèi)FIX 水平，并在 4 個(gè)月內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定水平（正常水平的 1% ～6% 之間），且可穩(wěn)定維持 3年以上，目前這些患者仍在隨訪中?；颊叩?FIX 水平與治療劑量相關(guān)，其中高劑量組（2 × 1012μg/kg）6 名患者的 FIX 水平均有升高，F(xiàn)IX 平均值達(dá)到（5.1 ± 1.7）%，患者的出血事件發(fā)生率及相應(yīng)用藥減少了 90% 以上。試驗(yàn)中并無(wú)嚴(yán)重安全事件發(fā)生，但高劑量組 4 位患者在接受治療后 7～10 周出現(xiàn)了無(wú)癥狀的轉(zhuǎn)氨酶升高（轉(zhuǎn)氨酶升高被認(rèn)為與肝臟損傷或炎癥相關(guān)），接受類固醇（氫化潑尼松）治療后，患者轉(zhuǎn)氨酶水平在 5 d內(nèi)恢復(fù)正常。這是一項(xiàng)里程碑式的研究，成功證明 AAV 作為載體的基因治療能在人體中維持較長(zhǎng)時(shí)間的相對(duì)穩(wěn)定的FIX 表達(dá)，并實(shí)現(xiàn)患者表型由重型到輕型的轉(zhuǎn)換[13-14]。

其他幾個(gè)仍在進(jìn)行的臨床研究，有兩項(xiàng)對(duì)表達(dá)的目的基因 FIX 進(jìn)行了優(yōu)化，采用 FIX 高活性變體（FIX-Padua，其 FIX 的 338 位堿基從精氨酸變?yōu)榱涟彼?，相比于野生?FIX 活性增加 5～10 倍）作為目的基因，試圖通過(guò)增加 FIX 活性提高基因治療效果（clinicaltrials.gov，編號(hào)NCT01687608 和 NCT02484092，分別于 2012年和 2015年由 Baxalta US 和 Spark Therapeutics 公司發(fā)起）。由于體內(nèi)表達(dá)非天然蛋白有可能產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫原性，因此人們最為關(guān)注的是這兩項(xiàng)試驗(yàn)是否會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的安全問(wèn)題。目前這兩項(xiàng)研究仍在進(jìn)行中，尚未有 FIX-Padua 特異的安全問(wèn)題出現(xiàn)。Spark Therapeutics 公司在 2017年的止血與血栓研究學(xué)會(huì)（HTRS）科學(xué)討論會(huì)上對(duì)研究進(jìn)展做了報(bào)告。研究結(jié)果顯示，10 名重型患者接受載體治療后（劑量為 5 ×1011μg/kg），出血事件減少 96%、治療用藥減少 99%，其中 9 名患者無(wú)需再注射 FIX 制品控制出血。治療 12 周后患者體內(nèi) FIX 活性水平可穩(wěn)定維持于 14%～81%，平均值為 33%，比先前的研究結(jié)果有大幅的提高。值得注意的是研究中并未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的安全風(fēng)險(xiǎn)，未見(jiàn)大家普遍關(guān)注的FIX 抑制物生成且無(wú)血栓事件發(fā)生，但有 2 名患者出現(xiàn)了無(wú)癥狀的轉(zhuǎn)氨酶瞬時(shí)升高及 FIX 活性降低的情況，推測(cè)原因可能是由人體對(duì)載體的免疫反應(yīng)引起。在接受口服皮質(zhì)類激素治療后，患者轉(zhuǎn)氨酶水平回歸正常值，F(xiàn)IX 活性維持穩(wěn)定水平，其中 1 位患者 FIX 活性最終穩(wěn)定在 15% 左右，而另一位患者維持在 70%～80% 之間，維持時(shí)間超過(guò)9 周。這些研究結(jié)果表明，在發(fā)生病毒衣殼免疫的患者中皮質(zhì)類激素的耐受性良好，并可控制衣殼免疫反應(yīng)。本項(xiàng)治療方案已于 2016年 7月獲得美國(guó) FDA 的突破性療法認(rèn)定[15]。

盡管臨床研究捷報(bào)頻傳，然而血友病 B 基因治療的臨床研究過(guò)程并非一帆風(fēng)順。早期 AAV 載體靶向肝臟的臨床研究中（clinicaltrials.gov，編號(hào)：NCT00076557），1 位高劑量組（2 × 1012μg/kg）患者接受治療后 2 周內(nèi) FIX 水平即上升至 11.8%，出血癥狀得到了有效的改善，甚至在手部撞擊柜子時(shí)都未出血（以往這種情況需要注射 FIX 控制出血）[10]。但是隨著患者體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶水平的迅速升高，同時(shí)FIX 水平也急速下降。轉(zhuǎn)氨酶水平在第 5 周達(dá)到最高值，以后緩慢下降，到第 12 周時(shí)恢復(fù)正常水平，與此同時(shí)患者體內(nèi) FIX 水平直降至基線水平[10,16]。這種 FIX 水平驟然下降、治療效果不能維持的現(xiàn)象在模型動(dòng)物上并未出現(xiàn)過(guò)。這一現(xiàn)象引起了大家的廣泛關(guān)注并拉開(kāi)了基因治療中抗AAV 病毒衣殼免疫研究序幕。后續(xù)的相關(guān)研究表明，T 細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì) AAV 衣殼蛋白的免疫反應(yīng)是導(dǎo)致 AAV 及AAV 感染的肝細(xì)胞被機(jī)體清除的機(jī)制，最終導(dǎo)致患者 FIX活性水平顯著下降。其具體機(jī)制的一種可能的解釋是患者在接受基因治療之前可能已經(jīng)感染過(guò)相應(yīng)野生型 AAV 病毒，從而體內(nèi)已有抗 AAV 的記憶 T 細(xì)胞，當(dāng)再次接觸 AAV時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量病毒特異的 CD8+T 細(xì)胞，降低感染效率；此外，患者肝細(xì)胞被 AAV 感染后，可將病毒的衣殼蛋白遞呈于細(xì)胞表面，T 細(xì)胞識(shí)別后最終導(dǎo)致 AAV 感染的肝細(xì)胞被特異性清除，導(dǎo)致治療效果不能維持[17]。據(jù)報(bào)道，全球約有 50% 的人群攜帶有 AAV 的天然抗體，這就極大地制約了 AAV 基因治療的應(yīng)用[18]。此外，目前所有患者在接受 AAV 基因治療后都會(huì)產(chǎn)生對(duì)病毒衣殼特異的免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生高滴度的抗 AAV 抗體，限制了同類型 AAV 基因治療的重復(fù)進(jìn)行[19]。

續(xù)表 1

上述通過(guò) AAV 作為載體向靶細(xì)胞中導(dǎo)入正常人 FIX基因進(jìn)行基因治療的方法，其導(dǎo)入的目的基因并未或者很少整合進(jìn)入靶細(xì)胞的基因組。因此有的研究方案就試圖通過(guò)鋅指酶介導(dǎo)的基因組編輯的方式直接向患者自身肝細(xì)胞導(dǎo)入FIX 基因（clinicaltrials.gov，編號(hào) NCT02695160，由Sangamo Therapeutics 公司發(fā)起，正在招募患者）。該項(xiàng)研究計(jì)劃是將目的基因定點(diǎn)整合于白蛋白基因位點(diǎn)（肝臟高表達(dá)的內(nèi)源基因，且普遍被認(rèn)為是安全位點(diǎn)），從而實(shí)現(xiàn)外源基因的安全、高效表達(dá)。雖然還不是直接替換異常的 FIX基因，但也是首次試圖在人體中進(jìn)行定點(diǎn) FIX 整合。相關(guān)的臨床前研究中，研究人員在小鼠 ROSA26 位點(diǎn)導(dǎo)入人FIX 的一個(gè)無(wú)義突變基因（Y155stop F9 minigene），構(gòu)建了一個(gè)人 FIX 突變小鼠模型，并用該模型檢測(cè)了鋅指酶在該小鼠體內(nèi)的基因糾正情況。小鼠模型的相關(guān)結(jié)果顯示鋅指酶在宿主 DNA 上實(shí)現(xiàn)了雙鏈剪切，通過(guò)同源重組修復(fù)了異?；?，并在小鼠模型實(shí)現(xiàn)人 FIX 的表達(dá)，其平均活性水平為 23%[20]。但這種通過(guò)基因編輯導(dǎo)入目的基因的方法可能存在脫靶效應(yīng)，從而造成非特異性剪切，具有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。脫靶效應(yīng)不僅與使用的內(nèi)切酶類別相關(guān)，也與內(nèi)切酶的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)水平相關(guān)。脫靶效應(yīng)是基因編輯療法面臨的最主要安全問(wèn)題。

3 影響血友病 B 基因治療效果的因素

3.1 載體的影響

1998年研究人員曾采用質(zhì)粒作為載體對(duì)血友病 B 進(jìn)行過(guò)研究，但由于轉(zhuǎn)染效率低下且難于實(shí)現(xiàn)目的基因的持續(xù)表達(dá)，無(wú)法真正應(yīng)用于臨床。目前基因治療多用轉(zhuǎn)導(dǎo)效率更高的病毒作為載體，主要分為兩類：整合型病毒，如慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒，該類病毒感染細(xì)胞后可將目的基因整合入宿主細(xì)胞的基因組；非整合型病毒，如 AAV，這類病毒感染細(xì)胞后并不將目的基因整合入宿主細(xì)胞基因組，插入突變的風(fēng)險(xiǎn)較低，但需要感染壽命長(zhǎng)的靜止期細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)目的基因的長(zhǎng)期表達(dá)，如肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞或肌肉細(xì)胞。表 2 列出了基因治療常用病毒載體的情況。

表2 基因治療常用病毒載體及特點(diǎn)

出于安全性考慮，目前血友病 B 基因治療主要采用AAV 作為載體，經(jīng)外周靜脈注射靶向肝臟表達(dá)人 FIX。但如前所述，人群中存在一定比例的人攜帶 AAV 天然抗體，一項(xiàng)對(duì)健康歐洲人群的研究結(jié)果顯示，有 59% 的人含有AAV2 天然中和抗體，19% 的人含有 AAV8 天然中和抗體，5% 的人含有 AAV5 天然中和抗體[21]。AAV 天然中和抗體及對(duì) AAV 衣殼蛋白特異的細(xì)胞免疫，是 AAV 作為載體治療血友病 B所面臨的主要問(wèn)題，限制了其在肝炎患者及攜帶天然抗體的患者中的應(yīng)用。另外接受過(guò) AAV 治療的患者可能會(huì)對(duì)相應(yīng)亞型的載體產(chǎn)生抗體，無(wú)法重復(fù)進(jìn)行同種載體的基因治療。

相對(duì)于 AAV，慢病毒可攜帶更長(zhǎng)的目的基因，更適用于血友病 A 的基因治療（FVIII 的 cDNA 長(zhǎng)度更長(zhǎng)）；此外，近年來(lái)對(duì)慢病毒載體的改進(jìn)使得它的安全性有了很大提升；已知對(duì)慢病毒有天然抗體的人也較少，這些因素使得慢病毒在臨床研究中也具有一定的優(yōu)勢(shì)[21]。

早期基因治療使用的病毒載體中包含大量的空載病毒（＞ 80%），這可能是引起免疫反應(yīng)的主要因素；但是也有研究認(rèn)為空載病毒能起到“陷阱”作用，攔截患者體內(nèi)原本存在的抗 AAV 中和抗體，或者作為衣殼特異細(xì)胞毒 T 細(xì)胞的靶點(diǎn)，提高目的基因的感染效率，但是這種理論還有待證實(shí)[21-24]?，F(xiàn)可通過(guò)增加純化步驟來(lái)降低產(chǎn)品中空載病毒的比例，讓最終產(chǎn)品中空載病毒的含量不超過(guò) 10%。目前，F(xiàn)IX-Padua 的兩項(xiàng)臨床研究都采用這種空載病毒含量低的產(chǎn)品進(jìn)行研究，最終空載病毒是否效果更好還需進(jìn)一步的評(píng)判[21]。

3.2 宿主細(xì)胞的影響

宿主細(xì)胞的選擇對(duì)于基因治療的成功起著關(guān)鍵作用。血友病 B 的臨床研究最初選擇的宿主細(xì)胞是骨骼肌細(xì)胞，因當(dāng)時(shí)病毒載體還需要通過(guò)肝動(dòng)脈注射感染肝臟細(xì)胞，有一定的安全風(fēng)險(xiǎn)；且可通過(guò)切除相應(yīng)骨骼肌組織隨時(shí)終止研究以保證患者的安全。問(wèn)題是骨骼肌細(xì)胞雖然可以表達(dá) FIX，但表達(dá)量卻不足以實(shí)現(xiàn)表型糾正[9]。目前，血友病 B 基因治療研究的宿主細(xì)胞均為 FIX 的原始表達(dá)細(xì)胞——肝細(xì)胞，它可高效表達(dá)并完整地對(duì) FIX 進(jìn)行翻譯后修飾。

但是對(duì)一些不能以肝臟作為靶器官的患者（如肝病患者等），發(fā)展他種靶細(xì)胞進(jìn)行基因治療仍有一定的意義。除了直接輸注病毒感染體內(nèi)細(xì)胞的基因治療外，還可以通過(guò)體外感染靶細(xì)胞，再經(jīng)體外擴(kuò)增、移植靶細(xì)胞的方式進(jìn)行基因治療，這種方式稱為離體基因治療，也常被稱為細(xì)胞治療。早在 1996年，我國(guó)科學(xué)家就曾嘗試用患者自身成纖維細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究，結(jié)果表明成纖維細(xì)胞治療的安全性較好，未有嚴(yán)重的安全問(wèn)題，F(xiàn)IX 的活性水平最高達(dá) 4%，但表達(dá)為瞬時(shí)的，不能維持較長(zhǎng)的時(shí)間[25]。細(xì)胞治療通常選擇具有增殖能力的細(xì)胞作為靶細(xì)胞，如造血干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等。其中，間充質(zhì)細(xì)胞因易于分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增，且免疫原性低、能定植于多種臟器、組織，實(shí)現(xiàn)外源基因的長(zhǎng)久表達(dá)而成為細(xì)胞治療的常用細(xì)胞。我們?cè)谘巡?A 小鼠模型上進(jìn)行過(guò)間充質(zhì)干細(xì)胞的治療研究，結(jié)果表明間充質(zhì)干細(xì)胞可表達(dá)具有生物活性的人 FVIII，并能夠改善血友病模型動(dòng)物表型，但仍存在不能長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的問(wèn)題[26]。因在體外進(jìn)行病毒感染，可避免機(jī)體與病毒載體的直接接觸從而有更高的安全性，但如何實(shí)現(xiàn)在靶細(xì)胞中 FIX 的高水平表達(dá)和長(zhǎng)期表達(dá)還是需要解決的問(wèn)題[27]。

3.3 目的基因的影響

FIX 存在一系列功能增強(qiáng)型突變型，如前述的FIX-Padua，單個(gè)堿基的突變可使 FIX 活性增加 5～10 倍。臨床研究中很難通過(guò)加大病毒載體劑量的方式來(lái)提高體內(nèi)FIX 活性水平，而使用這種高活性 FIX 突變型可降低病毒載體劑量，增加安全性，或在同等劑量條件下增加體內(nèi) FIX水平，實(shí)現(xiàn)表型的“治愈”。不過(guò)表達(dá)非天然存在蛋白有引起免疫毒性的風(fēng)險(xiǎn)，這是人們最為關(guān)注的問(wèn)題。但現(xiàn)有的臨床研究中并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)安全風(fēng)險(xiǎn)，也未見(jiàn) FIX 抑制物生成。這與在小鼠模型、犬模型中的臨床前研究結(jié)果一致。臨床前動(dòng)物試驗(yàn)還表明，基因治療有誘導(dǎo)免疫耐受的潛在作用，具體機(jī)制還不明確，推測(cè)可能是通過(guò)調(diào)節(jié) T 細(xì)胞功能實(shí)現(xiàn)，而臨床結(jié)果似乎與臨床前研究結(jié)果相符合[21,28-29]。

4 小結(jié)與展望

血友病 B 基因治療研究迄今已經(jīng)歷了 20 余年，是遺傳病基因治療研究的一個(gè)典范。當(dāng)前血友病 B的基因治療主要通過(guò) AAV 病毒向靶細(xì)胞導(dǎo)入正常 FIX 基因表達(dá)活性 FIX 蛋白的方式進(jìn)行?？上驳氖?，近期的臨床研究顯示，基因治療已實(shí)現(xiàn)了對(duì)血友病 B 患者的表型糾正，有效地控制了出血癥狀。但是，AAV 載體帶來(lái)的相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)仍然存在，限制了對(duì)攜帶有天然 AAV 中和抗體的患者及肝炎患者的應(yīng)用，且無(wú)法對(duì)患者進(jìn)行 AAV 重復(fù)治療來(lái)增強(qiáng)治療效果，這是血友病 B 的 AAV 病毒載體基因治療目前所面臨的一個(gè)主要問(wèn)題。

最為理想的基因治療方式應(yīng)該是在 DNA 水平實(shí)現(xiàn)對(duì)異?；虻摹靶迯?fù)”。隨著基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，如鋅指酶，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALEN），特別是規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列/規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列-相關(guān)蛋白 9（CRISPR/Cas9）系統(tǒng)的發(fā)展，基因組編輯效率得到了很大提升，基于基因組編輯的血友病 B 基因治療，將會(huì)是血友病 B 基因治療領(lǐng)域的重點(diǎn)研究方向?；蚪M編輯的安全性風(fēng)險(xiǎn)主要是非特異剪切和核酸酶的免疫原性；提高基因組編輯的效率，在靶細(xì)胞中產(chǎn)生足夠量的 FIX 蛋白是面臨的主要技術(shù)問(wèn)題。

基因治療是最有可能治愈血友病的療法，盡管目前還面臨著安全、倫理、普及性和費(fèi)用等諸多方面帶來(lái)的困難和挑戰(zhàn)，但隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，更高效、安全策略的出現(xiàn)，通過(guò)基因治療并最終治愈血友病 B 的愿望不久將能實(shí)現(xiàn)。

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第一屆中國(guó)生物診斷高峰論壇圓滿結(jié)束

為適應(yīng)政府職能轉(zhuǎn)變的社會(huì)需求，積極發(fā)揮行業(yè)組織的前臺(tái)服務(wù)功能，更好地促進(jìn)我國(guó)體外診斷（IVD）技術(shù)進(jìn)步與產(chǎn)業(yè)規(guī)范化健康發(fā)展。在中國(guó)食品藥品檢定研究院的直接參與和鼎力支持下，由中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)生物診斷技術(shù)分會(huì)主辦、鄭州安圖生物工程有限公司承辦的“第一屆中國(guó)生物診斷高峰論壇”于 2017年 7月 20 – 22日在中原大地古都鄭州召開(kāi)。

本次大會(huì)榮幸地邀請(qǐng)到在生物診斷領(lǐng)域具有卓越成就的莊輝院士、程京院士、國(guó)家相關(guān)管理部門和中國(guó)食品藥品檢定研究院的領(lǐng)導(dǎo)以及相關(guān)知名專家就當(dāng)今生物診斷技術(shù)的最新研究進(jìn)展與應(yīng)用、我國(guó)生物診斷技術(shù)與產(chǎn)品的管理標(biāo)準(zhǔn)與新政解讀發(fā)表主旨演講。來(lái)自全國(guó)各地生物診斷領(lǐng)域“產(chǎn)、學(xué)、研、用、管”各方面的專家和代表共計(jì) 500 多人參加了交流和討論。

大會(huì)開(kāi)幕式由中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)生物診斷技術(shù)分會(huì)主任委員李銀太主持，他首先代表大會(huì)組委會(huì)對(duì)所有在百忙中出席這次高峰論壇的嘉賓和同行們表示熱烈的歡迎和誠(chéng)摯的謝意！對(duì)為本次大會(huì)成功召開(kāi)付出辛勞的單位、個(gè)人，以及為大會(huì)提供支持的相關(guān)企業(yè)一并表示衷心的感謝！

隨后，中國(guó)食品藥品檢定研究院王佑春副院長(zhǎng)代表大會(huì)組委會(huì)致歡迎詞；河南省食品藥品監(jiān)督管理局尹建副局長(zhǎng)和中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)李少麗副理事長(zhǎng)分別發(fā)表了熱情洋溢的講話。

為了能給出席會(huì)議的代表提供更多學(xué)習(xí)和掌握信息的機(jī)會(huì)，本次論壇采用主會(huì)場(chǎng)特邀報(bào)告與分會(huì)場(chǎng)專題研討相結(jié)合的方式開(kāi)展交流。

在 7月 21日上午主論壇上，中國(guó)工程院莊輝院士、程京院士，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院王升啟研究員，重慶醫(yī)科大學(xué)黃愛(ài)龍教授，中國(guó)食品藥品檢定研究院王佑春研究員，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)與生物計(jì)量研究所王晶研究員，分別發(fā)表了“乙肝診斷與療效監(jiān)測(cè)新進(jìn)展”、“感染性疾病的精準(zhǔn)診斷”、“表面增強(qiáng)拉曼檢測(cè)技術(shù)及其應(yīng)用”、“精準(zhǔn)診斷與精準(zhǔn)治療——乙肝血清學(xué)標(biāo)志物再認(rèn)識(shí)”、“二代測(cè)序診斷試劑的技術(shù)要求及質(zhì)量評(píng)價(jià)”與“國(guó)家生物計(jì)量和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)”的主旨演講。

7月 21日下午，大會(huì)分別開(kāi)設(shè)了“血液篩查與輸血安全”、“生物診斷新技術(shù)新方法與檢測(cè)原材料標(biāo)準(zhǔn)化”、“分子診斷”、“臨床檢驗(yàn)技術(shù)發(fā)展與轉(zhuǎn)化”4 個(gè)專題分論壇進(jìn)行研討。先后有 30 多位知名專家分別針對(duì)相關(guān)熱點(diǎn)作了精彩的報(bào)告。

7月 22日上午，大會(huì)特邀國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械注冊(cè)管理司一處胡雪燕副調(diào)研員、藥品化妝品注冊(cè)管理司生物制品處白鶴副調(diào)研員、國(guó)家藥典委員會(huì)生物制品標(biāo)準(zhǔn)處郭中平處長(zhǎng)、中國(guó)食品藥品檢定研究院體外診斷試劑檢定所白東亭所長(zhǎng)、醫(yī)療器械標(biāo)準(zhǔn)管理研究所母瑞紅副所長(zhǎng)分別就“診斷試劑法規(guī)解讀”、“我國(guó)血源篩查試劑管理法規(guī)解讀與發(fā)展趨勢(shì)”、“《中國(guó)藥典》體外診斷試劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立相關(guān)原則”、“國(guó)家體外診斷試劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制進(jìn)展”、“新形勢(shì)下醫(yī)療器械標(biāo)準(zhǔn)管理新進(jìn)展”等發(fā)表了主旨演講。

此外，生物芯片上海國(guó)家工程中心主任郜恒駿教授、第四軍醫(yī)大學(xué)附屬西京醫(yī)院檢驗(yàn)科主任郝曉柯教授還應(yīng)邀分別發(fā)表了“從樣品到產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化研究與精準(zhǔn)醫(yī)療”、“外泌體在腫瘤診斷與治療中的應(yīng)用”的精彩報(bào)告。

在中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)的領(lǐng)導(dǎo)下，在與會(huì)專家和代表的共同努力下，第一屆中國(guó)生物診斷高峰論壇受到與會(huì)人員的高度評(píng)價(jià)和認(rèn)可，取得了圓滿成功。大會(huì)組委會(huì)感謝所有給予關(guān)心和支持的廣大同行，期待著下次會(huì)議再相聚。

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.007

中國(guó)工程院咨詢研究項(xiàng)目（2016XY36）；國(guó)家自然科學(xué)基金（81500108）

200040 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/上海市兒童醫(yī)院/上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳研究所/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)胚胎與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/上海市胚胎與生殖工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

曾溢滔，Email：ytzeng@stn.sh.cn

2017-05-15