王冰潔，周君梅，李玲玲，陳方

己烯雌酚對(duì)人類(lèi)高位和低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞的影響

王冰潔，周君梅，李玲玲，陳方

目的研究外源性雌激素己烯雌酚（DES）在體外對(duì)高位和低位隱睪患兒睪丸引帶細(xì)胞的影響。

方法以麻醉下未降睪丸的位置位于內(nèi)環(huán)口以上的腹腔型隱睪為高位組，已出內(nèi)環(huán)口但未出外環(huán)口的腹股溝管型隱睪為低位組，分別收集高、低位隱睪患兒術(shù)中的廢棄引帶，經(jīng)IV 型膠原酶消化后原代培養(yǎng)、比較其形態(tài)和細(xì)胞骨架的差別；將兩組細(xì)胞分別培養(yǎng)于溶劑對(duì)照組（DMSO）和 DES 濃度梯度為 0.01、0.1、1 及 10 μg/ml 的培養(yǎng)基內(nèi) 24 h。以鬼筆環(huán)肽標(biāo)記法示 DES 作用前后細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；CCK-8 法檢測(cè)其增殖能力的變化；熒光定量 PCR 法檢測(cè)RXFP2 基因相對(duì)表達(dá)量的差異。

結(jié)果人類(lèi)高位和低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞大部分為成纖維細(xì)胞樣，其中低位組的細(xì)胞可自發(fā)融合成多核肌管樣細(xì)胞。高濃度 DES（10 μg/ml）可抑制人類(lèi)高、低位隱睪的睪丸引帶細(xì)胞的增殖、改變細(xì)胞的光鏡特征和微絲骨架，但是其對(duì)兩組細(xì)胞的影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。高濃度 DES 上調(diào)兩組細(xì)胞 RXFP2 的表達(dá)水平。

結(jié)論人類(lèi)高、低位隱睪的睪丸引帶細(xì)胞具有不同的形態(tài)特征；高濃度外源性雌激素可改變高位和低位隱睪的睪丸引帶細(xì)胞骨架、抑制細(xì)胞的增殖活力并上調(diào)人類(lèi)引帶 RXFP2 基因的表達(dá)。

隱睪； 睪丸引帶細(xì)胞； 己烯雌酚

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2017, 12(4):310-316

隱睪中高位隱睪約占 10%[1]，臨床發(fā)現(xiàn)，未降睪丸位置越高，其發(fā)育越差[2]，且手術(shù)并發(fā)癥發(fā)生率越高[3]，但隱睪未降睪丸位置高低不一的原因目前尚未闡明。人類(lèi)睪丸引帶發(fā)育異常是隱睪發(fā)生的重要因素之一[4-5]。睪丸引帶主要由細(xì)胞外基質(zhì)及間充質(zhì)細(xì)胞（主要包括成纖維細(xì)胞、少量平滑肌細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞）構(gòu)成[6]。已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)人類(lèi)高位隱睪及低位隱睪睪丸引帶的細(xì)胞基質(zhì)成分中總膠原成分存在差異[7]，提示引帶組織的發(fā)育和功能在人類(lèi)高、低位隱睪中不盡相同。目前動(dòng)物研究已發(fā)現(xiàn)外源性雌激素己烯雌酚（DES）可改變小鼠睪丸引帶細(xì)胞的微絲骨架并抑制其增殖[8]，其對(duì)人類(lèi)睪丸引帶的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。DES 是否通過(guò)影響睪丸引帶，繼而影響到睪丸的下降和停留位置尚有待研究。

基于以上原因，本實(shí)驗(yàn)擬首先對(duì)人類(lèi)高位及低位隱睪睪丸引帶進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)、觀察其形態(tài)差異，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究外源性 DES 對(duì)兩組細(xì)胞的作用及其差異，探尋其與高、低位隱睪發(fā)生的關(guān)系，以期為隱睪的防治提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來(lái)源 人類(lèi)睪丸引帶組織來(lái)源于上海市兒童醫(yī)院泌尿外科的隱睪患兒，患兒術(shù)前均明確診斷為隱睪，未伴發(fā)其他泌尿生殖系統(tǒng)畸形，且未接受內(nèi)分泌治療及其他促進(jìn)睪丸下降的治療。根據(jù)麻醉后未降睪丸的位置分為 2 組，麻醉下未降睪丸的位置位于內(nèi)環(huán)口以上的腹腔型隱睪為高位組，出內(nèi)環(huán)口但未出外環(huán)口的為低位組。本研究已通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（編號(hào)：2016R009-F01），標(biāo)本采集已征得患兒家長(zhǎng)的知情同意。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)材料 DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、青鏈霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、胎牛血清、IV 型膠原酶、胰酶均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO）、DES 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；Trizol 試劑購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本 Takara 公司；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 試劑盒購(gòu)自瑞士 Roche 公司；引物設(shè)計(jì)及合成由上海生工生物工程公司承擔(dān)；鬼筆環(huán)肽及 CCK-8 試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡購(gòu)自德國(guó) Leica 公司；生物安全柜購(gòu)自新加坡 Esco 公司；二氧化碳培養(yǎng)箱及紅光/紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó) Thermo 公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)BMG Labtech 公司；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 睪丸引帶細(xì)胞的培養(yǎng) 手術(shù)切取睪丸引帶組織后立即放入完全培養(yǎng)基（DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加 10% 胎牛血清、1% 青鏈霉素、L-谷氨酰胺及非必需氨基酸）并密封于冰上，低溫運(yùn)送至生物安全柜操作。取出組織用 IV 型膠原酶（1 mg/ml）37 ℃ 水浴消化 1 h 后，1000 r/min 離心 4 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸，吹打洗滌，再次1000 r/min 離心 4 min，棄上清。細(xì)胞沉淀加入完全培養(yǎng)基，吹勻后接種于 4 孔板中，置于 5% CO2、37 ℃ 飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)。48～72 h 換液1 次，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá) 90% 融合后進(jìn)行傳代。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 分別培養(yǎng)高位及低位隱睪的第3 代睪丸引帶細(xì)胞用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，高位組及低位組細(xì)胞各分為 6 組：正常對(duì)照組以完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；溶劑對(duì)照組在完全培養(yǎng)基中加入 0.1% DMSO；其余 4 組分別以含 DES 終濃度為 0.01、0.1、1 及10 μg/ml 的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。各組細(xì)胞于 5% CO2、37 ℃ 條件下培養(yǎng) 24 h 用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 分別取高、低位隱睪的睪丸引帶細(xì)胞爬片，PBS 洗 3 次，每次 5 min；加入 4% 多聚甲醛室溫固定 30 min；PBS 洗滌3 次，每次 5 min；加入鬼筆環(huán)肽避光孵育 30 min，然后 PBS 洗滌 3 次，DAPI 復(fù)染核后封片，熒光顯微鏡觀察。

1.2.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖與活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的兩組隱睪睪丸引帶細(xì)胞，將其接種于 96 孔板，2 × 104個(gè)細(xì)胞/孔。按 1.2.2 分組，誘導(dǎo) 24 h 后分別加入 CCK-8，避光置于 37 ℃ 培養(yǎng)箱中孵育2 h，檢測(cè)每孔 450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力（%）=（A實(shí)驗(yàn)組–A空白組）/（A對(duì)照組–A空白組）× 100%

1.2.5 細(xì)胞總 RNA 抽提及 RT-PCR 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的高位及低位隱睪的睪丸引帶細(xì)胞，Trizol 法抽提總 RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行熒光定量 PCR 檢測(cè)：①增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）基因表達(dá)水平，引物正向序列5' TCTGAGGGCTTCGACACCTA 3'，反向序列5' CGCG TTATCTTCGGCCCTTA 3'；②松弛素/胰島素樣家族肽受體 2（RXFP2）基因表達(dá)水平，引物正向序列 5' ACTCAACTGGGTGGATTTGGA 3'，反向序列 5' TGTCTTCTCTGGAACAAAACCAA 3'；③內(nèi)參基因?yàn)楦视腿?3-磷酸脫氫酶（GAPDH），其正向序列 5' GCACCGTCAAGGCTGAGAAC 3'，反向序列 5' TGGTGAAGACGCCAGTGGA 3'。實(shí)驗(yàn)中所用引物濃度均為 10 μmol/L，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 預(yù)變性 10 min；95 ℃ 變性 10 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 30 s，40 個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，高位及低位組組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；高、低位組內(nèi)各濃度組之間比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05 即認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)高位組招募 7 例患兒，低位組招募22 例患兒分別進(jìn)行睪丸引帶原代細(xì)胞培養(yǎng)，其中高位組成功培養(yǎng)出 5 例，低位組成功培養(yǎng)出 16 例；兩組各取 3 例進(jìn)行引帶細(xì)胞 DES 刺激實(shí)驗(yàn)。

2.1 DES 作用下隱睪睪丸引帶細(xì)胞的光鏡特征

研究發(fā)現(xiàn)，高位組引帶細(xì)胞光鏡下細(xì)胞形態(tài)為成纖維樣細(xì)胞，胞體呈梭型或不規(guī)則多邊形，胞質(zhì)有突起，胞核圓（圖 1A）；高位組引帶細(xì)胞在溶劑對(duì)照組及低濃度 DES（0.01、0.1 和 1 μg/ml）作用下未見(jiàn)明顯形態(tài)改變；而在高濃度 DES（10 μg/ml）作用下，細(xì)胞開(kāi)始從蓋玻片表面脫離，死亡明顯增多，存活細(xì)胞胞體皺縮（圖 1B）；低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞的培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)部分細(xì)胞自發(fā)出現(xiàn)細(xì)胞融合現(xiàn)象，表現(xiàn)為多核肌管樣細(xì)胞，胞體大而長(zhǎng)，多個(gè)胞核并排于胞質(zhì)中（圖 1C 白色箭頭）；低位溶劑對(duì)照組及低濃度 DES（0.01、0.1 和1 μg/ml）作用下未見(jiàn)明顯形態(tài)改變；低位組細(xì)胞在高濃度 DES（10 μg/ml）作用下發(fā)生了類(lèi)似高位組的變化（圖 1D）。

2.2 己烯雌酚可改變?nèi)祟?lèi)高、低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞的微絲骨架

圖1 DES 對(duì)高、低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞形態(tài)的影響（白色箭頭示多核細(xì)胞）Figure 1 Effects of DES on morphology of cryptorchidism testis gubernaculum cell in high and low position (White arrows show multinucleated cells)

圖2 鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的 DES 對(duì)高、低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞骨架的影響（白色箭頭示多核細(xì)胞）Figure 2 Effects of DES on cytoskeleton of cryptorchidism testis gubernaculum cell in high and low position (White arrows show multinucleated cells)

鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的肌動(dòng)蛋白絲（F-actin）熒光染色顯示，高位隱睪引帶細(xì)胞微絲骨架（綠色）清晰，肌動(dòng)蛋白分布均勻（圖 2A）；高位組引帶細(xì)胞在溶劑對(duì)照組及低濃度 DES（0.01、0.1 和 1 μg/ml）作用下未見(jiàn)明顯細(xì)胞骨架改變；而在高濃度 DES（10 μg/ml）作用后，鏡下觀察可見(jiàn)死細(xì)胞增多，存活細(xì)胞肌動(dòng)蛋白纖維排列紊亂，細(xì)胞骨架重塑（圖 2B）；低位組隱睪引帶細(xì)胞骨架清晰，肌動(dòng)蛋白骨架舒展且分布均勻，多個(gè)細(xì)胞核（藍(lán)色）位于一個(gè)細(xì)胞內(nèi)（圖 2C 白色箭頭）；低位組引帶細(xì)胞在溶劑對(duì)照組及低濃度 DES（0.01、0.1 和1 μg/ml）作用下未見(jiàn)明顯形態(tài)改變；而在高濃度DES（10 μg/ml）作用后，鏡下觀察低位引帶細(xì)胞骨架也發(fā)生與高位組類(lèi)似重塑改變（圖 2D）。

2.3 己烯雌酚可抑制人類(lèi)高、低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞的增殖并上調(diào) RXFP2 表達(dá)量

高、低位溶劑對(duì)照組與正常對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異，高位組 DES 作用 24 h 后的細(xì)胞增殖活力數(shù)值分別為（98.47 ± 6.58）%、（99.68 ±3.48）%、（99.42 ± 3.20）%、（98.41 ± 2.11）%、（72.07± 5.71）%，但是只有高濃度 DES（10 μg/ml）與對(duì)照組相比存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P= 0.0005）；低位組DES 的細(xì)胞增殖活力數(shù)值分別為（95.44 ± 3.97）%、（96.53 ± 3.01）%、（91.15 ± 8.59）%、（83.16 ±6.11）%、（67.77 ± 3.01）%，也呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，但只有 10 μg/ml 濃度組與對(duì)照組存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P= 0.038）（圖 3A）。為此，我們分別檢測(cè)了高、低位組細(xì)胞在高濃度 DES 組的 PCNA 表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)高濃度 DES 組處理后兩組細(xì)胞的 PCNA均下降（P= 0.002，圖 3B），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在高濃度 DES 處理后高、低位引帶細(xì)胞的 INSL3 受體 RXFP2 表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（圖 3C）；但 DES 對(duì)高、低位兩組的細(xì)胞增殖的抑制影響、PCNA 及 RXFP2 的表達(dá)水平改變均沒(méi)有顯著性差異。

圖3 DES 對(duì)高、低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞增殖活力及相關(guān)基因表達(dá)量影響（*P＜ 0.05，**P＜ 0.01）（A：DES 作用 24 h 后高、低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞增殖力變化；B：10 μg/ml DES 作用 24 h 后高、低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞 PCNA 相對(duì)表達(dá)量的變化；C：10 μg/ml DES 作用 24 h 后高、低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞 RXFP2 相對(duì)表達(dá)量的變化）Figure 3 Effects of DES on proliferation vitality and related gene expression of cryptorchidism testis gubernaculum cell in high and low position (*P＜ 0.05,**P＜ 0.01) (A: The change of cell proliferation vitality after exposure to DES for 24 h in the high and low group; B: The change of PCNA relative expression after exposure to DES 10 μg/ml for 24 h in the two groups; C: The change of RXFP2 relative expression after exposure to DES 10 μg/ml for 24 h in the two groups)

3 討論

隱睪睪丸位置高低與睪丸發(fā)育和手術(shù)效果密切相關(guān)[1,9]，目前針對(duì)高、低位隱睪的研究多集中于手術(shù)方式的改良，而高位和低位隱睪的發(fā)病機(jī)制有何差異仍有待研究，睪丸引帶異常是引起隱睪的重要病因，其與高、低位隱睪發(fā)生的關(guān)系有待研究。

我院兒童專(zhuān)科醫(yī)院特色生物樣本庫(kù)的建立為隱睪等先天性疾病的研究提供了實(shí)驗(yàn)平臺(tái)[10]。隱睪是出生后才可明確診斷的以臨床癥狀命名的疾病，在胚胎期尚無(wú)法推測(cè)其出生后睪丸能下降的最終位置，且人類(lèi)胚胎睪丸引帶采集涉及備受爭(zhēng)議的倫理問(wèn)題，故本研究采集的標(biāo)本系隱睪形成后的引帶而不是形成過(guò)程中的引帶。Robbins 等[11]在大鼠的胚胎睪丸引帶中培養(yǎng)出長(zhǎng)條的多核肌管細(xì)胞，提示正常胚胎睪丸引帶應(yīng)具有向肌細(xì)胞分化的潛能。本研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)低位隱睪睪丸引帶原代培養(yǎng)的部分細(xì)胞在體外可自發(fā)融合成多核肌管樣細(xì)胞，考慮到原代細(xì)胞培養(yǎng)存在一定細(xì)胞損耗，因而并非所有低位隱睪引帶均可培養(yǎng)出肌管細(xì)胞。這與 Robbins 等對(duì)大鼠胚胎睪丸引帶－提睪肌復(fù)合體原代培養(yǎng)出的間充質(zhì)細(xì)胞融合成多核肌管細(xì)胞的現(xiàn)象相一致。而在人類(lèi)高位睪丸引帶原代培養(yǎng)的細(xì)胞均未觀察到多核肌管細(xì)胞形成。以上結(jié)果提示，人類(lèi)隱睪睪丸引帶在發(fā)育過(guò)程中具有肌肉樣細(xì)胞的成分差異，該差異可能會(huì)影響下降睪丸的最終停留位置，其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明，環(huán)境因素可影響人類(lèi)健康[12]，其中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)（endocrine-disrupting chemicals，EDCs）與隱睪的發(fā)生相關(guān)，其代表因子 DES 可通過(guò)影響機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)進(jìn)而干擾生殖系統(tǒng)的發(fā)育和功能[13]，使動(dòng)物及人類(lèi)后代隱睪發(fā)病率升高[14-15]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn) DES 可致小鼠睪丸引帶細(xì)胞骨架重塑、細(xì)胞周邊肌動(dòng)蛋白絲帶模糊、應(yīng)力纖維增加[16-17]。細(xì)胞骨架是由細(xì)長(zhǎng)的蛋白質(zhì)聚合物纖維形成的網(wǎng)絡(luò)，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架纖維的組裝和拆解存在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，其重組的調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、收縮、運(yùn)動(dòng)、分裂和增殖的過(guò)程至關(guān)重要[18]。DES 對(duì)小鼠引帶細(xì)胞的影響提示其可致 F-actin 發(fā)生解聚、形成應(yīng)力纖維，導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞骨架排列紊亂，繼而可能降低細(xì)胞的收縮、影響其分裂和增殖。綜上所述，DES 可改變小鼠引帶細(xì)胞骨架形態(tài)并影響其增殖功能，但目前尚沒(méi)有針對(duì)其他種屬的睪丸引帶細(xì)胞做相關(guān)的研究驗(yàn)證工作，故本研究在睪丸引帶動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上進(jìn)行 DES 對(duì)人類(lèi)引帶細(xì)胞的骨架及增殖功能研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度 DES（10 μg/ml）影響人類(lèi)高位和低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞、導(dǎo)致細(xì)胞 F-actin骨架重塑、細(xì)胞死亡增多，這與之前在小鼠睪丸引帶細(xì)胞中觀察到的結(jié)果相似[16-17]；此外，隨著 DES暴露濃度的增加，僅見(jiàn)高濃度 DES 對(duì)高位和低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞的增殖均具有明顯抑制作用，且兩組細(xì)胞在高濃度狀態(tài)下的 PCNA 表達(dá)均顯著下調(diào)也進(jìn)一步證實(shí)了該現(xiàn)象，而低濃度亞組均未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果提示，DES 可能通過(guò)濃度依賴(lài)的方式改變高、低位隱睪睪丸引帶細(xì)胞的細(xì)胞骨架、影響 F-actin 組裝和拆解的動(dòng)態(tài)平衡、繼而導(dǎo)致細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重塑，由此阻礙了細(xì)胞分裂的過(guò)程、導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力的下降和收縮力的改變、繼而影響到睪丸引帶的發(fā)育、導(dǎo)致隱睪的發(fā)生。本研究未發(fā)現(xiàn)各濃度組的 DES 對(duì)高位和低位引帶細(xì)胞的作用具有明顯差異，其原因可能在于 DES對(duì)于各個(gè)階段的細(xì)胞均具有毒性作用，一旦不同發(fā)育階段的胚胎接觸到 DES，即會(huì)對(duì)該階段的細(xì)胞產(chǎn)生影響，根據(jù)受 DES 影響時(shí)的不同胎齡而導(dǎo)致不同結(jié)果，出生后表現(xiàn)為高位或低位隱睪。

此外，已有研究證實(shí)，RXFP2 與引帶發(fā)育密切相關(guān)[19]。目前有學(xué)者以小鼠胚胎期宮內(nèi)暴露于DES 后雄性后代的睪丸引帶為研究對(duì)象檢測(cè)RXFP2 的受體表達(dá)水平的改變，以期探尋 DES 對(duì)睪丸引帶作用的內(nèi)分泌通路。該課題組發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)暴露于 DES（50 μg/kg·d）RXFP2 表達(dá)水平較對(duì)照組升高[20]。此外，李建宏等[21]在體外用 DES（10 μg/ml）刺激小鼠引帶原代細(xì)胞后，其 RXFP2 表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)，與胚胎期宮內(nèi)暴露引帶的結(jié)果相一致。上述結(jié)果均與本實(shí)驗(yàn)中人類(lèi)高、低位引帶細(xì)胞在體外暴露于 10 μg/ml DES 的激素相關(guān)受體基因表達(dá)的結(jié)果相一致，說(shuō)明人類(lèi)高位隱睪睪丸引帶細(xì)胞在 DES毒染的作用下呈現(xiàn)出與小鼠引帶細(xì)胞相似的激素受體水平改變，推測(cè) DES 可能是通過(guò) RXFP2 通路影響人類(lèi)引帶細(xì)胞的生長(zhǎng)，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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組織生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)將在青島舉辦

2017年 9月 7 – 9日，“標(biāo)準(zhǔn)化理論與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂培訓(xùn)班、生物樣本庫(kù)崗前培訓(xùn)和生物樣本庫(kù)質(zhì)量達(dá)標(biāo)檢查培訓(xùn)”將在青島舉辦。本次培訓(xùn)班由中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)組織生物樣本庫(kù)分會(huì)、全國(guó)醫(yī)藥生物樣本標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)和中國(guó)生物樣本庫(kù)聯(lián)盟主辦。

中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)組織生物樣本庫(kù)分會(huì)于 2009年，經(jīng)衛(wèi)生部、民政部批復(fù)成立，分會(huì)秉承“珍惜樣本、執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)、充分應(yīng)用、維護(hù)產(chǎn)權(quán)”的宗旨，充分發(fā)揮行業(yè)規(guī)范、學(xué)術(shù)交流、教育培訓(xùn)、國(guó)際交流、科研服務(wù)的主要職能。自成立以來(lái)，組織舉辦九屆中國(guó)生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化建立與應(yīng)用研討會(huì)、四屆中國(guó)生物樣本庫(kù)院長(zhǎng)高峰論壇，與國(guó)家 863 分子分型項(xiàng)目組、癌癥基因組共同編寫(xiě)了《中國(guó)生物樣本庫(kù)與數(shù)據(jù)庫(kù)建立指南》，編譯《ISBER 最佳實(shí)踐 2012》，制定《中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)生物樣本庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)（試行）》，為我國(guó)近 100 家醫(yī)院提供培訓(xùn)，為全國(guó)數(shù)十家醫(yī)院提供質(zhì)量控制。同時(shí)，全國(guó)生物樣本標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)于 2015年 6月經(jīng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)批復(fù)成立。

會(huì)務(wù)組聯(lián)系電話：021-51320288-5307。聯(lián)系人：徐艷萍。

The effect of diethylstilbestrol on high and low gubernaculums cells from cryptorchid patients

WANG Bing-jie, ZHOU Jun-mei, LI Ling-ling, CHEN Fang

ObjectiveTo explore the effect of diethylstilbestrol (DES) between the primary cells cultured from gubernaculum testis of cryptorchid patients whose undescend testis located in high position and low position.

MethodsThe gubernaculum testis were collected from cryptorchid patients during orchidopexy.Two groups named high group and low group were divided depending on the position of undescended testis after anesthesia.The position which was higher than the inner ring or between the inner ring and the outer ring was named the high group or the low group, respectively.The primary cells were cultured through type IV collagenase digestion and their morphology and cytoskeleton differences were compared.Then we cultured cells of the two groups in solvent control group (DMSO) and DES concentration gradient of 0.01, 0.1, 1 and 10 μg/ml and compared them with the control group respectively.Meanwhile the morphology, cell proliferation changes and the relative expression level of gene RXFP2 were detected.

ResultsHuman gubernaculum testis cells were mostly fibroblast-like and no difference was found between them in cytoskeleton.The morphology of high group cells did not change significantly while some low group cells spontaneously fused into multinucleated myotubes during culture.Additionally, high concentration of DES (10 μg/ml) changed the morphology and microfilament cytoskeleton of human cryptorchidism gubernaculum testis cells and inhibited their proliferation in both groups, but there was no statistical differences in the effects on the cells of two groups.The expression of RXFP2 was up-regulated by high concentration of DES at high concentration (10 μg/ml) in both groups.Meanwhile the expression level of PCNA was significantly lower in the DES group than that in the control group in both high and low groups.

ConclusionHigh concentration exogenous estrogen can remodel the microfilament cytoskeleton of human cryptorchidism gubernaculum cells and inhibits their proliferation in both groups, but no significant difference is found between the two groups.DES of high concentration (10 μg/ml) up-regulates the expression level of human RXFP2 gene.

Cryptorchidism; Gubernaculum testis cells; Diethylstilbestrol

ZHOU Jun-mei, Email: junmei_zhou@139.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.04.004

國(guó)家自然科學(xué)基金（81270742、81370700、81470911）；上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉研究基金（YG2016MS32）

200040 上海交通大學(xué)附屬兒童醫(yī)院/上海市兒童醫(yī)院泌尿外科（王冰潔、陳方），中心實(shí)驗(yàn)室（周君梅、李玲玲）

周君梅，Email：junmei_zhou@139.com

2017-03-23

Author Affiliation:Department of Urology (WANG Bing-jie, CHEN Fang), Central Laboratory (ZHOU Jun-mei, LI Ling-ling),Shanghai Children’s hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200040, China