陳翔，張佳琦，汪澤，許旭，朱濱

熒光定量法測定DNA熔解溫度

陳翔，張佳琦，汪澤，許旭，朱濱

DNA 熔解溫度（Tm）指 DNA 雙鏈變性過程中一半雙鏈解離為單鏈的溫度[1]，是 DNA 片段的一個重要特性。準(zhǔn)確測定 DNA 片段 Tm值，是分子生物學(xué)實驗方法（如PCR 檢測技術(shù)、核酸雜交檢測技術(shù)等）建立的基礎(chǔ)，在疾病的分子診斷領(lǐng)域具有重要現(xiàn)實意義[2-4]。影響 DNA 片段Tm值的因素有很多，如 DNA 片段的長度、DNA 片段的GC% 含量[5]、鹽離子濃度、pH 等[6]。傳統(tǒng)測定 DNA 片段 Tm值的方法多用紫外分光光度法[7-9]，該方法有一定的局限性，溶液需要量大，操作起來不方便。利用熒光試劑（如 SYBR Green I）與雙鏈 DNA 結(jié)合后熒光大大增強(qiáng)的特點，采用熒光定量法可以較好解決這些問題。用熒光定量法測定 DNA 樣品在含有 SYBR Green I 溶液中的熔解曲線，根據(jù)其導(dǎo)數(shù)曲線熔解峰對應(yīng)的溫度可以確定 DNA 樣品的 Tm值。熒光定量 PCR 儀溶液需求量小，不需太多操作，能很好地控制反應(yīng)的溫度，進(jìn)行實時自動化檢測[10-11]。本文用熒光定量法測定不同大小、不同 GC% 含量 DNA片段的 Tm值并研究了其影響因素，顯示該法可用于實際樣品測定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

FQD-48A 型熒光定量 PCR儀、TC-XP-D 型 XP 基因擴(kuò)增儀、HB-100 型恒溫金屬浴為杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；Cary 100 型紫外可見分光光度計為美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；OD-1000+ 超微量分光光度計為南京五義科技有限公司產(chǎn)品。

SYBR Green I（10 000 ×）購自廈門致善生物科技股份有限公司；lambda DNA、DMSO、Tris 鹽酸鹽、Tris 堿均為生工生物工程（上海）股份有限公司產(chǎn)品；K2HPO4·3H2O、KH2PO4均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 不同大小、不同 GC% 含量 DNA 片段的制備 大片段 DNA 的 GC% 含量大多沒有顯著差異，選擇商業(yè)化lambda DNA 產(chǎn)品。150～300 bp 的不同 GC% 含量 DNA片段的制備是選擇人基因組中不同 GC% 含量的基因（TPMT、CY、APOE），采用體外擴(kuò)增并純化。25 bp 的不同 GC% 含量 DNA 片段（Oligo A、Oligo B、Oligo C）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成并純化。不同GC% 含量的 DNA 序列見表 1。

1.2.2 溶液的配制

⑴熒光染色劑稀釋液：規(guī)格為 10 000 × 的 SYBR Green I 溶液用 DMSO 稀釋 10 000 倍，備用。

表1 不同 GC% 含量的 DNA 序列

⑵磷酸鹽緩沖液：稱取 K2HPO4·3H2O 和 KH2PO4，分別配制成 50 mmol/L 的溶液，兩種磷酸鹽溶液調(diào)節(jié) pH 至7.4 左右，備用。

⑶Tris 鹽緩沖液：稱取 Tris 鹽酸鹽和 Tris 堿，分別配制成 400 mmol/L 的溶液，兩種 Tris 溶液調(diào)節(jié) pH 至7.4 左右，備用。

1.2.3 熒光測定 DNA 片段 Tm取熒光染色劑稀釋液1 μl、磷酸鹽溶液 4 μl（終濃度5 mmol/L）、Tris 鹽溶液 6 μl（終濃度 60 mmol/L），加入適量 DNA 溶液（使定量后DNA 終濃度為 10 ng/μl），用超純水定量至 40 μl。配制好的溶液放入熒光定量 PCR 儀中，設(shè)置程序為：30 ℃、30 s，65 個循環(huán)，每個循環(huán)增加 1 ℃。測定 DNA 片段的熔解曲線，得到熔解導(dǎo)數(shù)曲線，取熔解導(dǎo)數(shù)曲線的峰對應(yīng)的溫度為Tm值。

1.2.4 紫外測定 DNA 片段 Tm磷酸鹽溶液（終濃度5 mmol/L）、Tris 鹽溶液（終濃度 60 mmol/L），加入適量DNA 溶液（使定量后 DNA 終濃度為 10 ng/μl）。紫外分光光度計設(shè)置固定吸收波長 260 nm，升溫速率 1 ℃/min，升溫范圍 30～95 ℃。得到 DNA片段隨溫度升高的紫外吸收曲線，取紫外吸收過渡曲線的中點對應(yīng)的溫度為 Tm值。

2 結(jié)果

2.1 不同 DNA 片段的 Tm值

不同大小、不同 GC% 含量 DNA 片段的 Tm值見表 2。本實驗條件下，熒光法可測定不同 GC% 含量各種大小 DNA 片段的 Tm值，僅在寡核苷酸小片段的 GC%含量過高時（Tm大于 90 ℃，接近水的沸點），熒光定量法與紫外法一樣均難以準(zhǔn)確測定，而紫外法在測定小片段DNA 的 Tm值時還需要顯著提高 DNA 濃度。熒光法與紫外法測定值基本一致，CY 片段熒光熔解曲線如圖 1 所示，熒光熔解導(dǎo)數(shù)曲線圖如圖 2 所示。

表2 不同 DNA 片段的熔解溫度（Tm）值

圖1 CY 片段熒光熔解曲線

2.2 熒光定量法測定 Tm值時熒光染料與 DNA 的濃度配比

實驗表明，對于不同大小、不同 GC% 含量的 DNA 片段，用熒光定量法測定 Tm值時，SYBR Green I 適宜的終濃度為 0.025 ×。在上述熒光染料濃度條件下，DNA 片段的適宜終濃度取決于 DNA 片段的大小，片段越小，終濃度越大。在本文建立的實驗條件下，大片段 DNA（kb 級）適宜終濃度不低于 5 ng/μl，中等大小 DNA（數(shù)百 bp）適宜終濃度不低于 10 ng/μl，小片段（數(shù)十 bp）適宜終濃度不低于 20 ng/μl。同等大小的 DNA 片段，GC% 含量越高，適宜濃度也越高。例如，TPMT 片段濃度低至 1 ng/μl 時，可見明顯熒光導(dǎo)數(shù)曲線峰，而 APOE 片段濃度為 5 ng/μl時，熒光導(dǎo)數(shù)曲線峰才可見。

用熒光定量法測定 DNA 片段的 Tm值時，DNA 濃度、SYBR Green I 染料量均不宜過高，否則熒光導(dǎo)數(shù)曲線圖會出現(xiàn)異常峰（饅頭峰或雙峰），給 Tm值的確定帶來困難。這可能是 DNA 解鏈會引起熒光信號變化產(chǎn)生，而解鏈后的 DNA 自身折疊形成局部雙鏈（高濃度時更明顯）解鏈也會引起熒光信號的變化，各因素疊加后使峰形復(fù)雜。

2.3 緩沖體系對測定的影響

圖2 CY 片段熒光熔解導(dǎo)數(shù)曲線

圖3 TPMT 片段熒光熔解導(dǎo)數(shù)曲線（1：Tris 鹽濃度5 mmol/L；2：Tris 鹽濃度 30 mmol/L；3：Tris 鹽濃度60 mmol/L）

鹽濃度的變化會對 DNA 片段 Tm值產(chǎn)生顯著影響。通常采用磷酸鹽緩沖體系，以保持測定過程中鹽濃度、pH的穩(wěn)定。熒光導(dǎo)數(shù)圖的峰形會受緩沖體系的影響，在緩沖體系中增加 Tris 鹽濃度會明顯改善低 GC% 含量 DNA 片段熒光導(dǎo)數(shù)曲線峰形（圖 3），對 Tm值略有提高，影響不大。DNA 片段 GC% 含量越高，上述改善越不明顯，但會明顯提高 Tm值。

3 討論

熒光定量 PCR 儀由于樣品量小（微升級）、溫控準(zhǔn)確、功能強(qiáng)大、自動化程度高迅速在臨床及科研領(lǐng)域得到普及。除了聚合酶鏈反應(yīng)等常規(guī)用途，用于 DNA 片段 Tm值研究與傳統(tǒng)的紫外分光光度法相比，優(yōu)勢明顯。

紫外分光光度法測定 DNA 熔解曲線原理是單鏈DNA 的吸光度大于雙鏈，根據(jù)吸光度的變化來確定 DNA熔解曲線，實際操作中，影響因素較多。DNA 溶液若不純，其紫外吸收曲線會出現(xiàn)不利于判定 Tm值的情況。紫外法測定互補(bǔ)寡核苷酸小片段，寡核苷酸小片段原本即為兩條單鏈，有一定的吸光度，濃度過低，熔解曲線會呈現(xiàn)一條逐漸升高的直線，無法判定 Tm值。

熒光定量法測定 DNA 的 Tm值是基于特殊的熒光染料分子（EB、SYBR Green I、吖啶橙等），這些染料分子可以插入雙鏈 DNA 分子中，插入前后熒光染料分子的熒光強(qiáng)度有數(shù)十倍的差異。同樣插入雙鏈 DNA 中的熒光染料分子的熒光強(qiáng)度隨 DNA 分子的解鏈也會產(chǎn)生顯著變化。DNA 溶液純度和片段大小對該法影響較小。熒光染料的用量以產(chǎn)生適宜的熒光強(qiáng)度變化為宜。目前已有專門用于此的商業(yè)試劑盒可供選擇。

采用熒光定量法測定 DNA 片段 Tm值，熒光染料與DNA 的濃度配比非常重要。由于熒光染料分子插入 DNA片段后復(fù)合物本身的熒光強(qiáng)度會隨著溫度升高而下降，配比不合適會掩蓋 DNA 解鏈引起的熒光強(qiáng)度下降。也因為該原因，用熒光導(dǎo)數(shù)圖將更直觀、更準(zhǔn)確。

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上海張江國家自主創(chuàng)新示范區(qū)專項發(fā)展資金重點項目（201609-XH-CHJ-C1085-003）

201418 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院（陳翔、許旭）；200233 上海百傲科技股份有限公司（張佳琦、汪澤、朱濱）

朱濱，Email：zhubin@baio.com

2017-05-01