譚清梅 張從新 廖堅(jiān)文 楊誠*
1.深圳市福田區(qū)第二人民醫(yī)院,廣東 深圳518049
2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院荔灣醫(yī)院,廣東廣州510145
3.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院(廣東省骨科醫(yī)院),廣東廣州510630
隨著老齡化社會(huì)的到來,脊柱退變性病變例如骨質(zhì)疏松和腰椎間盤退變等疾病越來越常見。存在證據(jù)表明50歲以上人群的椎間盤變性接近90%[1]。在歐洲,估計(jì)在50歲以上人群中,每8人就有1人曾因骨質(zhì)疏松患過脊椎骨折。但目前老年性脊柱退變的發(fā)病機(jī)制未明確,尋找相關(guān)治療靶點(diǎn)藥物是研究熱門。
臨床前期的許多研究表明mTOR信號(hào)參與骨重塑[2-8]。動(dòng)物模型表明抑制mTOR途徑會(huì)減少骨吸收作用,例如,老鼠的mTOR信號(hào)途徑受抑制后會(huì)出現(xiàn)破骨細(xì)胞的成熟減少和破骨細(xì)胞凋亡增加[3]。依維莫司不但抑制破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞在體外分化,而且通過切除卵巢的老鼠模型實(shí)驗(yàn)顯示,依維莫司改善骨質(zhì)疏松與雌激素不足[4]。進(jìn)一步的臨床研究也表明除了能延緩骨疾病進(jìn)展,依維莫司可能有助于保護(hù)骨骼健康[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)mTOR抑制劑雷帕霉素(Rapamycin)可減輕關(guān)節(jié)軟骨的退變,從而延緩骨關(guān)節(jié)炎(OA)的病理進(jìn)程[10]。Jiang等[11]通過Ca2+依賴AMPK/mTOR途徑激活自噬使老鼠的髓核細(xì)胞能適應(yīng)高滲的壓力環(huán)境。還有研究發(fā)現(xiàn)在退變椎間盤內(nèi)AMPK表達(dá)和激活增加,而mTOR的表達(dá)顯著減少,提示在椎間盤內(nèi)AMPK通過對(duì)mTOR的調(diào)節(jié)導(dǎo)致基質(zhì)分泌減少、細(xì)胞數(shù)量下降[12]。這些研究表明,mTOR信號(hào)通路在體內(nèi)和骨、軟骨和及髓核細(xì)胞的代謝密切相關(guān)。但以往研究均采用的模型為切卵巢模型,與老年性骨質(zhì)疏松有區(qū)別,而且該模型無法觀察椎間盤退變情況。本研究采用自發(fā)性老年脊柱退變小鼠模型,觀察雷帕霉素對(duì)脊柱退變導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松和椎間盤退變的作用,為今后治療老年性脊柱退變提供靶點(diǎn)。
20只27月齡C57B6雌性小鼠,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(粵)2011-0074。隨機(jī)分為2組:10只喂雷帕霉素3個(gè)月(30 m+Rap組),另10只喂生理鹽水3個(gè)月作為對(duì)照組(30 m組)。
Olympus光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng),日本Olympus公司;PM30自動(dòng)顯微照相裝置,日本Olympus公司;顯微斷層掃描儀(Micro-CT),瑞士Scanco公司;伊紅粉劑,美國(guó)Sigma公司;阿爾新藍(lán)粉劑,美國(guó)Sigma公司;COLⅡ抗體,英國(guó)Abcam公司;TRAP試劑盒,美國(guó)Sigma公司。
1.3.1 影像學(xué)檢查:3個(gè)月后麻醉處死小鼠,取脊柱胸12-腰2椎體固定后使用顯微CT成像系統(tǒng)進(jìn)行斷層掃描成像。選用小視野成像掃描,校正CT值,設(shè)定空氣CT值為-1000,骨的CT值為1000,調(diào)定掃描電壓70 kV,功率30 W,電流為429μA,掃描層厚為5 μm。用3D-MED 3.0三維重建脊柱。
1.3.2 組織學(xué)染色:獲得標(biāo)本后,制作組織切片HE和阿爾新藍(lán)染色椎體和椎間盤結(jié)構(gòu)。染色方法:A、烤片:65℃恒溫箱中烤片20 min;B、脫蠟(二甲苯置換石蠟):二甲苯 I,10 min;二甲苯 II,10 min;C、水化(乙醇置換二甲苯):100%乙醇I,5 min;100%乙醇 II,5 min;95% 乙醇,2 min;80% 乙醇,2 min;70%乙醇,2 min;50%乙醇,2 min;D、清洗:PBS沖洗3次,每次5 min;E、蘇木素著色30 s或阿爾新藍(lán)著色30 min;F、自來水沖洗2 min;G、伊紅著色1 min或0.1%核固紅溶液復(fù)染核5 min;H、自來水沖洗2 min;I、95%乙醇,2 min ×2;J、100%乙醇 3 min ×2;K、二甲苯10 min;L、封片。
1.3.3 組織學(xué)染色免疫組化和TRAP染色:COLⅡ免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟:A-G同前;然后按照標(biāo)準(zhǔn)免疫組化程序進(jìn)行操作。釆用圖像分析軟件Image-Pro Plus,分別選定各組圖片中褐色區(qū)域,計(jì)算出占整個(gè)圖片的面積百分比。進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。TRAP方法與步驟:孵育液A液:0.2 mol/L醋酸緩沖液8 mL;B液:六偶氮副品紅1 mL;C液:取萘酚AS-BI磷酸酯20 mg加入1 mL N,N-二甲基甲酰胺溶解。將A、B液按比例混勻,調(diào)pH至5.0,加入C液再加酒石酸鉀鈉141 mg,充分溶解過濾后配成TRAP孵育液。玻片或骨片上的破骨細(xì)胞經(jīng)2.5%戊二醛4℃固定7 min后,雙蒸水清洗3次,浸入孵育液內(nèi),37℃孵育50 min,雙蒸水清洗1次,甘油明膠封片,光鏡觀察。染色結(jié)果顯示破骨細(xì)胞胞漿陽性,呈酒紅色,核呈陰性。然后在高倍視野下,在兩組切片上隨機(jī)選取個(gè)不同的區(qū)域,在骨質(zhì)表面、骨內(nèi)血管通道周選取多核、緊貼骨小梁、底部有四陷、近似三角形的多核細(xì)胞為破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。
首先對(duì)27 m齡C57小鼠喂雷帕霉素3 m的各10個(gè)脊柱胸腰段進(jìn)行Micro-CT檢測(cè)量,發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能緩解脊柱椎體骨皮質(zhì)變薄和骨小梁減少,統(tǒng)計(jì)結(jié)果主要表現(xiàn)在BV/TV,Tb.N及 Tb.Sp的t值,分別為 -11.442、-16.939和10.484,P均 <0.001,說明30 m組和30 m+Rap組比較BV/TV,Tb.N及Tb.Sp有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,Tb.Th的 P=0.167 >0.05,說明30 m組和30 m+Rap組比較Tb.Th無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表1)。即BV/TV及骨小梁數(shù)量的增加,骨小梁分離度減少,但骨小梁厚度無明顯改變。從1 A可見雷帕霉素能緩解脊柱椎體骨皮質(zhì)變薄和骨小梁減少,從1B、C、E統(tǒng)計(jì)結(jié)果看主要表現(xiàn)在BV/TV骨小梁數(shù)量的增加,骨小梁分離度減少,但骨小梁厚度無明顯改變。這進(jìn)一步提示,給予雷帕霉素可以緩解老年小鼠脊柱退變導(dǎo)致的骨量的減少。
圖1 A 30 m和30 m+Rap脊柱Micro-CT三維重建結(jié)果,B,C,D,E為骨小梁CT分析結(jié)果*P<0.05Fig.1 A:Spine Micro-CT scan and 3 D reconstruction results of the 30 m and 30 m+Rap groups;B,C,D and E:CT analysis results of the trabeculae
表1 各組骨小梁分析(±s,n=10)Table 1Trabeculae analysis of each group(±s,n=10)
表1 各組骨小梁分析(±s,n=10)Table 1Trabeculae analysis of each group(±s,n=10)
注:兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)顯示BV/TV,Tb.N及Tb.Sp的P<0.05,說明30 m組和30 m+Rap組比較BV/TV,Tb.N及Tb.Sp有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,Tb.Th的P=0.167>0.05,說明30 m組和30 m+Rap組比較Tb.Th無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異
group BV/TV Tb.N Tb.Th Tb.Sp 30 m 0.279±0.009 3.638±0.009 0.063±0.002 0.2<0.001 <0.001 0.167 <0.001 56±0.013 30 m+Rap 0.351±0.011 5.298±0.198 0.065±0.003 0.179±0.012 t值 -11.442 -16.939 -1.505 10.486 P值
為了解雷帕霉素除了可以緩解老年小鼠脊柱退變導(dǎo)致的骨量的減少外,對(duì)椎間盤退變是否存在影響,我們?nèi)?組小鼠其腰椎行切片HE染色和阿爾新藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)微觀察椎體和椎間盤改變。從圖2、3看30 m+Rap組小鼠椎體骨小梁較30 m組多,這與Micro-CT結(jié)果一致。30 m+Rap組小鼠椎間隙較30 m組大,30 m組纖維環(huán)結(jié)構(gòu)紊亂,向髓核內(nèi)生長(zhǎng)替代部分髓核組織,生長(zhǎng)板和軟骨終板軟骨退變明顯,表現(xiàn)為阿爾新藍(lán)染色淺藍(lán)色,軟骨終板與髓核分界不清。以上均提示雷帕霉素能緩解老年小鼠椎間盤退變。
圖2 30 m和30 m+Rap腰椎HE切片染色Fig.2 HE staining of lumbar vertebral body slice of mice in the 30 m and 30 m+Rap groups
圖3 30 m和30 m+Rap腰椎切片阿爾新藍(lán)染色Fig.3 Alcian blue staining of lumbar vertebral body slice of mice in the 30 m and 30 m+Rap groups
為了解雷帕霉素如何緩解老年小鼠脊柱退行性變,首先將30 m+Rap組和30 m組腰椎切片進(jìn)行通過TRAP染色檢測(cè)不同組小鼠破骨細(xì)胞數(shù)量,發(fā)現(xiàn)30 m+Rap組破骨細(xì)胞減少(P <0.05)(見圖4)。上述結(jié)果提示,雷帕霉素可能通過抑制破骨活性以改善老年小鼠的骨量從而延緩?fù)俗?。同時(shí),還進(jìn)行兩個(gè)小組的COLⅡ免疫組化檢測(cè),圖5結(jié)果顯示COLⅡ在30 m組小鼠的軟骨終板和生長(zhǎng)板的表達(dá)明顯較30 m+Rap組減少(P<0.05),說明雷帕霉素通過影響了軟骨細(xì)胞的功能,從而延緩椎間盤退變。
圖4 30 m組和30 m+Rap組腰椎切片TRAP染色及計(jì)數(shù)*P<0.05Fig.4 TRAP immunohistochemical staining and osteoclast count of lumbar vertebral body slice of mice in the 30 m and 30 m+Rap groups*P<0.05
圖5 30m組和30 m+Rap組腰椎切片COLⅡ免疫組化*P<0.05Fig.5 COL Ⅱ immunohistochemical staining of lumbar vertebral body slice of mice in the 30 m and 30 m+Rap groups*P<0.05
mTOR是整合細(xì)胞內(nèi)外各種信號(hào)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與代謝的中心信號(hào)分子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、存活及凋亡等。人類很多重大疾病均涉及mTOR信號(hào)通路的失調(diào),mTOR信號(hào)通路成為近年基礎(chǔ)與臨床研究的熱點(diǎn)[13]。雷帕霉素,又名西羅莫司(Sirolimus),它在體內(nèi)作為mTORC1特異性抑制劑,最早雷帕霉素被當(dāng)著抗真菌藥使用,后來發(fā)現(xiàn),它具有免疫抑制和抑制細(xì)胞增值作用,因而被當(dāng)著免疫抑制劑使用,主要用于器官移植后的抗免疫排斥反應(yīng)。隨著研究的不斷深入,逐漸發(fā)現(xiàn)雷帕霉素許多新作用,在骨代謝中也具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)給關(guān)節(jié)不穩(wěn)誘導(dǎo)的OA模型的小鼠灌胃雷帕霉素,可特異性抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞mTORC1通路活性,促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的自噬功能,維持關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活,從而延緩 OA 的發(fā)?。?4]。而 Kneissel等[4]通過行大鼠卵巢切除造模骨質(zhì)疏松,然后予依維莫司處理,發(fā)現(xiàn)骨小梁減少、骨吸收和破骨細(xì)胞上表達(dá)的組織蛋白酶K受到抑制。而臨床脊柱退行性病變很常見,主要表現(xiàn)包括骨質(zhì)疏松和椎間盤退變,而且腰椎間盤退變與原發(fā)性骨質(zhì)疏松存在顯著的相關(guān)關(guān)系[15]。我們課題組最新研究成果[16]顯 示mTORC1通路影響脊柱發(fā)育,在軟骨特異性敲除TSC1基因后出現(xiàn)脊柱發(fā)育畸形,而雷帕霉素能部分逆轉(zhuǎn)椎體和椎間盤的發(fā)育畸形。既然雷帕霉素能影響關(guān)節(jié)軟骨、椎間盤和破骨細(xì)胞功能,那么它是否能應(yīng)用于預(yù)防老年性脊柱退變呢?目前未見有相關(guān)報(bào)道。在本研究中首次采用老年性自發(fā)性脊柱退變小鼠模型,這與卵巢切除造模骨質(zhì)疏松模型相比,它更接近臨床老年性骨質(zhì)疏松生理病理過程,而且該模型還能同時(shí)觀察椎間盤退變情況。本研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能緩解老年小鼠脊柱退變導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松和椎間盤退變,說明mTORC1信號(hào)通路在老年脊柱退行性病變中發(fā)揮重要作用,它能同時(shí)調(diào)控脊柱椎體和椎間盤結(jié)構(gòu)與功能改變。而且雷帕霉素對(duì)椎間盤保護(hù)作用國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道,這個(gè)新發(fā)現(xiàn)為今后研究椎間盤退變?cè)黾有聝?nèi)容。雷帕霉素通過特異性抑制mTORC1信號(hào)通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞延緩脊柱退變,這也與目前的研究認(rèn)為雷帕霉素可以減緩衰老一致[11]。
因此我們認(rèn)為雷帕霉素可作為預(yù)防老年脊柱退行性病變靶點(diǎn)藥物,但雷帕霉素的免疫抑制、肝腎功能損傷等毒副作用影響其臨床應(yīng)用,如何開發(fā)與應(yīng)用以mTOR為靶點(diǎn)的雷帕霉素衍生物及替代藥物是未來延緩及治療脊柱退行性病變的熱點(diǎn)之一。