劉文杰

(福建省廈門市大同中學(xué) 361009)

章躍陵

(廣東汕頭大學(xué)理學(xué)院生物學(xué)系/廣東省海洋生物技術(shù)重點實驗室 515063)

無脊椎動物的先天防御體系是在長期自然選擇過程中進化形成的，非常有效且功能強大，其生物學(xué)意義已被廣泛認識。無脊椎動物先天免疫系統(tǒng)與哺乳動物的先天免疫系統(tǒng)有很高的同源性，其相關(guān)研究成果可以為理解更復(fù)雜的高等動物免疫反應(yīng)提供線索。此外，隨著耐藥性細菌的出現(xiàn)和傳統(tǒng)抗生素治療作用的下降，亟需尋找新型抗致病菌的活性物質(zhì)。因此，關(guān)于無脊椎動物的先天免疫分子的研究是一個熱點。

1 無脊椎動物先天免疫分子

一般認為，無脊椎動物缺乏真正的抗體和特異性的免疫細胞，機體防御反應(yīng)依靠非特異性的先天免疫，與之相關(guān)的先天免疫分子是免疫反應(yīng)系統(tǒng)的一個重要組成部分。

1.1 酚氧化酶 酚氧化酶(PO)是生物體內(nèi)一類含銅氧化酶，能通過氧化酚或多酚形成對應(yīng)的醌，大體可分為酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶三大類(后二者統(tǒng)稱為多酚氧化酶)。無脊椎動物的多酚氧化酶常以酶原的形式存在，其活性位點由一個保守的苯丙氨酸占據(jù)并阻擋底物進入，不具有酶活性，需要時經(jīng)過特異絲氨酸蛋白酶的切割形成有活性的PO才能起作用。

昆蟲多酚氧化酶是一種非常重要的免疫蛋白，可同時介導(dǎo)體液和細胞有關(guān)成分參與免疫，是誘發(fā)黑化反應(yīng)的主要酶，對于防止病原微生物入侵以及傷口愈合至關(guān)重要。依靠多酚氧化酶的免疫作用，昆蟲可以在發(fā)病前清除大部分病原物，若多酚氧化酶的活性消失或被有效抑制后，昆蟲對病原物的抵抗力顯著下降[1]。漆酶型PO是海洋無脊椎動物免疫應(yīng)答系統(tǒng)的重要組成部分，其氧化產(chǎn)物通常具有窄譜抗菌活性，且對弧菌有強烈的殺傷抑制作用，但與昆蟲漆酶型PO在氧化產(chǎn)物抗菌譜上的差異顯著。此外，漆酶型PO自身可通過多種方式有效應(yīng)答病毒、細菌和真菌的入侵，對病原的刺激非常敏感、應(yīng)答迅速，在無脊椎動物免疫力調(diào)控和病害預(yù)警中顯示出潛在的應(yīng)用價值[2]。

1.2 凝集素 凝集素(lectin)是無脊椎動物先天免疫系統(tǒng)的重要組分，存在于細胞外基質(zhì)以及血淋巴細胞表面、細胞基質(zhì)等處。凝集素也廣泛分布于動物、植物和微生物中。凝集素是一類對特定細胞多糖具有結(jié)合親和力的、多價構(gòu)型的熱敏蛋白或糖蛋白復(fù)合物，能選擇性凝集脊椎動物血細胞、微生物細胞和單細胞藻類以及沉淀某些復(fù)雜碳水化合物。因此，可凝集外來病原菌、進行非己識別、調(diào)理和介導(dǎo)血細胞吞噬，在免疫應(yīng)答早期階段發(fā)揮著積極的作用。

軟體動物中的凝集素在識別異體、凝集和吞噬等方面發(fā)揮著重要作用，如櫛孔扇貝(Chlamysfarreri) 的血淋巴細胞內(nèi)有多種含量豐富的凝集素，可凝集大腸桿菌等，并在細胞介導(dǎo)的吞噬作用中起協(xié)同作用[3]。文蛤(Meretrixmeretrix)在受到細菌刺激后，C-型凝集素基因表達量顯著上升, 并參與對微生物入侵的免疫應(yīng)答, 有助于提高文蛤等的免疫防御能力[4]。對幾種棘皮動物凝集素的研究發(fā)現(xiàn)，它們在進行調(diào)理作用和創(chuàng)傷修復(fù)等防御機制中起重要作用。例如，擬球海膽(Paracentrotuslividus) 紅細胞凝集素可能參與凝血作用、創(chuàng)面修復(fù)作用、調(diào)理作用和包囊作用，刺瓜參(Cucumariaechinata) 中C型凝集素可溶解兔和人的紅細胞，并可能對外來微生物產(chǎn)生毒性等[5]。

1.3 抗菌肽 抗菌肽(AMPs)是無脊椎動物天然免疫系統(tǒng)的主要成分之一，是高效、具有廣譜抗微生物(細菌和真菌)的活性小分子多肽，一般由12～100個氨基酸殘基組成，具有親脂、親水性(雙親性)?？咕牡目咕鷻C制與傳統(tǒng)抗生素截然不同，特點是分子量小、水溶性好、耐熱性強、無免疫原性、殺菌速度快和不易被蛋白酶水解等，在無脊椎動物防御病原微生物中起著重要作用，被譽為“天然抗生素”。自Boman等發(fā)現(xiàn)第一個抗菌肽——天蠶素以來, 人們相繼又從細菌、真菌、高等植物、昆蟲、兩棲類、哺乳動物甚至人體中發(fā)現(xiàn)具有類似性質(zhì)的活性多肽。據(jù)統(tǒng)計，截止到2012年9月已確定的抗菌肽數(shù)量達到2032種，并且數(shù)據(jù)還在不斷增加中。

現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，抗菌肽除了具有廣譜抗菌活性外，還具有抗病毒和寄生蟲等活性，以及趨化和免疫調(diào)節(jié)、中和毒素、抗腫瘤、促進血管生成和創(chuàng)傷修復(fù)等生物學(xué)功能[6]。

1.4 血藍蛋白 血藍蛋白(hemocyanin)是一種與呼吸作用有關(guān)的含銅蛋白，其特點是脫氧狀態(tài)為無色，結(jié)合氧時呈藍色，存在于節(jié)肢動物和軟體動物的血淋巴中。通常認為血藍蛋白的主要生物學(xué)功能與機體內(nèi)的氧運輸有關(guān)，故與血紅蛋白、蚯蚓血紅蛋白合稱為動物界的三大呼吸蛋白。但近年來的研究表明，血藍蛋白還是無脊椎動物中的一種具有多種免疫學(xué)活性的非特異性免疫分子，可以識別和抵抗病毒、細菌、真菌、異種動物紅細胞及腫瘤細胞等多種病原體。血藍蛋白及其亞基不僅在胰蛋白酶、甲殼動物血細胞溶解產(chǎn)物等激活下表現(xiàn)出酚氧化酶免疫功能, 而且其自身或裂解產(chǎn)生的不同分子質(zhì)量大小的片段也可以抵御病毒的入侵，具備抗菌活性[7]。例如，對蝦血藍蛋白對魚、雞、鼠和人的紅細胞以及對副溶血性弧菌、大腸桿菌K12和金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)明顯的凝集活性[8]。此外，血藍蛋白還與能量的貯存、滲透壓的維持以及蛻皮過程的調(diào)節(jié)有關(guān)[9]。

1.5 補體系統(tǒng) 補體系統(tǒng)是由一系列40多種蛋白質(zhì)分子所組成、有著精密調(diào)控機制的蛋白質(zhì)反應(yīng)系統(tǒng)。補體作為眾多免疫效應(yīng)機制中的一員，在免疫過程的末端和吞噬作用以及炎癥反應(yīng)等一起發(fā)揮著作用，是連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的樞紐[10]。

Tagawa 等研究發(fā)現(xiàn)中國鱟中TtCRP-1、TL-5A、TL-1 和TPL-1分子可以召集C3和B因子的復(fù)合物到革蘭氏陽性菌和酵母表面形成C3轉(zhuǎn)化酶，進而催化更多的C3分子結(jié)合到這些微生物表面，同時還發(fā)現(xiàn)一個未知的C因子參與其中，提示其可能存在不同于脊椎動物的補體激活途徑[11]。彭茂瀟等[12]對無脊椎動物補體系統(tǒng)中已報道的C1q、MBL、ficolin等的成分、功能、激活途徑和系統(tǒng)進化情況進行了較詳盡的比較，現(xiàn)有的結(jié)果表明無脊椎動物可能存在與脊椎動物差異較大的補體系統(tǒng)，這預(yù)示著海洋無脊椎動物具有更多特有的補體激活途徑。

1.6 纖維蛋白原相關(guān)蛋白 纖維蛋白原相關(guān)蛋白(FREPs)是含有纖維蛋白原相關(guān)結(jié)構(gòu)域的凝集素家族，其典型分子結(jié)構(gòu)是在N-末端含有1個或2個免疫球蛋白超家族(IgSF)結(jié)構(gòu)域，接著是1個調(diào)節(jié)區(qū)，在C-末端含有纖維蛋白原(FBG)結(jié)構(gòu)域,具有“非己”識別能力,并能激活免疫應(yīng)答[13]。研究表明:按蚊中的FREPs-FBN9既能與革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌相互作用，還能強烈凝聚位于蚊子腸上皮細胞中的嚙齒動物或人的瘧原蟲，該結(jié)果提示FREPs具有防御活性并能與病原體直接作用。FBN9也可以形成二聚體，并能以不同的親和力結(jié)合到細菌的表面。研究還發(fā)現(xiàn)，通過體外表達扇貝、文昌魚等的FREPs能凝集人的A、B、O型血的紅細胞和雞紅細胞，這種有鈣依賴性的凝集可被乙酰基含水化合物特異性阻斷，并且這些重組蛋白在有鈣離子的條件下還能讓革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌以及革蘭氏陰性大腸埃希菌等細菌凝集[14]。因此，F(xiàn)REPs被認為是參與免疫防御最重要的分子之一，在無脊椎動物先天免疫中起著重要作用[15]。

2 無脊椎動物先天免疫系統(tǒng)的模式識別受體

無脊椎動物先天免疫系統(tǒng)作為外源物入侵后宿主防御的最重要防線，首先必須能夠識別“異己”分子，進而快速激活體內(nèi)相應(yīng)的信號通路，產(chǎn)生各種效應(yīng)分子來殺滅、清除外源物。無脊椎動物能夠識別在微生物表面保守的、而在宿主中又不存在的病原相關(guān)分子模式(PAMPs)，如細菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(PG)、細菌DNA及這些生物大分子的衍生物等，識別這些分子模式的受體統(tǒng)稱為模式識別受體(PRRs)。這些PRRs的共同特征是配體的不專一性：一種模式識別受體可以引起不同的免疫防御反應(yīng)，它們的性質(zhì)和功能不盡相同(表1)[16]。

表1 模式識別受體的性質(zhì)與功能

研究發(fā)現(xiàn)，當PAMPs被識別后，這些受體引發(fā)激活絲氨酸蛋白酶和解除絲氨酸蛋白酶抑制劑的細胞外級聯(lián)反應(yīng)，將受到感染的信號放大或解除錯誤信號(即信號的調(diào)整和放大過程),然后引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活目的基因的轉(zhuǎn)錄，最終激活效應(yīng)物反應(yīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生抗菌肽、酚氧化酶等效應(yīng)物[17]。PRRs還可以作為促進吞噬的調(diào)理素，也可以是凝集、黑化或其他蛋白質(zhì)修飾級聯(lián)反應(yīng)等免疫過程的起始因子。