周梓華 蔡 星 丁雪娟

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510631)

鯛無胄蟲的描述及無胄蟲科的分類地位

周梓華 蔡 星 丁雪娟

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣州市亞熱帶生物多樣性與環(huán)境生物監(jiān)測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510631)

對(duì)寄生于大亞灣黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)體表的鯛無胄蟲(Anoplodiscus spari)進(jìn)行了形態(tài)描述, 并擴(kuò)增了該蟲的28S rDNA C1-D2區(qū)部分序列, 構(gòu)建了相關(guān)類群的分子系統(tǒng)樹, 探討了無胄蟲科的分類地位。結(jié)果顯示: 所獲標(biāo)本與Ogawa等的描述基本一致, 但交接管基部及末端位置略有不同: 本研究標(biāo)本的交接管基部始于支持器的下方、末端于支持器三分叉的中支略伸出, 而Ogawa等的標(biāo)本交接管基部靠近支持器三叉處、末端從三叉處延伸并略彎曲; 無胄蟲屬(Anoplodiscus)為單系起源, 隸屬于指環(huán)蟲目、四鉤蟲亞目、無胄蟲科(Anoplodiscidae), 無胄蟲科是一獨(dú)立的科, 在分類地位上與四鉤蟲科(Tetraonchidae)互為姐妹群, 與Udonellidae科和微溝科(Microbothriidae)的關(guān)系較遠(yuǎn)。

鯛無胄蟲; 無胄蟲科; 28S rDNA; 分類地位

無胄蟲科(Anoplodiscidae Tagliani, 1912)隸屬于扁形動(dòng)物門(Platyhelminthes)單殖吸蟲綱(Monogenea), 目前僅含無胄蟲屬(Anoplodiscus)。無胄蟲屬是由Sonsino (1890)以采自真鯛(Pagrus major)上的Anoplodiscus richiardii為模式種而建立的, 屬征為: 后吸器盤狀, 無幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu); 腸支單管, 具不對(duì)稱側(cè)分支; 前吸器1對(duì), 吸槽狀[1]。無胄蟲屬記錄6個(gè)種: 寄生于赤鯛(Pagrus pagrus)的A.richiardii Sonsino, 1890和A.longivaginatus Paraguassu, 2002、寄生于黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)的A.australis (Johnston, 1930) Ogawa et Egusa, 1981和A.spari (Yamaguti, 1958) Ogawa et Egusa, 1981、寄生于金鯛(Chrysophrys auratus)的A.cirrusspiralis Roubal, Armitage et Rohde, 1983及寄生于真鯛的A.tai Ogawa, 1994[1—5]。張劍英等[6]曾對(duì)無胄蟲科無胄蟲屬作過介紹, 吳金英等[7]記述了采自香港海域黑鯛體表的鯛無胄蟲(A.spari), 此為我國報(bào)道的唯一一種無胄蟲[7,8], 但未提供該蟲的相關(guān)圖片。近年又有該蟲引發(fā)養(yǎng)殖魚類病害的報(bào)道[9]。

無胄蟲的分類地位一直存在爭(zhēng)議。Monticelli (1905)重描述了無胄蟲屬并將其歸在Anisocotylidae科。Tagliani (1912)在該屬的基礎(chǔ)上建立了無胄蟲亞科Anoplodiscinae。Price (1938)認(rèn)為Anisocotylidae科名無效, 并將無胄蟲屬歸入微溝蟲科 (Microbothriidae)。Sproston (1946)又將無胄蟲屬歸于鞋口蟲科(Calceostomatidae)。在Yamaguti (1963)的分類系統(tǒng)中, 無胄蟲歸于微溝蟲科。Ogawa等[1]根據(jù)無胄蟲的幼蟲具8對(duì)邊緣小鉤, 而微溝蟲科的幼蟲只有3對(duì)針狀刺(spicules), 以及二者腸支和前吸器的差異, 將無胄蟲亞科從微溝蟲科中獨(dú)立出來,并將其提升至科水平。在Boeger和Kritsky[10]的分類系統(tǒng)中, 無胄蟲科歸于三代蟲目, 該三代蟲目包括兩個(gè)分支: 一個(gè)分支由無胄蟲科、似四鉤蟲科(Tetraonchoididae)和溝穴蟲科(Bothitrematidae)組成,另一個(gè)分支包含三代蟲科(Gyrodactylidae)、棘杯蟲科(Acanthocotylidae)和Udonellidae科。Justine等[11]在利用28S rDNA D1區(qū)部分序列探討新鞋口蟲科(Neocalceostomatidae)和溝穴蟲科的分類地位時(shí), 發(fā)現(xiàn)無胄蟲科、溝穴蟲科和Sundanonchidae科聚為一支, 該結(jié)果與Olson等[12]利用18S rDNA構(gòu)建的進(jìn)化樹一致, 即無胄蟲科和Sundanonchidae聚為一支。

分子系統(tǒng)學(xué)能夠解決缺乏形態(tài)特征或形態(tài)特征無法解決的某些類群的分類地位問題, 而28S rDNA 5′端序列適合推斷種間、屬間及近緣科間的親緣關(guān)系[13—15]。有鑒于此, 本文擬依據(jù)所獲標(biāo)本對(duì)鯛無胄蟲的形態(tài)特征作一補(bǔ)充描述, 并利用28S rDNA C1-D2區(qū)部分序列探討了無胄蟲科的分類地位。

1 材料與方法

1.1 材料來源及形態(tài)學(xué)研究

宿主魚黑鯛取自廣東大亞灣養(yǎng)殖網(wǎng)箱, 先用肉眼觀察其體表、鰭、眼、鼻、口腔等部位, 再用淡水侵泡3—5min, 后取出魚鰓, 置于盛有過濾海水的培養(yǎng)皿中, 在解剖鏡下進(jìn)行觀察。檢獲的單殖吸蟲標(biāo)本, 部分用布氏膠直接封片; 部分用70%酒精固定后經(jīng)洋紅或胭脂蟲紅染色, 梯度酒精脫水, 松油醇透明后用中性樹膠封片; 其余標(biāo)本用95%酒精固定保存。照片圖為Olympus顯微數(shù)碼相機(jī)拍攝, 墨線圖借助Olympus LB描繪器進(jìn)行手繪、掃描成電子圖片后用Photoshop CS4復(fù)墨。在光學(xué)顯微鏡下觀察并測(cè)量, 量度單位以μm計(jì), 量度取平均數(shù)(括號(hào)內(nèi)數(shù)值為所測(cè)標(biāo)本的量度變化范圍)。標(biāo)本保存于華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院魚類寄生蟲學(xué)研究室。

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

模板DNA的制備、28S rDNA部分序列的PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的純化等參見丁雪娟和廖翔華[15]。PCR擴(kuò)增引物參照Hassouna等[16]: 正向C1 (5′-AC CCGCTGAATTTAAGCAT-3′) 和反向D2 (5′-TG GTCCGTGTTTCAAGAC-3′)。擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μL: 10×PCR buffer 5.0 μL, 2 mmol/L dNTP 5.0 μL, 25 mmol/ L MgCl24.0 μL, 10 μmol/L引物各2.0 μL, Taq酶(5 U/μL) 0.5 μL, DNA模板液3.0 μL, 滅菌雙蒸水28.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)步驟: 94℃預(yù)解鏈5min; 然后94℃ 1min, 56℃ 1min, 72℃ 1min, 30個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳、回收、純化后送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

根據(jù)自測(cè)的無胄蟲及鱗盤蟲28S rDNA C1-D2區(qū)部分序列, 及從NCBI上下載的26種單殖吸蟲的相應(yīng)序列(表 1), 構(gòu)建無胄蟲相關(guān)類群的系統(tǒng)發(fā)育樹。DNA序列用ClustalX[17]軟件比對(duì)分析, 并手工刪除兩端無效序列。采用最大似然法(Maximum likelihood, ML) 和貝葉斯分析(Bayesian analysis, BA)構(gòu)建系統(tǒng)樹。ML分析由在線軟件The CIPPES Science Gateway (http://www.phylo.org) 生成, 使用RAxML-HPC2 on XSEDE工具, 模型選擇GTRCAT, Bootstrap設(shè)置為1000次。貝葉斯分析使用軟件Mr-Modeltest2.1.2[18]搜索最佳模型參數(shù)(基于hLRT標(biāo)準(zhǔn))。兩種方法均選用4種寡鉤亞綱單殖吸蟲作為外類群。

2 結(jié)果

2.1 鯛無胄蟲Anoplodiscus spari (Yamaguti, 1958) Ogawa & Egusa, 1981

宿主: 黑鯛Acanthopagrus schlegeli (Bloch)

寄生部位: 鰭和體表

標(biāo)本采集時(shí)間和地點(diǎn): 2014年11月; 廣東惠州大亞灣(22°43′N, 114°28′E)

形態(tài)描述: 蟲體呈梭形, 大小為1563 (1129—2062)×652 (370—999)。體前端平截, 上有1對(duì)吸槽、邊緣不規(guī)則。眼點(diǎn)2對(duì)。咽發(fā)達(dá), 卵圓形, 大小91 (102—150)×102 (91—138)。腸支單管, 具眾多不對(duì)稱的側(cè)分支(圖 1A)。

睪丸單個(gè), 圓球形, 大小287 (156—338)×230 (165—281)(圖 1A)。交接器由交接管和支持器組成; 交接管近環(huán)形, 管長(zhǎng)414 (316—518), 基部位于支持器的下方, 末端位于三分叉中支外側(cè); 支持器一端呈三叉狀展開, 其中一分叉較長(zhǎng)且基部明顯膨大(圖 1B)。

卵巢卵圓形, 位于睪丸前, 大小127 (84—166)× 126 (90—166)。陰道開口于蟲體右側(cè), 無幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)。卵黃腺呈大濾泡狀, 分布自交接器水平至腸支末端之前(圖 1A)。

描述依據(jù)3個(gè)胭脂蟲紅、2個(gè)明礬洋紅染色標(biāo)本和2個(gè)布氏膠封片標(biāo)本。

2.2 無胄蟲科的分類地位

首次測(cè)得鯛無胄蟲的28S rDNA C1-D2部分序列。原始序列由Clustal X比對(duì)后經(jīng)手工刪除兩端無效序列, 最終組成一個(gè)由24種多鉤類和4種寡鉤類單殖吸蟲構(gòu)成的數(shù)據(jù)集, 序列長(zhǎng)度647—963 bp。比對(duì)后序列全長(zhǎng)1133 bp, 其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)725個(gè),保守位點(diǎn)248個(gè), 變異位點(diǎn)818個(gè)。用Mrmodeltest軟件估計(jì)的最適替代模型是GTR+I+G模型(Nst=6; Rates=invgamma)。生成的BA和ML樹, 在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上沒有差異, 僅節(jié)點(diǎn)支持率有所不同。本文選取了ML的50%多數(shù)一致樹, 并附有BA的PP (%)和ML的Bootstrap值(圖 2)。

分子系統(tǒng)樹顯示: 各個(gè)科以較高的支持率聚為一支, 均是單系群。系統(tǒng)樹由4個(gè)分支組成, 其中基部分支由三代蟲科和Udonellidae科構(gòu)成; 無胄蟲科聚入指環(huán)蟲目分支內(nèi), 與四鉤蟲科(Tetraonchidae)互為姐妹群, 同樣被納入該分支的還有指環(huán)蟲科、錨首蟲科和鱗盤蟲科; 微溝蟲科與單杯科組成一個(gè)分支; 分室科獨(dú)自構(gòu)成一個(gè)分支。4個(gè)分支均擁有較高的分支支持率(70%以上)。

表 1 系統(tǒng)分析所涉及的單殖吸蟲種類及序列信息Tab.1 List of monogenean species and GenBank accession numbers used in the present phylogenetic analyses

圖 1 鯛無胄蟲Fig.1 Anoplodiscus spari (Yamaguti, 1958) Ogawa et Egusa, 1981

3 討論

本文對(duì)采自我國南海大亞灣的鯛無胄蟲作了簡(jiǎn)單描述, 并補(bǔ)充了整體圖和交接器結(jié)構(gòu)圖, 所獲標(biāo)本與Ogawa等(1981)的描述基本一致, 但交接管基部和末端位置略有差異: 在Ogawa等的描述中,交接管基部靠近支持器三叉處、末端從三叉處延伸并略彎曲(圖B2), 而我們的標(biāo)本中交接管基部在支持器的下方、末端從三分叉的中支略為突出(圖B1)。

在Boeger和Kristky[10]的分類系統(tǒng)中, 無胄蟲科與Udonellidae在同一支內(nèi), 均隸屬于三代蟲目, 表明二者具有較近的親緣關(guān)系, 且Udonellidae科的后吸器亦缺乏幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu); 但本研究顯示無胄蟲科與Udonellidae科位于兩個(gè)不同的分支內(nèi): 無胄蟲科位于指環(huán)蟲目?jī)?nèi)、Udonellidae科屬于三代蟲目。生活史上, 無胄蟲的幼蟲階段具有纖毛和8對(duì)幾丁質(zhì)邊緣小鉤[1], 而Udonella的幼蟲及成蟲階段均沒有纖毛也沒有幾丁質(zhì)鉤[19]。形態(tài)結(jié)構(gòu)上, 無胄蟲的邊緣小鉤和腸支結(jié)構(gòu)與四鉤蟲和似四鉤蟲的更為相似。超顯微結(jié)構(gòu)上, 無胄蟲與指環(huán)蟲類的精子都為“4型”(單一軸絲, 無微管) 而Udonella是“2型”(雙軸絲, 無微管)[20]。在本文的分子系統(tǒng)樹上, 無胄蟲科與四鉤蟲科互為姐妹群, 而與三代蟲所在的進(jìn)化支相距甚遠(yuǎn)。無胄蟲曾被歸入微溝蟲科, 后Ogawa等[1]認(rèn)為其為一獨(dú)立的科, 本研究結(jié)果顯示無胄蟲科是一獨(dú)立的科, 與微溝蟲科分屬于不同的進(jìn)化支內(nèi)。綜上所述, 我們認(rèn)為無胄蟲成蟲幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)的缺失為一種同型性狀, 而非共同衍征, 支持Justine等[11]的觀點(diǎn), 即無胄蟲科應(yīng)歸入指環(huán)蟲目。

圖 2 基于28S rDNA部分序列構(gòu)建的無胄蟲科及相關(guān)類群的分子系統(tǒng)樹Fig.2 The phylogenetic tree of Anoplodiscidae and some related groups based on the partial 28S rDNA sequences

本研究證實(shí)了無胄蟲科為一獨(dú)立的科, 支持將無胄蟲科納入指環(huán)蟲目、四鉤蟲亞目。無胄蟲成蟲后吸器幾丁質(zhì)缺失是一種次生現(xiàn)象[21], 提示在研究探討單殖吸蟲的分類地位時(shí), 不能僅依據(jù)成蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu), 還應(yīng)考慮其生活史各個(gè)階段的形態(tài)特征。另幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)是單殖吸蟲分類鑒定的主要依據(jù)[15], 但對(duì)于缺乏或生活史某個(gè)階段缺乏幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)的蟲種(如本文的無胄蟲), 單純依賴形態(tài)特征的分類就顯得尤為不足, 此時(shí)分子系統(tǒng)學(xué)能有效地彌補(bǔ)這一缺陷, 為單殖吸蟲的正確分類提供科學(xué)依據(jù)。

致謝:

華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張劍英教授提供相關(guān)文獻(xiàn), 劉琳副教授協(xié)助英文潤色, 2013級(jí)研究生方偉協(xié)助采集標(biāo)本, 謹(jǐn)致謝忱。

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DESCRIPTION OF ANOPLODICUS SPARI (MONOGENEA: ANOPLODISCIDAE) AND THE TAXONOMIC POSITION OF ANOPLODISCIDAE

ZHOU Zi-Hua, CAI Xing and DING Xue-Juan
(School of Life Science, South China Normal University, Guangdong Provincial Key Laboratory for Healthy and Safe Aquaculture, Guangzhou Key Laboratory of Subtropical Biodiversity and Biomonitoring, Guangzhou 510631, China)

The current study described the whole worm and male copulatory organ of Anoplodicus spari collected from Acanthopagrus schlegeli off Daya Bay, South China Sea.Our specimens of Anoplodicus spari from South China Sea was basically consistent with the description of Ogawa et al.(1981) except for the slight difference in the position of the base and distal end of copulatory tube.The proximal end of the copulatory tube lied beneath the accessory piece and the distal end protruded from the three rami in our specimens, while the distal end extended from the rami and curved in the specimen of Ogawa (1981).The partial 28S rDNA sequences (C1-D2 domain) of Anoplodicus spari and other related groups were used to study the taxonomic position of Anoplodiscidae.The results showed the independent position of Anoplodiscidae, a valid family belonging to the clade of Tetraonchinea, Dactylogyridea.Anoplodiscidae and Tetraonchidae were a sister group in the phylogenetic tree, and this clade was distantly different from Udonellidae and Microbothriidae.

Anoplodicus spari; Anoplodiscidae; 28S rDNA; Taxonomic position

Q959.19

A

1000-3207(2017)04-0891-05

10.7541/2017.111

2016-07-01;

2016-11-07

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31172051和31572232)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31172051, 31572232)]

周梓華(1992—), 男, 廣東南海人; 碩士研究生; 主要從事海水魚類單殖吸蟲研究。E-mail: 289462085@qq.com

丁雪娟, E-mail: dingxj@scnu.edu.cn