楊 超，譚勤銳 綜述，李 暉 審校

(1.成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院,成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中心實驗室,成都 610072)

Toll樣受體對肝纖維化的調控作用進展*

楊 超1，2，譚勤銳1,2綜述，李 暉2△審校

(1.成都中醫(yī)藥大學臨床醫(yī)學院,成都 610075；2.成都中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中心實驗室,成都 610072)

肝纖維化;Toll樣受體;調控

感染、物理、化學、免疫等因素導致的各種損傷，均可引起細胞內環(huán)境發(fā)生變化，形成新的分子模式，模式識別受體(PRRs)通過識別改變后的分子模式，觸發(fā)特異性應答進行組織功能修復，其中包括炎癥和創(chuàng)傷修復[1]。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)屬于模式識別受體家族，且高度保守，能識別外源性配體——病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)和內源性配體——損傷相關分子模式(damage-associated molecular patterns，DAMPs)，被認為是多種慢性疾病導致炎癥反應的觸發(fā)器[2]。

肝纖維化是指各種致病因素引起肝臟慢性損傷和炎癥，刺激大量細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)釋放，ECM合成和降解失衡，導致ECM過度沉積的結果，肝纖維化是多種慢性肝病共同的病理基礎，也是慢性肝病向肝硬化、肝癌發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[3]。肝纖維化與肝臟的慢性炎性反應緊密相關，而作為炎癥反應觸發(fā)器的TLRs在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

1 TLRs

TLRs是一組重要的模式識別受體，最早于1988年在果蠅體內發(fā)現。迄今為止，人體內共發(fā)現10個TLRs(TLR1～TLR10)，小鼠體內共有12個 TLRs(TLR1～TLR9，TLR11～TLR13)[4]。TLRs構成機體防御病原體入侵的第一道屏障，主要表達于肥大細胞、巨噬細胞、樹突細胞、上皮細胞、成纖維細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞(natural killer cells,NK)、γδ T細胞等表面[1,5]，而在肝臟，主要在肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)、肝細胞和Kupffer細胞(KCs)上表達。TLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6和TLR10定位于細胞表面，而TLR3、TLR7、TLR8和TLR9則定位于細胞內的內涵體、溶酶體等。

TLRs是一種高度保守的Ⅰ型跨膜蛋白，它分為胞外區(qū)、 跨膜區(qū)及胞內區(qū)3個功能區(qū)。胞外區(qū)由富含亮氨酸的重復序列(leucine-rich repeats，LRRs)組成，非LRR序列在其間分隔。髓樣分化因子 2(myeloid differentiation factor-2，MD-2)是一種輔助蛋白，它在結構上有 2 個具有相對獨立功能的結構域，不僅能和TLRs的胞外區(qū)結合而定位于細胞表面，還能參與對病原微生物的某些高度保守的特定分子結構即PAMPs的識別[6]，從而增強受體的穩(wěn)定性，促進TLRs對配體識別的敏感性及反應性，并能增強信號轉導的效應。因此胞外區(qū)決定著 TLRs 與相關配體特異性結合的部位，發(fā)揮著識別病原微生物或產物的作用。而胞內區(qū)是TLRs 信號轉導的核心區(qū)域，其結構與人類白細胞介素-1(interleukin 1，IL-1)相似，被稱為 Toll/IL-1R (TIR)結構域，是 TLR 與下游信號分子相互作用并介導下游信號傳導的核心作用元件[7]。

TLRs作為一種模式識別受體，需與相應配體結合才能激活。按照來源其配體可分為外源性配體和內源性配體。外源性配體主要來自病原微生物， 即PAMPs，是微生物進化過程中的保守成分，其中位于細胞表面的TLRs主要識別微生物細胞膜成分，TLR1、TLR2和TLR6主要識別G+菌細胞壁成分，如肽聚糖、N-?；鞍?、甘露聚糖、酵母聚糖、脂膜酸等，TLR4則識別G-菌細胞壁成分脂多糖(LPS)，TLR5識別細菌鞭毛蛋白，TLR10則可識別位于李斯特菌和A型流感病毒上的配體；位于細胞內的TLRs主要識別細菌或病毒核酸，TLR3識別病毒雙鏈RNA、小干擾RNAs，TLR7識別病毒單鏈RNA，TLR8識別病毒或細菌的RNA，TLR9識別非甲基化 DNA(CpG DNA)[1,4]。內源性配體即DAMPs，在細胞外基質降解、組織損傷、機體應激時釋放，如高遷移率族蛋 B1(HMGB1)、透明質酸、熱休克蛋白等，大多數通過TLR2和TLR4介導[8]。

2 TLRs信號轉導通路

髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)是 TLRs信號轉導途徑中最主要的接頭蛋白，它主要通過TIR與 TLRs/IL-1R結合，向胞內傳遞信號，激活核因子- κB(NF-κB)等轉錄因子，引起多種炎性細胞因子及抗凋亡分子的釋放，參與人體固有免疫[9]。TLRs 信號通路可分為 MyD88依賴信號通路和Trif(Toll-interleukin-1 R domain-containing adaptor inducing interferon-b)依賴信號通路，除TLR3外，其他TLRs均通過MyD88 信號通路傳導，而TLR4信號則可通過MyD88 和Trif兩條信號通路下傳，MyD88和Trif依次觸發(fā)多條促炎信號通路，包括NF-κB，JNK/AP1，ERK和P38信號通路，也可通過干擾素調節(jié)因子(IRF)激活干擾素信號通路[10-11]。

TLR激活還能觸發(fā)調節(jié)性反饋環(huán)，稱為TLR耐受(TLR tolerance)，對TLR活性的負調節(jié)通過一系列分子機制進行，包括影響TLR與配體的結合，TLR水平下調和降解，抑制下游信號，通過染色質重塑、組蛋白修飾等改變TLR作用靶點結構等[1]。

3 TLRs對肝纖維化的調控作用

病毒性肝炎、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝炎所引起的慢性肝臟炎癥是導致肝纖維化的主要原因，肝纖維化可進展成為肝硬化、肝細胞癌(HCC)和肝衰竭等終末期肝病。而TLRs通過識別PAMPs和DAMPs，觸發(fā)一系列炎癥級聯(lián)反應，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用。

3.1 TLR4與肝纖維化 TLR4 屬于細胞表面TLRs，同時也是迄今為止研究最多的TLRs，對人體免疫系統(tǒng)，尤其是固有免疫應答有重要調控作用。TLR4在肝臟主要分布在HSCs、肝內皮細胞、KCs等，識別LPS和DAMPs[12]。

LPS作為TLR4的主要外源性配體，是G-細菌細胞壁的主要成分。LPS/TLR4 信號轉導是一個十分復雜的過程。LPS首先與 TLR4 的胞外區(qū)域結合， 這個過程需要LPS結合蛋白(LBP)、CD14和MD-2的參與。LPS與 TLR4結合后引起受體絡合物的構象發(fā)生改變，進而引起胞內接頭蛋白的聚集，最終引發(fā)信號級聯(lián)反應，最終激活轉錄因子如NF-κB和活化蛋白1(AP-1) 及IL調節(jié)因子，這些轉錄因子能引起參與炎癥反應、抗病毒應答、抗細菌應答及調控細胞生存和凋亡基因的轉錄[13]。

基于解剖位置，肝臟不斷受到通過門靜脈進入的腸源性細菌成分，主要是LPS的刺激，而生理狀態(tài)下的肝臟具有耐受低水平LPS的能力，可避免產生持續(xù)性的肝臟炎癥，TLR4、MD-2和MyD88的低水平表達即可證實這一點。當慢性肝病患者腸源性細菌轉位增加，血液循環(huán)中LPS水平上升，通過TLR4觸發(fā)下游炎癥反應，持續(xù)或重復性的肝損傷則可刺激肝細胞、HSCs和KCs之間產生不良的相互作用，導致膠原蛋白和其他細胞外基質蛋白在肝臟的沉積，最終引起肝纖維化，因此，TLR4在肝纖維化的形成過程中起到重要的調控作用，是各種病因導致肝纖維化的主要調節(jié)子[1,8]。

Seki 等[14]給大鼠飼喂大劑量非吸收性廣譜抗生素，以有效抑制腸道中 LPS 進入肝臟，然后將大鼠膽道結扎(BDL)以造成肝纖維化模型，發(fā)現與對照組相比，在血漿 LPS 減少的同時，各項肝纖維化指標(collagen-1、Acta2、TGFβ1、TIMP1)均提示肝纖維化程度明顯減輕。另有研究表明，槐果堿具有抗纖維化作用，主要機制是通過抑制體內促肝纖維化的細胞因子與TLR4的表達信號通路相關蛋白的表達，阻斷LPS誘導的TLR4信號轉導通路，影響HSCs的激活，減少炎癥細胞因子的生成，如IL-6和TNF-α，達到槐果堿抗肝纖維化的作用[15-16]。而不同肝纖維化動物模型中TLR4、TLR4結合分子CD14、LPS輔助受體MD-2、MyD88及Trif等的表達缺失可提高個體抗肝纖維化能力[1]，進一步證實了TLR4信號在肝臟炎癥反應及肝纖維化形成過程中的關鍵作用[1]。

此外，肝內皮細胞上的TLR4可調節(jié)纖維化相關新血管形成，但尚需在體內靶向性清除肝內皮細胞上的TLR4后加以證實[17]。慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染，由于TLR4基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的存在，使患者對LPS的應答下降，可減輕肝纖維化進展程度[18]。血管緊張素轉化酶抑制劑-培哚普利和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體阻斷劑-氯沙坦治療肝纖維化大鼠后，其血清透明質酸和層黏連蛋白的含量明顯下降，同時肝臟中PDGF和TGF-β1表達下降，而AngⅡ在多種細胞中能直接促進TLR4的表達，如大鼠腹膜間皮細胞、小鼠系膜細胞等，說明培哚普利和氯沙坦可能通過拮抗AngⅡ，從而抑制TLR4的表達，減輕肝組織的損害，進而發(fā)揮抗纖維化作用[19]。另有研究表明，腸源性微生物成分激活TLR4，可促進慢性肝臟疾病進展至HCC[20]。

除LPS外，TLR4也被內源性配體——DAMPs激活，如HMGB1、熱休克蛋白等。HMGB1是HMGB家族的成員之一，是結合DNA的非組蛋白核蛋白，主要功能是體細胞轉錄調控。一方面，HMGB1可以由多種細胞如巨噬細胞、單核細胞、NK細胞、樹突狀細胞(DCs)、內皮細胞、血小板等分泌，另一方面，細胞壞死或損失后也可被動釋放HMGB1。有研究發(fā)現，HMGB1與肝纖維化發(fā)生密切聯(lián)系，呈現促肝纖維化效應，可上調肝纖維化進展關鍵細胞——HSCs的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達水平，抑制降解膠原蛋白的基質蛋白酶-2(MMP-2)活性，促進HSCs轉化為成肌纖維細胞[21]；肝纖維化大鼠HMGB1水平上調，與膠原蛋白沉積密切相關，采用小干擾RNA(siRNA)抑制HMGB1表達可減少轉染HSCs合成α-SMA和生成膠原蛋白[22]；姜黃素通過減少TLR2和HMGB1的表達，抑制促炎癥介質和HSCs的活化，達到有效治療肝纖維化的目的[23]；HMGB1可刺激HSCs的遷移，增強JNK、PI3K/Akt信號通路及NF-κB的激活，但采用中和抗體阻斷TLR4后，上述作用均受到抑制，說明HMGB1誘導下的HSCs增殖、遷移及促纖維化效應均依賴于TLR4信號轉導通路[24-25]。抑制HMGB1/TLR4結合或HMGB1的表達可能是肝纖維化治療的潛在靶標。

3.2 TLR9與肝纖維化 TLR9 是 TLRs 家族在人體中分布區(qū)域最為狹窄的，主要分布在DCs和HSCs，屬于細胞內TLRs。TLR9的主要配體是CpG DNA，二者結合后通過MyD88 依賴途徑激活下游IRAK/TRAF 通路，激活干擾素調節(jié)因子7(IFN regulate factor 7，IRF7)使 IFN-α 水平升高，激活 NF-κB 信號通路，分泌系列炎癥因子，并激活 MAPK 通路[26-27]。

研究發(fā)現，TLR9既識別CpG DNA，還可識別凋亡肝細胞釋放的變性DNA片段，激活HSCs，促進肝纖維化[28]；凋亡肝細胞釋放的變性DNA片段，與細胞內TLR9結合，激活一系列信號級聯(lián)，導致HSCs分化成為成肌纖維細胞，TGF-β1因子和1型膠原水平上調，且上調作用可被TLR9拮抗劑阻斷；經CCl4、BDL、脂肪性肝病等造模處理后，TLR9缺陷小鼠的肝纖維化程度較野生型小鼠更輕[29-30]。通過非酒精性脂肪性肝炎動物模型研究發(fā)現，TLR-9缺陷小鼠的脂肪性肝炎和肝纖維化程度較野生型小鼠更輕，IL-1β產生受到抑制。表達在DCs上的TLR9對于肝纖維化是關鍵因素，去除DC的動物肝纖維化明顯減輕，CpG DNA能夠刺激纖維化肝臟的DCs產生TNF-α、IL-6和其他化學因子，從而激活HSCs[31]。上述研究結果均提示TLR9具有促肝纖維化作用。

但另有研究表明，TLR9還有抗肝纖維化的作用，TLR9激活可抑制CD8細胞，刺激NK細胞增生，增加NK細胞的細胞毒性，肝NK細胞可通過直接殺死活化的HSCs起到抗肝纖維化的作用[32]，從而表現抗肝纖維化作用，而另一方面，具有促肝纖維化和促炎癥作用，α-SMA表達增加，ALT血清水平升高。而且對于淋巴細胞和HSCs的TLR9激活也可產生不一樣的效應，纖維化結果各異。因此TLR9對于肝纖維化的影響具有雙重性，最后結局取決于二者之間達成的平衡[33]。

3.3 其他TLRs與肝纖維化 TLR2對于肝纖維化的影響存在爭議。研究表明，給予高脂飲食后，TLR2可導致肝損傷加重；BDL或慢性CCl4給予后，TLR2缺陷小鼠較野生型小鼠肝損傷降低；BDL后的TLR2缺陷小鼠細菌轉位減少，內毒素水平下降，可通過減少TLR4信號途徑減輕肝纖維化[34]。但也有研究指出，BDL后，在肝損傷和降低肝纖維化方面，TLR2缺陷小鼠與對照組無區(qū)別[35]。

TLR3信號是潛在的Ⅰ型干擾素誘導劑，唯一不依賴MyD88的TLRs，通過IRF激活干擾素信號通路。TLR3的天然配體是病毒雙鏈RNA，合成的聚肌胞(Poly I∶C)也是TLR3信號的激動劑，Poly I∶C 可刺激肝NK細胞產生IFN-γ，誘導抗病毒、抗腫瘤及抗纖維化活性，Poly I∶C或IFN-γ可增強NK細胞的細胞毒性，刺激NK細胞殺死HSCs，減輕肝纖維化，該效應在早期肝纖維化可觀察到[36]，但在進展期肝損傷，NK細胞/IFN-γ的抗纖維化效應受到抑制，原因可能在于活化HSCs產生更多的TGF-β和細胞信號抑制子1(SOCS1)[26,37]。Poly I∶C不能減輕酒精性肝病模型由CCl4誘導的肝纖維化，慢性酒精作用使依賴TLR3的NK細胞對HSCs的殺傷作用受到抑制，因此，在進展性肝病和酒精性肝病，肝纖維化加重的機制之一即TLR3介導的NK細胞活性降低[26]。

4 展 望

肝纖維化的發(fā)生是繼發(fā)于肝臟炎癥或細胞損傷后的修復反應，幾乎所有的慢性肝臟損害的患者均可發(fā)生。隨著研究地深入，人們逐漸認識到TLRs與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關，但是由于對其認識尚且不夠全面，需要進一步探索TLRs對肝纖維化的作用機制，為肝纖維化日后的治療提供更明確的思路。希望在不久的將來，TLRs成為治療肝纖維化的新的藥物干預靶標。

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四川省教育廳資助項目(12ZA039)。 作者簡介：楊超(1990-)，碩士，主要從事中西醫(yī)結合防治肝病的研究?！?/p>

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.20.041

R575.2

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1671-8348(2017)20-2853-04

2017-02-22

2017-04-17)