孫艷珍，張 濤，陳良榮，歐 超，黃曉燕，楊 杰，陳遠能△

(1.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧 530011；2.廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所檢驗科，南寧 530021；3.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧 530023)

幽門螺桿菌聯(lián)合MNU灌胃法制備balb/c小鼠胃癌模型研究*

孫艷珍1，張 濤1，陳良榮1，歐 超2，黃曉燕3，楊 杰1，陳遠能1△

(1.廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧 530011；2.廣西壯族自治區(qū)腫瘤防治研究所檢驗科，南寧 530021；3.廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南寧 530023)

目的 探討幽門螺桿菌聯(lián)合N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)灌胃法制備balb/c小鼠胃癌模型。方法 80只balb/c小鼠，適應性喂養(yǎng)1周后，分成4組，即正常組、模型Ⅰ組、模型Ⅱ組、模型Ⅲ組，每組20只。模型Ⅰ組、模型Ⅱ組、模型Ⅲ組，先予幽門螺桿菌菌液CFU=109/mL灌胃，隔天1次，共5次；然后依次分別給予新鮮配制的MNU溶液0.15、0.30、0.60 mL灌胃，MNU和純水配置比為5 mg∶3 mL,每周灌胃1次，持續(xù)10周。結(jié)果 模型Ⅱ組66.67%腺癌，模型Ⅰ組小鼠全部胃炎伴輕度不典型增生，模型Ⅲ組小鼠全部死亡。結(jié)論 此法能夠制備胃癌模型。

N-甲基-N-亞硝基脲；螺桿菌，幽門；balb/c小鼠；胃腫瘤

胃癌的發(fā)病率在逐年下降，但癌癥相關(guān)的死亡原因仍然是全球第2，每年導致750 000人死亡，是第2常見的癌癥[1]。幽門螺桿菌(Hp)的高陽性率基本顯示與胃內(nèi)病變的一致性。數(shù)年內(nèi)的感染多數(shù)僅能引起輕度的淺表性胃炎，但數(shù)十年的長期感染易出現(xiàn)糜爛、萎縮性胃炎甚至胃腫瘤[2]。1994年世界衛(wèi)生組織已將Hp定為Ⅰ類致癌因子。Hp感染后胃癌的發(fā)生遵循“慢性胃炎→胃黏膜萎縮→腸上皮化生→不典型增生→胃癌”模式[3]。目前雖不能肯定Hp感染與胃癌有直接因果關(guān)系，但大量的流行病學、臨床和實驗研究支持Hp是胃癌的始動因素，亦是胃癌發(fā)生、發(fā)展過程中的啟動、促進因子[4]。胃癌在亞洲東部發(fā)病率最高，是欠發(fā)達國家人口癌癥死亡的主要原因[5]，世界衛(wèi)生組織最近發(fā)布的《World Cancer Report 2014》表明，2012年中國胃癌新增病例和死亡人數(shù)高居世界首位，約占40%[6]。顯然，一個理想的Hp誘導的胃癌模型對胃癌癌變機制的研究非常重要。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性balb/c小鼠80只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號： SCXK(湘)2001-0003，合格證號：0060892，實驗單位使用許可證編號：SCXK(桂)2010-0001。動物飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心，恒溫(23±2)℃，恒濕(50±10)%，晝夜循環(huán)(12 h∶12 h)條件下適應性喂養(yǎng)1周后，再開始正式分組實驗。小鼠組織取材于廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心實驗室內(nèi)進行，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 試劑與儀器 Hp悉尼菌株SS1由南昌大學第一附屬醫(yī)院消化疾病重點實驗室惠贈；錐形瓶、牛皮紙、氧產(chǎn)氣袋、離心管(15 mL)、接種環(huán)(10 μL)、巴氏吸管(3 mL)、90 mm一次性塑料培養(yǎng)皿、MGC厭氧產(chǎn)氣袋、哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)(貨號CM911)、無菌脫纖維綿羊血(北京索萊寶科技有限公司)；N-甲基-N-亞硝基脲(MNU)[美國Sigma公司(貨號N136701)];10%中性福爾馬林固定液、0.9%生理鹽水；恒溫水浴鍋、手術(shù)器械、彎灌胃針、一次性注射器(1、50 mL)、純水;RM2135 Leica切片機(德國)、倒置光學顯微鏡(日本OLYMPUS CKX41，U-CTR30-2)等。

1.3 方法

1.3.1 Hp培養(yǎng) 哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基8.8 g溶于200 mL純水的錐形瓶中，牛皮紙密封錐形瓶， 120 ℃、20 min高壓鍋滅菌后，待溫度降至50～60 ℃時在超凈臺中將7%脫纖維綿羊血14 mL滴入瓊脂培養(yǎng)基中，混勻，迅速倒板，每個培養(yǎng)皿約20 mL，靜置使凝固。將凍存于-80 ℃冰箱的Hp-SS1菌株取出，放入恒溫水浴鍋中，溫度設(shè)置為37 ℃，水浴加熱1 min，至融化。用接種環(huán)蘸取凍存管中的菌液，將細菌接種于7%瓊脂羊血培養(yǎng)基中，之后將其放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐內(nèi)，放入一包厭氧產(chǎn)氣袋，將厭氧培養(yǎng)罐蓋好，放回37 ℃細菌培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)48 h后，超凈臺中打開培養(yǎng)罐，可見培養(yǎng)皿針尖樣菌落長出，接種環(huán)將細菌刮下，溶于布氏肉湯，制成Hp菌液，紫外分光光度計測濃度，Hp菌液CFU=109/mL。Hp培養(yǎng)成功見圖1。

左1為溶于布氏肉湯制成的Hp菌液做快速尿素酶試驗，右邊的5瓶為培養(yǎng)皿中刮下的Hp做的快速尿素酶試驗，3 min內(nèi)可見明顯的紫紅色反應

圖1 Hp培養(yǎng)

1.3.2 造模方法 80只雄性5周齡balb/c小鼠，室溫適應性喂養(yǎng)1周后，分為模型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組和正常組，每組20只。將制作好的Hp菌液給模型組小鼠灌胃，每只0.8 mL,隔天1次，共5次。將MNU溶于純水中，MNU與純水的配比為5 mg∶3 mL。除正常組同步飼養(yǎng)外，造模動物分別予0.15、0.30、0.60 mL灌胃，每周1次，持續(xù)10周；同時注意觀察各小鼠死亡、體質(zhì)量、毛發(fā)、耗食量、活動等情況。開始灌胃或第一次灌胃至38周所有小鼠同等條件下正常飼養(yǎng)，因胃癌化學誘導模型所需時間長，成功率低，符合人的發(fā)病規(guī)律。

1.3.3 標本采集 第38周末時，將全部動物脫椎處死，用組織剪沿腹中線將腹腔剪開，暴露腹腔臟器，將胃剪下(食管末端至十二指腸球部之間)，沿胃大彎將胃剪開，0.9%生理鹽水沖洗，剪刀剪取1/2的胃組織做快速尿素酶試驗；剩余1/2的胃組織沖洗干凈，迅速將其放到10%的中性福爾馬林固定液中，密封保存待光鏡檢測。

1.3.4 Hp感染的檢測方法 感染的診斷：符合下述3項其中1項可判斷為Hp現(xiàn)癥感染。(1)胃黏膜組織RUT、組織切片染色或細菌培養(yǎng)3項中任1項陽性；(2)13C-或14C-UBT陽性；(3)HpSA檢測陽性[7]。將小鼠胃組織剪下，取1/2的胃組織做快速尿素酶試驗，10 min內(nèi)可見紫紅色反應，證實小鼠胃Hp定植成功。見圖2。

A:2只小鼠胃組織快速尿素酶試驗；B:小鼠1胃組織快速尿素酶試驗；C:小鼠2胃組織快速尿素酶試驗

圖2 Hp定植成功檢測

1.3.5 小鼠胃病理改變情況的觀察和損傷評分 將已用10%中性福爾馬林固定液固定好的小鼠胃取出，然后切取病變處，經(jīng)用蒸餾水沖洗，放入生物脫水機進行逐級脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋切片4 μm，常規(guī)HE染色，封片，光鏡下觀察炎癥和癌變情況。組織學變化和分級依據(jù)2012年中國慢性胃炎共識意見研討會[8]，組織學變化包括5項：Hp感染、慢性炎癥(單個核細胞浸潤)、活動性(中性粒細胞浸潤)、萎縮(固有腺體減少)、腸化生(腸上皮化生)；4個分級包括0為無，+為輕度，++為中度，+++為重度；胃黏膜萎縮程度分期，見表1。

表1 胃黏膜組織學變化和分級

2 結(jié) 果

2.1 小鼠一般情況變化 模型組小鼠造模13周開始，出現(xiàn)部分小鼠耗食量減少、毛發(fā)稀疏、嗜睡、懶動、乏力、拱背、互咬尾巴等現(xiàn)象。正常組小鼠1只小鼠死亡，模型Ⅰ、Ⅱ組小鼠各2只小鼠死亡。模型Ⅲ組20小鼠全部死亡，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，部分死亡小鼠有腹腔臟器穿孔、腹腔臟器粘連，部分死亡的小鼠肝臟局部黑變。

2.2 肉眼及光鏡下觀察胃黏膜損傷情況 肉眼可見模型組各小鼠胃黏膜充血、水腫。正常組小鼠胃黏膜未發(fā)現(xiàn)異常改變；模型Ⅰ組充血腫脹，糜爛明顯，未見潰瘍及結(jié)節(jié)樣改變；模型Ⅱ組胃黏膜充血腫脹，糜爛明顯，可見潰瘍樣變化，底披少許薄苔。 光鏡下：正常組黏膜完整，各層結(jié)構(gòu)清晰，未見炎細胞浸潤及上皮異型增生;模型Ⅰ組局部正常黏膜脫失，黏膜充血、黏膜下層增寬，少許炎性細胞浸潤，部分呈低級別-中級別上皮內(nèi)瘤變；模型Ⅱ組局部正常黏膜脫失，纖維組織增生，較多炎性細胞浸潤，內(nèi)見不規(guī)則異型腺體增生，符合中分化腺癌改變。見圖3，表2、3。

A:正常組；B：模型Ⅰ組；C：模型組Ⅱ組

圖3 各組小鼠胃黏膜組織形態(tài)學變化(×10)

-：此項無數(shù)據(jù)

表3 各組胃黏膜萎縮程度的比較

3 討 論

現(xiàn)階段，關(guān)于胃癌的動物模型建立研究主要集中在原位移植法、移植瘤法、免疫抑制劑法、轉(zhuǎn)基因法和誘導法5大類[9]；前者因操作復雜、成本高而較難推廣，化學物理法造模因操作過多過雜，不確定因素多，與人類胃癌的形成過程不接近，故使用不多。筆者采用MNU聯(lián)合Hp制備胃癌模型,造模周期38周。balb/c小鼠呼吸道功能脆弱，呼吸道癌發(fā)病率2.5%，易患慢性胃炎，且隨著年齡的增長，患肺癌等其他消化道癌癥外疾病的概率增大，肺癌發(fā)生率約27.5%。本實驗在造模期間死亡的動物經(jīng)檢驗未發(fā)現(xiàn)肺癌等消化道外癌癥，造模期間動物的高死亡率排除balb/c小鼠因罹患其他癌癥死亡的可能性。與前兩種造模方法相比，Hp聯(lián)合MNU灌胃法制備balb/c小鼠胃癌模型具有如下優(yōu)點：(1)采用灌胃的方法簡單易行，且易于推廣；(2)實驗重現(xiàn)性高，所需費用相對較少；(3)致癌原理與人類胃癌相似；(4)無需外科手術(shù)，損傷小，可排除人為干擾因素的影響。筆者通過Hp菌液CFU=109/mL灌胃，隔天1次，共5次；后給予新鮮配制的MNU溶液灌胃，MNU和純水配置比為5 mg∶3 mL，每周1次，持續(xù)10周的方法成功制備胃癌模型，此方法值得應用和推廣。

MNU是強有力的致癌物質(zhì)，致癌的能力已被多人證實[9]，是經(jīng)典的用于致癌性實驗的陽性對照物，可經(jīng)皮、食入、吸入等方式吸收，是一種常用的致癌物。Hp是一種對生長環(huán)境要求十分苛刻的微需氧革蘭陰性桿菌；已被證實是活動性胃炎、消化性潰瘍等胃病的原因之一，同時也可能是胃癌的發(fā)病因素之一，所以Hp聯(lián)合MNU灌胃法制備balb/c小鼠胃癌模型具有合理、可行性。

MNU為黃色晶體，可溶于水，應儲存于-20 ℃冰箱中； 20 ℃室溫下，溶液pH=4時，MNU半衰期為125 h,pH=9時，半衰期不足2 min；通常將MNU溶于pH=5的溶劑中，并在3 h內(nèi)用完，pH越高則促進MNU與水反應，以排除污染[10]。故使用MNU灌胃應現(xiàn)配現(xiàn)用，不宜久置，避免使用分解的MNU灌胃，否則會引起較大實驗誤差，使灌胃次數(shù)增多、造模時間延長，浪費寶貴的時間和實驗耗材，甚至引起實驗動物中毒死亡。筆者通過MNU聯(lián)合Hp灌胃法成功制備胃癌模型，予0.6 mL灌胃時，小鼠病死率達100%，驗證了大劑量MNU灌胃可提高致死率，也驗證了MNU的毒力及致畸作用。

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Helicobacter pylori combined with MNU gavage for preparing balb/c mouse gastric cancer model*

SunYanzhen1,ZhangTao1,ChenLiangrong1,OuChao2,HuangXiaoyan3,YangJie1,ChengYuanneng1△

(1.DepartmentofGastroenterology,AffiliatedRuikangHospital,GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning,Guangxi530011,China;2.GuangxiZhuangAutonomousRegionInstituteofTumorPreventionandControl,Nanning,Guangxi530021,China;3.FirstAffiliatedHospital,GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning,Guangxi530023,China)

Objective To investigate Helicobacter pylori combined with N-methyl-N-nitrosourea (MNU) gavage for preparing balb/c mouse gastric cancer model.Methods Eighty balb/c mice were randomly divided into four groups after 1-week adaptive feed,normal group,model group Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ,20 cases in each group.The model group Ⅰ,Ⅱ and Ⅲ were given Helicobacter pylori bacteria liquid (CFU=109/mL) gavage,once every other day for 5 times;then,the freshly configured MNU solution 0.15,0.3,0.6 mL gavages were in turn given,MNU and pure water allocation ratio was 5mg:3mL.Once gavage per week for continuous 10 weeks.Results The model group II had 66.67% adenocarcinoma,the model group I were gastritis with mild atypical hyperplasia,and all mice in the model group III died.Conclusion This method can prepare the gastric cancer model.

N-methyl-N-nitrosourea;Helicobacter pylori;balb/c mice;stomach neoplasms

國家自然科學基金資助項目(81360531)；廣西衛(wèi)生廳重點項目(重2012030)。 作者簡介：孫艷珍(1990-)，碩士，主要從事消化系統(tǒng)疾病診治方面研究。△

,E-mail：cyn60668@aliyun.com。

?術(shù)與方法·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.20.023

R735.2

A

1671-8348(2017)20-2806-03

2017-02-07

2017-04-12)