李舒眉,馮紅超,馬竹君，韋 敬

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科,貴陽 550004；2．貴州省貴陽市口腔醫(yī)院口腔頜面外科 550001)

CD68+和CD163+巨噬細胞在口腔鱗狀細胞癌中的浸潤及作用*

李舒眉1,馮紅超2△,馬竹君2，韋 敬2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科,貴陽 550004；2．貴州省貴陽市口腔醫(yī)院口腔頜面外科 550001)

目的 了解CD68+、CD163+巨噬細胞的浸潤數(shù)量與口腔鱗狀細胞癌(OSCC)臨床特征的相關(guān)性，探討CD68+、CD163+巨噬細胞在OSCC中的作用及意義。方法 選取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院和貴陽市口腔醫(yī)院2013-2016年手術(shù)切除的，經(jīng)術(shù)后病理確診，且有完整臨床資料的OSCC患者42例，另設(shè)12例口腔頜面部正常組織作對照。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測CD68+、CD163+巨噬細胞在OSCC中的浸潤數(shù)量，并分析其與OSCC臨床特征的相關(guān)性。結(jié)果 OSCC中CD68+、CD163+巨噬細胞的浸潤數(shù)量明顯高于對照組(P<0.05)；CD68+、CD163+巨噬細胞在中低分化的浸潤數(shù)量明顯高于高分化的浸潤數(shù)量(P<0.05)；CD68+巨噬細胞在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的浸潤數(shù)量明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)量(P<0.05)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中CD163+巨噬細胞的浸潤數(shù)量明顯高于CD68+(P<0.05)。CD68+和CD163+巨噬細胞在OSCC中的浸潤數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.48，P=0.00)。結(jié)論 腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMs)、M2型巨噬細胞對OSCC具有一定的作用，TAMs可能抑制OSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而M2型巨噬細胞可能促進OSCC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

口腔；癌，鱗狀細胞;CD68;CD163;巨噬細胞;免疫組化

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，它具有惡性程度高,常向區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，晚期可發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移等特點，而頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是目前臨床上腫瘤致死的主要因素[1]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)了腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)，特別是其亞型-M2型巨噬細胞與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但目前為止，TAMs和M2型巨噬細胞對腫瘤臨床預(yù)后的意義仍未達到統(tǒng)一。基于前人的研究，筆者采用公認的CD68抗體標記TAMs，用CD163抗體標記M2型巨噬細胞[2]，采用免疫組織化學(xué)方法，分析CD68+、CD163+巨噬細胞的浸潤數(shù)量與OSCC臨床特征的相關(guān)性，探討CD68+、CD163+巨噬細胞在腫瘤微環(huán)境中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集貴州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院和貴陽市口腔醫(yī)院2013-2016 年手術(shù)切除的，經(jīng)術(shù)后病理確診，且有完整臨床資料的OSCC患者42例，其中男31例，女11例，年齡30～77歲，平均年齡60歲。所有患者術(shù)前未接受任何針對腫瘤的治療(如放療、化療等)，無自身免疫性疾病等其他疾病。其中高分化12例，中低分化30例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。另設(shè)12例口腔頜面部正常組織作對照(正常組織主要取自整形手術(shù)術(shù)區(qū)的口腔頜面部組織或阻生齒拔除術(shù)中切取正常的牙齦組織)，男5例，女7例，平均年齡35歲。本課題得到倫理委員會的批準，并且所有患者知情同意。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法和指標 所有標本先用 10% 甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,4 μm 連續(xù)切片進行非生物素二步法免疫組織化學(xué)染色檢測。鼠抗人CD68單克隆抗體(即用型)、鼠抗人CD163單克隆抗體(即用型)、PV-9000試劑盒、DAB顯色試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品,操作步驟參照試劑盒說明書進行。用已知的陽性組織切片做陽性對照,以 PBS取代一抗做陰性對照。

1.2.2 結(jié)果判定 在切片上CD68+、CD163+均表達于巨噬細胞的細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi),細胞呈黃褐色或棕褐色陽性巨噬細胞。先在低倍(100倍)光學(xué)顯微鏡下觀察整張切片,選擇5個不重疊的高倍視野 (400倍)下計數(shù)陽性細胞,所有切片由兩名研究人員觀察，取其平均值。

2 結(jié) 果

2.1 正常組織與OSCC組織中CD68+、 CD163+巨噬細胞的浸潤數(shù)量的比較 CD68+與CD163+巨噬細胞主要在上皮下的結(jié)締組織中表達，在腫瘤細胞中主要在腫瘤浸潤的前沿間質(zhì)中表達。CD68+與CD163+在OSCC中的浸潤數(shù)量均高于對照組(P<0.05)。見圖1、2，表1。

圖1 巨噬細胞在腫瘤浸潤的前沿間質(zhì)中表達(HE×100)

圖2 巨噬細胞在正常組織中的表達(HE×100)

2.2 CD68+、 CD163+巨噬細胞浸潤數(shù)量與腫瘤的分化程度的關(guān)系 CD68+、CD163+在中低分化的浸潤數(shù)量明顯高于高分化的浸潤數(shù)量(P<0.05)。見表2。

表1 CD68+、 CD163+巨噬細胞在OSCC和正常組織中的浸潤數(shù)量

表2 CD68+、CD163+巨噬細胞與腫瘤分化程度的關(guān)系

2.3 CD68+、 CD163+巨噬細胞浸潤數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系 CD68+巨噬細胞在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的浸潤數(shù)量明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的浸潤數(shù)量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而CD163+巨噬細胞的浸潤數(shù)量與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中CD163+巨噬細胞的浸潤數(shù)量明顯高于CD68+，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中CD68+、CD163+巨噬細胞的浸潤數(shù)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表3。

A:CD68+;B:CD163+

圖3 在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中CD68+、CD163+巨噬細胞的表達情況(HE×100)

2.4 相關(guān)性分析 CD68+與CD163+巨噬細胞之間存在正相關(guān)(r=0.48,P=0.00)；在OSCC中，CD68+、CD163+巨噬細胞的浸潤數(shù)量與患者的性別、年齡、腫瘤大小無相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

OSCC是我國口腔頜面部最常見的惡性腫瘤，多發(fā)生于中老年人，男性多于女性，常影響患者的面形及功能，甚至因轉(zhuǎn)移到重要部位而無可挽救。因此，了解腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制成為了研究者們一直以來的目標。

巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的炎癥細胞群，通過釋放許多化學(xué)物質(zhì)影響腫瘤細胞。文獻表明，TAMs至少有兩種亞型：即經(jīng)典活化的M1型巨噬細胞和替代性(選擇性)活化的M2型巨噬細胞。多數(shù)研究認為M1型巨噬細胞具有抗腫瘤的作用[3]，而M2型巨噬細胞能夠促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。本研究用公認的CD68抗體標記TAMs，用CD163抗體標記M2型巨噬細胞[2]。結(jié)果顯示CD68+、CD163+巨噬細胞在OSCC的浸潤數(shù)量明顯高于對照組(P<0.05)。提示腫瘤中確實存在炎癥反應(yīng)，這種現(xiàn)象可能是由于腫瘤細胞或間質(zhì)細胞分泌的細胞因子通過某種機制募集了血液循環(huán)中的單核細胞，使其在腫瘤組織處演變成巨噬細胞，亦或由局部組織中的巨噬細胞增殖而來，這種促進腫瘤的炎癥反應(yīng)被列為腫瘤的第七大特征[5]。

相關(guān)分析顯示：CD68+和CD163+巨噬細胞在OSCC中的浸潤數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.48，P<0.01)，并且二者間的數(shù)量差異較小。說明了TAMs可能傾向于表達M2型巨噬細胞，這與大多數(shù)研究相一致[4]。有文獻表明，M2型巨噬細胞具有較低的抗原遞呈能力，能夠促進血管的生成，參與調(diào)節(jié)性T細胞的分化和免疫抑制，誘導(dǎo)局部免疫耐受狀態(tài)[6]。有學(xué)者報道，高水平的TAMs或M2型巨噬細胞與不良的臨床特征相關(guān)[7]。本研究結(jié)果顯示：CD68+、CD163+巨噬細胞在中低分化的浸潤數(shù)量明顯高于高分化者(P<0.05)，CD68+巨噬細胞在無淋巴結(jié)中轉(zhuǎn)移的數(shù)量明顯高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 (P<0.05)，說明CD68+、CD163+巨噬細胞與OSCC的病理分級及淋巴轉(zhuǎn)移有一定的關(guān)系。查閱國內(nèi)外文獻可知，TAMs在一般情況下可通過直接介導(dǎo)細胞毒作用(macrophage-mediated tumor cytotoxicity，MTC)和抗體依賴的細胞毒作用(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)來殺傷腫瘤細胞，在前期的研究中用顯微鏡在體外觀察到癌細胞被單核/巨噬細胞吞噬、裂解的圖像，但在缺氧條件下單核/巨噬細胞殺傷腫瘤細胞的能力減弱[8]。在對此進一步探索研究中，有研究者提出，由于巨噬細胞是動態(tài)的非均質(zhì)的免疫細胞，可在不同的腫瘤微環(huán)境刺激下發(fā)生不同性質(zhì)的活化，因此可分化為不同的亞群：一種是經(jīng)典活化的巨噬細胞,又稱為M1型巨噬細胞；另一種是替代性(選擇性)活化的巨噬細胞,又稱為M2型巨噬細胞。其中M2型巨噬細胞主要出現(xiàn)在腫瘤中晚期，可通過減弱急性期炎癥反應(yīng)，抑制 Th1型免疫應(yīng)答，釋放一系列活性分子來促進腫瘤血管、淋巴管的生成，而且還可通過誘導(dǎo)基質(zhì)重建和腫瘤細胞的免疫耐受等機制，來促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[9-11]，這與本研究結(jié)果相一致。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：CD163+巨噬細胞在淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移的情況下染色數(shù)量比CD68+巨噬細胞多。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)與TAMs、M2型巨噬細胞的所屬關(guān)系有一定矛盾。國內(nèi)外文獻對此也眾說紛紜，有研究表明腫瘤細胞本身也表達CD163，如乳腺癌、直腸癌、膀胱癌[12]。從結(jié)果中得出CD68+巨噬細胞具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用，所以猜測：可能當(dāng)CD163+細胞染色數(shù)量大于CD68+細胞染色數(shù)量時，由于CD163+陽性細胞分泌的促腫瘤的因子多于CD68+陽性細胞產(chǎn)生的抗腫瘤的因子，所以能促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

本試驗通過檢測OSCC中CD68+、CD163+的表達，標記了TAMs、M2型巨噬細胞在OSCC中的浸潤數(shù)量與分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，證實了TAMs和M2型巨噬細胞在OSCC的腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞和其他細胞之間相互作用較復(fù)雜，對于TAMs和M2型巨噬細胞在OSCC中的具體作用及相關(guān)機制仍有待深入研究。

[1]馮紅超,宋宇峰,魏宏琳,等.巨噬細胞移動抑制因子和基質(zhì)金屬蛋白酶2在口腔癌生長和轉(zhuǎn)移中的作用[J].現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志,2009,23(2):135-137.

[2]Coffelt SB,Lewis CE,Naldini L,et al.Elusive identities and overlapping phenotypes of proangiogenic myeloid cells in tumors[J].Am J Pathol，2010，176(4):1564-1576.

[3]Klimp AH,de Vries EG,Scherphof GL,et al.A potential role of macrophage activation in the treatment of cancer[J].Crit Rev Oncol Hematol,2002,44(3):143-161.

[4]Kurahara H,Shinchi H,Mataki Y,et al.Significance of M2-polarized tumor-associated macrophage in pancreatic cancer[J].J Surg Res,2011,167(2):e211-219.

[5]Mantovani A，Sica A.Macrophages，innate immunity and cancer:balance，tolerance，and diversity[J].Curr Opin Immunol,2010,22(2):231-237.

[6]Sica A,Lm′ghi P,Mancino A,et al.Macrophage polarization in tumour progression.Seminars in cancer biology[J].Academic Press,2008,18(5):349-355.

[7]Lu CF,Huang CS,Tjiu JW,et al. Infiltrating macrophage count. A significant predictor for the progression and prognosis of oral squamous cell carcinomas in Taiwan[J].Head Neck,2010，32:18-25.

[8]馮紅超,彭江帆,馬洪,等.單核/巨噬細胞在缺氧微環(huán)境下對Tca8113舌鱗癌細胞系殺傷作用的實驗研究[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報,2009,25(6):842-844.

[9]Mantovani A，Sica A．Macrophages，innate immunity and cancer： balance，tolerance，and diversity[J]． Curr Opin Immunol,2010,22(2):231-237.

[10]Epelman S,Lavine KJ,Gwendalyn J.Randolph， Origin and Functions of Tissue Macrophages[J]. Immunity，2014，41(1):21-35.

[11]Klimp AH，de Vries EG，Scherphof GL，et al．A potential role of macrophage activation in the treatment of cancer[J]．Crit Rev Oneol Hematol，2002，44(2)：143-161．

[12]Maniecki MB,Etzerodt A,Ulhoi BP,et al.Tumor-promoting macrophages induce the expression of the macrophage-specific receptor CD163 in malignant cells[J].Int J Cancer,2012,131(10):2320-2331.

Infiltration and effect of CD68+and CD163+macrophages in oral squamous cell carcinoma*

LiShumei1,FengHongchao2△,MaZhujun2,WeiJing2

(1.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China; 2.DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,GuiyangMunicipalStomatologicalHospital,Guiyang,Guizhou550001,China)

Objective To investigate the correlation between the number of CD68+and CD163+macrophages infiltration and the clinical characteristics of oral squamous cell carcinoma (OSCC),and to investigate the role and significance of CD163+and CD68+macrophages in OSCC.Methods Forty-two cases of OSCC resected by operation and diagnosed by postoperative pathology with intact clinical data in our hospitals during 2013-2016 were selected.Other 12 cases of oral mamaxillofacial normal tissue served as controls.The number of CD68+and CD163+macrophages infiltration in OSCC was detected by immunohistochemistry.Its correlation with clinical characteristics was analyzed.Results The number of CD68+and CD163+macrophages infiltration in OSCC was significantly higher than that in the control group (P<0.05);the infiltration quantity of CD68+and CD163+macrophages in poor differentiation and moderate differentiation was significantly higher than that in high differentiation(P<0.05).The number of CD68+macrophages in lymph node metastasis was significantly lower than that without lymph node metastasis (P<0.05).The number of CD163+macrophages in the lymph node metastasis was significantly higher than that of CD68+(P<0.05).The number of CD68+and CD163+macrophages had positive correlation in OSCC (r=0.48,P=0.00).Conclusion Tumor-associated macrophages (TAMs) and M2 macrophages may play an important role in OSCC,TAMs may inhibits lymph node metastasis in OSCC,while M2 marcophages may promote the lymphatic matastasis of OSCC.

mouth;carcinoma,squamous cell;CD68;CD163;macrophages;immunohistochemistry

??·臨床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.20.009

貴陽市衛(wèi)生局科學(xué)技術(shù)計劃項目([2014]筑衛(wèi)科技合同字第15號)。 作者簡介：李舒眉(1990-)，住院醫(yī)師，在讀碩士，主要從事口腔頜面外科工作?！?/p>

，E-mail:hongchaof@126.com。

R780.2

A

1671-8348(2017)20-2764-03

2017-01-13

2017-03-17)