楊旭堃,申 芹，杜 宇△

(1.四川大學華西第四醫(yī)院重癥監(jiān)護室，成都 610041；2.中航工業(yè)363醫(yī)院放療科，成都 610041)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯對腸缺血再灌注損傷的保護作用研究

楊旭堃1,申 芹2，杜 宇1△

(1.四川大學華西第四醫(yī)院重癥監(jiān)護室，成都 610041；2.中航工業(yè)363醫(yī)院放療科，成都 610041)

目的 探討表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對大鼠腸缺血再灌注損傷的影響及其作用機制。方法 40只SD 大鼠均分為4組：假手術組(Sham組)、腸道缺血再灌注損傷組(IRI組)、EGCG預處理組(EGCG組)和Wnt激動劑HLY78組(Wnt-Ag組)。IRI、EGCG和Wnt-Ag組無損傷血管夾夾閉腸系膜上動脈(SMA)45 min構建腸缺血再灌注損傷模型,Sham組只做假手術處理。EGCG組在缺血前45 min腹腔注射EGCG(50 mg/kg)，Wnt-Ag組在缺血前45 min腹腔注射EGCG(50 mg/kg)+Wnt-Ag(5 mg/kg)，Sham組和IRI組腹腔注射等量生理鹽水。再灌注4 h后HE染色觀察腸組織病理形態(tài)；免疫組織化學檢測細胞凋亡；RT-PCR和ELISA檢測腸道和血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素1(IL-1)表達，Western blot法檢測腸組織Wnt、β-catenin、p53、Bax和BCL-2表達。結果 與Sham組相比，IRI組IL-6、IL-1、TNF-α、Wnt、β-catenin、p53、Bax、細胞凋亡和腸道病理改變明顯增加，而BCL-2表達明顯減少。與IRI組相比，EGCG組IL-6、IL-1、TNF-α、Wnt、β-catenin、p53、Bax、細胞凋亡和腸道病理改變明顯減少，而BCL-2表達明顯增加。與EGCG組相比，Wnt-Ag組IL-6、IL-1、TNF-α、Wnt、β-catenin、p53、Bax、細胞凋亡和腸道病理改變明顯增加，而BCL-2表達明顯減少。結論 EGCG可通過抑制炎癥和凋亡而減輕腸缺血再灌注損傷，這種保護作用可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號途徑介導。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯;腸缺血再灌注損傷;Wnt/β-catenin/p53

腸缺血再灌注損傷是指腸道供血中斷后,重新恢復腸道血供導致腸道損傷進一步加重的臨床危相,好發(fā)于絞榨性腸道梗阻、休克、壞死性腸炎、心臟體外大循環(huán)及腸移植手術等,是導致腸道功能障礙的重要原因,其發(fā)病率和致死率都較高。因此減輕腸缺血再灌注損傷具有重要的臨床現實意義[1-3]。腸缺血再灌注損傷的發(fā)病機制復雜,目前尚未完全闡清,既往研究提示腸缺血再灌注損傷的發(fā)病機制包括炎癥、凋亡、壞死、自噬等，其中凋亡和炎癥在其中扮演至關重要的角色[1-3]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG),俗稱茶多酚,是綠茶的主要提取物,既往研究發(fā)現其具有抗凋亡、抗炎、抗腫瘤等生物學活性[4-5]。有研究發(fā)現，其對肝、心臟、腎等一些重要器官缺血再灌注損傷具有保護作用[4-5]。本實驗采用大鼠腸缺血再灌注損傷模型，觀察EGCG對腸缺血再灌注損傷的保護作用，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠40只,體質量(220±20)g,合格證號SCXK(京)2011-20139,由武漢大學實驗動物中心提供。

1.2 試劑與儀器 白細胞介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1(IL-1)ELISA檢測盒(Ebioscience,美國),EGCG(Sigma,美國)經HPLC鑒定純度超過99%,HLY78(Sigma,美國)，水合氯醛(武漢谷歌),Wnt、β-catenin、Bax、BCL-2(CST,美國),β-actin (Abgent,美國),Tunel試劑盒(南京凱基)，TRIzol reagent (Invitrogen,美國),逆轉錄試劑盒(GeneCopoeia,美國),SYBR green(Takara,日本),RT-PCR引物(擎科生物技術有限公司)。HE染色試劑和顯微鏡(Olympus BX51)及成像系統(tǒng)(HITMAS-30)均由華西醫(yī)院病理科實驗室臨床病理組提供。

1.3 方法

1.3.1 分組及建模 SD大鼠放置在SPF動物飼養(yǎng)室內喂養(yǎng)。適應性喂養(yǎng)1周后,狀態(tài)良好,分為假手術組(Sham組)、腸缺血再灌注損傷組(IRI組)、EGCG預處理組(EGCG組)和Wnt激動劑HLY78組(Wnt-Ag組),每組10只。劑量參考文獻[4-5]，EGCG組在缺血前45 min腹腔注射EGCG (50 mg/kg)，Wnt-Ag組在缺血前 45 min腹腔注射EGCG (50 mg/kg)+Wnt-Ag (5 mg/kg)，Sham組和IRI組腹腔注射等量生理鹽水。具體手術方式如下:大鼠在腹腔注射10%水合氯醛(4 mL/kg)麻醉狀態(tài)下,行腹部正中切口,鈍性分離腸系膜上動脈(SMA)根部,用微血管夾夾閉SMA根部,完全阻斷血流45 min后松開血管夾,恢復腸道血流形成再灌注?？p合腹部,再灌注4 h后處死大鼠,收集標本。Sham組操作同上,但開腹后不夾閉SMA[6]。

1.3.2 腸道組織學檢查 小腸組織切片經10%中性甲醛固定、石蠟包埋,HE染色之后,在光鏡下觀察小腸組織病理學變化。小腸損傷程度用積分法評估[6]：0分為正常絨毛和腺體;1分為部分絨毛頂部上皮輕度受損;2分為上皮下腺體輕度受損;3分為上皮下間隙擴大,毛細血管充血;4分為上皮與固有層中度分離,腺體受損;5分為部分絨毛頂部脫落;6分為絨毛脫落明顯,毛細血管擴張;7分為固有層絨毛脫落,腺體受損明顯;8分為固有層開始消化分解;9分為出血、潰瘍。

1.3.3 細胞凋亡的檢測 利用Tunel凋亡試劑盒檢測腸組織細胞凋亡，凋亡細胞(陽性細胞)為細胞核染成棕黃色，非凋亡細胞(陰性細胞)胞核為藍色，具體方法參考說明書。

1.3.4 RT-PCR和ELISA檢測 稱取適量腸組織,置入1.5 mL EP管中,利用 TRIzol 法提取總RNA,紫外分光光度計測定RNA含量。采用 TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒,將mRNA反轉錄成cDNA。取反轉錄產物采用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行實時定量 PCR 反應。PCR 以β-actin為內參,具體方法參考文獻[6]。TNF-α：上游引物5′-GCC TCG TCT CAT AGA CAA GAT GGT-3′,下游引物5′-GAA GGC AGC CCT GGT AAC C-3′;IL-1：上游引物5′-TCT CGC CCA GGG AGT GCA AAG AGA G-3′,下游引物5′-TCT CGC CCA GGG AAC ATC TCG AAG CG-3′；IL-6：上游引物5′-CTG CAA GAG ACT TCC ATC CAG-3′,下游引物5′-AGT GGT ATA GAC AGG TCT GTT GG-3′;β-actin：上游引物5′-AGA GGG AAA TCG TGC GTG AC-3′,下游引物5′-CAA TAG TGA TGA CCT GGC CGT-3′。SYBR實時定量PCR法檢測TNF-α、IL-6和IL-1 mRNA相對表達基于比較CT(threshold cycle)值法,每個樣本的mRNA水平用各內參β-actin含量進行標準化,用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCT計算相對表達量。取各組血清按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測血清中IL-6、TNF-α和IL-1表達水平。

1.3.5 Western blot檢測蛋白表達 取腸組織按照每50 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液(以1∶50加入50×cocktail),冰上勻漿,裂解30 min后,4 ℃ 12 000 r/min離心30 min后取上清,BCA法測定蛋白濃度。以含50 μg蛋白質的上樣量,經十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(5 %濃縮膠,10 %分離膠,恒壓80～100 V)后轉膜(PVDF膜,恒流300 mA),然后洗膜,以5%脫脂奶粉(TBST配制)封閉1 h,Wnt(1∶1 000)、 β-catenin(1∶1 000)、p53(1∶1 000)、Bax(1∶500)、BCL-2(1∶1 000)、β-actin(1∶3 000)單抗孵育過夜,再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP(二抗)37 ℃孵育1 h。洗膜后加ECL試劑,Kodak化學發(fā)光儀曝光顯示目的蛋白,并拍照。以Quantity one對條帶進行定量分析,以目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值作為結果。

2 結 果

2.1 各組病理學變化 與Sham組相比,IRI組小腸黏膜上皮下間隙擴大,腺體受損及毛細血管充血、水腫,腸道組織有大量絨毛脫落、糜爛、炎性細胞浸潤、腸道組織結構破壞明顯增加(P<0.05),其損傷評分為(6.0±1.0)分，而Sham組損傷評分為(0.5±0.2)分。與IRI組相比,EGCG組腸道病理改變明顯減少(P<0.05),其損傷評分為(3.5±0.5)分。與EGCG組相比，Wnt-Ag組腸道病理改變明顯增加(P<0.05),其損傷評分為(5.5±0.5)分。見圖1。

A:Sham組；B：IRI組；C：EGCG組；D：Wnt-Ag組

圖1 各組腸組織病理學變化(×200)

A:Sham組；B：IRI組；C：EGCG組；D：Wnt-Ag組

圖2 各組腸道細胞凋亡情況(×200)

*：P<0.01，與Sham組比較;#：P<0.05，與IRI組比較；△：P<0.05，與EGCG組比較

2.2 各組腸道細胞凋亡情況 與Sham組相比,IRI組的凋亡細胞明顯增加(P<0.05)；與IRI組相比,EGCG組的凋亡細胞明顯減少(P<0.05)；與EGCG組相比,Wnt-Ag組的凋亡細胞明顯增加(P<0.05)。見圖2。

2.3 各組TNF-α、IL-6和 IL-1 的表達比較 與Sham組相比,EGCG組IL-6、IL-1 和TNF-α表達明顯增加(P<0.05)；EGCG組與IRI組、Wnt-Ag組相比明顯減少(P<0.05)。見表1。

2.4 各組Bax、BCL-2蛋白表達情況 與Sham組相比,EGCG組促凋亡蛋白Bax表達明顯增加(P<0.05),而抗凋亡蛋白BCL-2明顯減少(P<0.05)。與IRI組相比,EGCG組促凋亡蛋白Bax表達明顯減少(P<0.05),而抗凋亡蛋白BCL-2明顯增加(P<0.05)。Wnt-Ag組與EGCG組相比,促凋亡蛋白Bax表達明顯增加(P<0.05),而抗凋亡蛋白BCL-2明顯減少 (P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 各組Bax、BCL-2蛋白表達情況

2.5 各組Wnt、β-catenin和p53蛋白表達情況 與Sham組相比,IRI組Wnt、β-catenin和p53蛋白表達明顯增加(P<0.05)；EGCG組與IRI組相比Wnt、β-catenin和p53蛋白表達明顯減少 (P<0.05)；Wnt-Ag 組與EGCG組相比,Wnt、β-catenin和p53蛋白表達明顯增加 (P<0.05)。見圖4、表3。

表2 EGCG對Bax、BCL-2蛋白表達影響

*：P<0.05，與Sham組比較;#：P<0.05，與IRI組比較；△：P<0.05，與Wnt-Ag組比較

圖4 各組Wnt、β-catenin和p53蛋白表達情況

組別Wnt/β-actinβ-catenin/β-actinp53/β-actinSham組0.17±0.030.05±0.020.04±0.02IRI組0.47±0.08*0.18±0.03*0.22±0.03*

續(xù)表3 EGCG對Wnt、β-catenin和p53蛋白表達影響

*：P<0.05，與Sham組比較;#：P<0.05，與IRI組比較；△：P<0.05，與Wnt-Ag組比較

3 討 論

腸道缺血再灌注損傷誘發(fā)腸道缺血缺氧、炎癥反應及腸壁通透性改變，不僅導致腸道局部受損，還引發(fā)腸道黏膜屏障廣泛破壞，致使腸道內細菌廣泛移位、進而引起炎性細胞因子和炎癥介質廣泛釋放，并廣泛激活機體程序性細胞凋亡，故而引發(fā)腸道功能嚴重受損傷，以及缺血再灌注損傷患者預后不佳的重要原因[7-10]。此外，大量研究表明抑制炎癥和凋亡是減輕缺血再灌注損傷的有效治療途徑。TNF-α是誘發(fā)炎性反應的始動因子，是炎癥反應早期損傷內皮細胞的重要原因[2-3]。IL-6、IL-1是繼發(fā)性于內皮細胞受損后產生的炎癥因子，可損傷腸道黏膜和組織細胞，導致腸道功能受損[1-3]。Bax是促凋亡蛋白，其與Tunel表達水平的變化可反映體內凋亡的程度。BCL-2是機體主要的抗凋亡蛋白，可抑制腸道黏膜細胞廣泛死亡，發(fā)揮抗凋亡的功效，其表達量可反映機體抗凋亡的能力。既往研究顯示，EGCG具有抗炎和抗凋亡的活性，可減少膿毒血癥誘發(fā)的全身炎癥因子的表達。TNF-α是腸道缺血再灌注損傷預后不佳的重要原因，但具體機制尚不清[4-5]，而EGCG能減少TNF-α在缺血再灌注損傷大鼠的表達水平，抑制缺血再灌注損傷相關的炎癥反應[4-5]。本實驗通過檢測大鼠細胞凋亡,Bax、BCL-2、IL-6、IL-1和TNF-α的表達及腸道黏膜形態(tài)改變來評估缺血再灌注損傷后凋亡、炎癥及腸道損傷程度。結果顯示，與Sham組相比，IRI組細胞凋亡、IL-6、IL-1、TNF-α、Bax表達水平及腸道損傷明顯增加，而BCL-2表達明顯減少，這與既往研究提示缺血再灌注損傷導致的腸道黏膜損傷與凋亡和炎性反應相關相一致。而EGCG組與IRI組相比，細胞凋亡、IL-6、IL-1、TNF-α、Bax表達水平及腸道損傷明顯減少，而BCL-2表達增加。提示EGCG可通過抗凋亡和抗炎減輕缺血再灌注損傷。而EGCG抑制凋亡和炎癥的具體機制尚不清。

Wnt/β-catenin信號通路是體內重要的促炎/凋亡信號途徑之一[11-12]。既往研究顯示，腸道缺血再灌注損傷時可激活Wnt/β-catenin信號通路，

作用于下游的如p53靶點，導致BCL-2/Bax表達下調和TNF-α表達上調，從而導致腸道嚴重受損[11-12]。EGCG組能抑制Wnt/β-catenin信號通路激活，下調p53、Bax和細胞凋亡表達，但上調BCL-2表達，從而減輕腸道缺血再灌注損傷。為了進一步證實，EGCG對腸道缺血再灌注損傷的保護作用與抑制Wnt/β-catenin信號通路相關。本實驗選用Wnt特異性激動劑HLY78，進一步觀察EGCG對缺血再灌注損傷的保護作用與Wnt/β-catenin信號通路的關聯(lián)。結果顯示HLY78可逆轉EGCG抑制凋亡和炎癥因子釋放的作用。由此推斷，EGCG可通過抑制Wnt/β-catenin/p53信號途徑而減輕腸道缺血再灌注損傷。

綜上所述，EGCG預處理可通過抑制凋亡和炎癥因子的釋放而保護腸道缺血再灌注損傷，這種保護作用部分是通過抑制Wnt/β-catenin/p53信號途徑，具體的機制尚需繼續(xù)深入研究。

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Protective effect of epigallocatechin-3-gallate on intestine ischemia reperfusion injury

YangXukun1,ShenQing2,DuYu1△

(1.DepartmentofICU,WestChinaFourthHospital,SichuanUniversity,Chengdu,Sichuan610041,China;2.DepartmentofRadiology,363HospitalofChinaAviationIndustry,Chengdu,Sichuan610041,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of epigallocatechin-3-gallate(EGCG) on intestine ischemia reperfusion injury(IRI) in rats． Methods Forty SD rats were randomly and equally divided into 4 groups：sham group(Sham),intestinal ischemia reperfusion injury group(IRI),EGCG pretreatment group(EGCG) and HLY78 group (Wnt-Ag )．The IRI,EGCG and WNT-AG groups were performed the superior mesenteric artery(SMA) ligation for 45 min by non-injury vascular clamp to construct the IRI model.EGCG (50 mg/kg) was administrated by intraperitoneal injection at 45 min before ischemia in EGCG group．The Wnt-Ag group was administrated by intraperitoneal injection of EGCG(50 mg/kg) plus Wnt-Ag (5 mg/kg) at 45 min before ischemia.The IRI group and Sham group were administrated by same dosage of normal saline.The pathological morphology of intestinal tissue was observed by staining at 4 h after reperfusion.The cellular apoptosis was detected by immunohistochemistry.The expressions of tumor necrosis factor-α(TNF-α),interleukin- 1(IL-1),interleukin- 6(IL-6) in the serum and intestinal tract were examined by ELISA and RT-PCR.The expressions of Wnt,β-catenin,p53,Bax and BCL-2 were measured by Western blot.Results Compared with the Sham group,the expression of IL-6,IL-1,TNF-α,Wnt,β-catenin,Bax,cell apoptosis and pathological change of intestinal tract in the IRI group were significantly increased,while the expression of BCL-2 was significantly decreased.Compared with the IRI group,the expression of IL-6,IL-1,TNF-α,Wnt,β-catenin,p53,Bax,cell apoptosis and the pathological change of intestinal tracrt in the EGCG group were significantly decreased,while the expression of BCL-2 was significantly increased.Compared with the EGCG group,the expression of IL-6,IL-1,TNF-α,Wnt,β-catenin,Bax,cell apoptosis and pathological change of intestinal tract in the Wnt-Ag group were increased,while the expression of BCL-2 was significantly decreased.Conclusion EGCG can alleviate intestine ischemia-reperfusion injury by suppressing inflammation and apoptosis,this protective effect may be mediated by suppressing Wnt/β-catenin signal pathway.

EGCG;intestine ischemia-reperfusion injury;Wnt/β-catenin/p53

楊旭堃(1986-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事重癥醫(yī)學研究?！?/p>

，E-mail:4717154@qq.com。

??·基礎研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.20.005

R574

A

1671-8348(2017)20-2751-04

2017-02-07

2017-04-12)