張 驍，張紅明，劉大男▲，李曉燕

(1．貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴陽 550004；2.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院，濟(jì)南 250031)

二甲雙胍對(duì)飽和脂肪酸誘導(dǎo)的大鼠H9C2型心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究*

張 驍1，張紅明2△，劉大男1▲，李曉燕2

(1．貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，貴陽 550004；2.濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院，濟(jì)南 250031)

目的 探討二甲雙胍(Met)對(duì)飽和脂肪酸所誘導(dǎo)的大鼠H9C2型心肌細(xì)胞損傷作用的保護(hù)機(jī)制。方法 在對(duì)照、棕櫚酸(PA)及3種不同濃度梯度Met與PA聯(lián)合組培養(yǎng)液中培養(yǎng)大鼠H9C2型心肌細(xì)胞株24 h。采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測定各組細(xì)胞核因子κB(NF-κB)p65、細(xì)胞間黏附因子(ICAM1)、磷酸化核因子κB抑制蛋白(p-IκBα)及磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)的蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定各組細(xì)胞NF-κB、單核細(xì)胞趨化因子(CCL2)和ICAM1的mRNA表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，PA組的細(xì)胞中NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)；與PA組相比，Met+PA聯(lián)合組細(xì)胞NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα的蛋白表達(dá)量隨Met濃度梯度增加表現(xiàn)為不同程度遞減(P<0.05)，p-AMPK蛋白表達(dá)量隨Met濃度增加而顯著增加(P<0.05)。與對(duì)照組相比，PA組CCL2、ICAM1的mRNA表達(dá)量增加(P<0.05)；與PA組相比，Met+PA聯(lián)合組細(xì)胞CCL2和ICAM1的mRNA表達(dá)量下降(P<0.05)。結(jié)論 Met可以減輕由飽和脂肪酸誘導(dǎo)細(xì)胞黏附因子和趨化因子表達(dá)增加而引起的大鼠H9C2型心肌細(xì)胞損傷。

二甲雙胍；NF-κB；趨化因子；腺苷酸活化蛋白激酶

飽和脂肪酸攝入過多是導(dǎo)致臨床上血脂異常癥的主要原因，可以增加動(dòng)脈粥樣硬化和心血管事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。棕櫚酸(palmitic acid，PA)作為飽和脂肪酸的一種可導(dǎo)致心肌細(xì)胞的損傷凋亡[1]。核因子κB(nuclear factor of κB，NF-κB)是一種廣泛存在于各種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可以調(diào)控多種靶基因包括細(xì)胞間黏附因子(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM1)、單核細(xì)胞趨化因子[chemokine (C-C motif) ligand 2，CCL2]及多種免疫相關(guān)受體等，對(duì)于機(jī)體的炎癥反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡起主導(dǎo)作用[2]。近年來研究表明，二甲雙胍(metformin，Met)作為臨床上常用的治療2型糖尿病的一線藥物，能夠?qū)p傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞起到一定程度保護(hù)作用[3-5]。對(duì)于這種保護(hù)作用的機(jī)制，過去有研究證實(shí)，可能是通過激活腺苷激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)的途徑而實(shí)現(xiàn)的[6]。本實(shí)驗(yàn)探討Met是否對(duì)飽和脂肪酸誘導(dǎo)損傷的心肌細(xì)胞起到同樣的保護(hù)作用，并對(duì)藥物的作用機(jī)制做進(jìn)一步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 大鼠H9C2心肌細(xì)胞株(齊氏生物科技有限公司)，Met、PA(Sigma公司)，進(jìn)口胎牛血清、青霉素、鏈霉素(Gibco公司)，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(HyClone公司)，NF-κB p65抗體、ICAM1抗體(Abcam公司)，磷酸化核因子κB抑制蛋白(p-IκBα)抗體、p-AMPK抗體(Santa公司)，RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光PCR試劑盒(TaKaRa公司)，引物由上海博尚生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 采用H9C2型大鼠心肌細(xì)胞株在含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2下培養(yǎng)，每2天換液，0.25%胰酶-EDTA消化傳代。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度接種至6孔板，37 ℃、5%CO2孵育2 h。每兩個(gè)孔為一組進(jìn)行編號(hào)，一共5組，依次分為對(duì)照組、PA組(300 μmol/L)、低濃度Met(1 mmol/L)+PA(300 μmol/L)聯(lián)合組、中濃度Met(2 mmol/L)+PA(300 μmol/L)聯(lián)合組、高濃度Met(4 mmol/L)+PA(300 μmol/L)聯(lián)合組，在無血清的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至24 h。

1.2.2 藥物刺激的配制 83 mg Met溶于1 000 μL三蒸水過濾制成500 mmol/L的母液，-20 ℃保存。0.025 6 g PA溶于1 mL無水乙醇，60 ℃水浴完全溶解后加入20 μL 10 mol/L NaOH，顛倒混勻溶于不含飽和脂肪酸的牛血清清蛋白(bovine serum albumin,BSA)溶液，振蕩混勻過濾制成10 mol/L PA母液，4 ℃存放。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)測定NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα和p-AMPK的蛋白表達(dá) 各組H9C2心肌細(xì)胞樣本分別取160 μg總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉2 h后，依分子量分別與兔抗大鼠NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα和p-AMPK抗體混合后4 ℃過夜。TBST洗滌3次后，與山羊抗兔IgG室溫下孵育2 h，加入ECL顯色底物，凝膠成像分析儀上成像。設(shè)β-actin為內(nèi)參，用ImageJ軟件測定NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα和p-AMPK的灰度值并與內(nèi)參進(jìn)行比較。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定NF-κB、ICAM1及CCL2的mRNA表達(dá) 在NCBI Gen Bank數(shù)據(jù)庫中查詢NF-κB、ICAM1、CCL2，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。NF-κB：上游引物為5′-AAC AGA GAG GAT TTC GTT TCC G-3′，下游引物為5′-TTT GAC CTG AGG GTA AGA CTT CT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度190 bp；ICAM1：上游引物為5′-ATG CCC AGA CAT CTG TGT CC-3′，下游引物為5′-GGG GTC TCT ATG CCC AAC AA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度104 bp；CCL2：上游引物為5′-CAG CCA GAT GCA ATC AAT GCC-3′，下游引物為5′-TGG AAT CCT GAA CCC ACT TCT-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長度112 bp。按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(20 μL體系)逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的片段，于LightCycler PCR儀上進(jìn)行定量檢測，在加樣操作過程中注意避光，各反應(yīng)液配置在冰上進(jìn)行。反應(yīng)條件：預(yù)變性，95 ℃ 30 s；PCR反應(yīng)，95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，隨后進(jìn)行溶解曲線分析。結(jié)合擴(kuò)增曲線及溶解曲線分析，將符合要求的樣本基因定量PCR原始數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值，經(jīng)β-actin校正，用Light Cycler 4.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠H9C2心肌細(xì)胞生長特點(diǎn) 使用倒置相差顯微鏡(Olympus公司)觀察，H9C2細(xì)胞貼壁生長，單個(gè)細(xì)胞形態(tài)以現(xiàn)梭型、三角形為主，細(xì)胞質(zhì)為透明、細(xì)胞核圓形。見圖1。

A:×40；B：×200

圖1 大鼠H9C2細(xì)胞

2.2 各組細(xì)胞NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα和p-AMPK的蛋白表達(dá)水平 PA組細(xì)胞的NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與PA組相比，Met+PA聯(lián)合組細(xì)胞的NF-κB p65、p-IκBα蛋白表達(dá)量隨Met濃度增加而明顯遞減(P<0.05)，Met+PA聯(lián)合組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ICAM1蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.05)，其中中濃度Met+PA聯(lián)合組細(xì)胞的ICAM1蛋白表達(dá)量最低(P<0.05)。隨著Met濃度梯度的增加，Met+PA聯(lián)合組細(xì)胞的p-AMPK蛋白表達(dá)量與對(duì)照組和PA組相比顯著增高(P<0.05)，其中中濃度Met+PA聯(lián)合組細(xì)胞的p-AMPK蛋白表達(dá)量最高(P<0.05)。見圖2、3。

*:P<0.05，與對(duì)照組相比；#:P<0.05，與PA組相比

圖2 各組NF-κB p65和ICAM1的蛋白表達(dá)

*：P<0.05，與對(duì)照組相比；#：P<0.05，與PA組相比

圖3 各組p-IκBα和p-AMPK的蛋白表達(dá)

2.3 各組細(xì)胞NFκB、CCL2和ICAM1的mRNA表達(dá)水平 與對(duì)照組比較,PA組NF-κB的mRNA表達(dá)量有所增加但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，CCL2和ICAM1的mRNA表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。與PA組相比，不同濃度的Met+PA聯(lián)合組細(xì)胞NF-κB的mRNA表達(dá)量逐漸減少但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Met+PA聯(lián)合組細(xì)胞CCL2和ICAM1的mRNA表達(dá)量隨Met濃度增加而減少(P<0.05)，Met+PA聯(lián)合組組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

*：P>0.05，與對(duì)照組相比；#：P>0.05，與PA組相比；a：P<0.05，與對(duì)照組相比；b：P<0.05，與 PA組相比

圖4 各組細(xì)胞的NF-κB、CCL2和ICAM1的mRNA表達(dá)

3 討 論

高濃度飽和脂肪酸環(huán)境下的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷與脂質(zhì)形成是動(dòng)脈粥樣硬化形成的始動(dòng)因素，長時(shí)間受這種高危因素影響還能夠引起心肌細(xì)胞的大量損傷凋亡[7]，嚴(yán)重危害了人類的健康。Met作為一款常用的降糖藥物在近年來國內(nèi)外的前沿研究中有了很多新的發(fā)現(xiàn)，除了已熟知的抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用之外，還發(fā)現(xiàn)它對(duì)脊髓損傷的神經(jīng)細(xì)胞抗炎抗凋亡的作用及降低前列腺癌的發(fā)病率的作用等[8-9]。更有報(bào)道認(rèn)為，Met是一種個(gè)體在感染源環(huán)境中的潛在心肌保護(hù)劑[10]。

本研究以大鼠H9C2型心肌細(xì)胞為基礎(chǔ)，通過高濃度飽和脂肪酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡損傷，驗(yàn)證Met對(duì)上述受損心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。有研究證明，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成與細(xì)胞黏附因子和趨化因子的增多有著至關(guān)重要的關(guān)系[11]。Yan等[12]發(fā)現(xiàn)，高濃度軟脂酸誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞時(shí)，可使核因子κB抑制蛋白(inhibitor of nuclear factor κB，IκB)磷酸化增加，使其對(duì)NF-κB的抑制作用減弱。在本實(shí)驗(yàn)中，PA能夠引起細(xì)胞NF-κB、p-IκBα、ICAM1的蛋白表達(dá)明顯升高，也可以誘導(dǎo)CCL2和ICAM1的mRNA表達(dá)量上調(diào)，這說明高濃度飽和脂肪酸一方面可以通過增加細(xì)胞黏附因子和趨化因子的表達(dá)促進(jìn)粥樣斑塊的形成，造成心腦血管疾病的發(fā)生，另一方面可以使IκB蛋白磷酸化從而降低其對(duì)NF-κB的抑制作用，使細(xì)胞內(nèi)NF-κB表達(dá)增多啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，引起細(xì)胞的凋亡與損傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在同等濃度PA條件的細(xì)胞組中，Met能夠顯著降低細(xì)胞NF-κB p65、ICAM1、p-IκBα的蛋白表達(dá)和CCL2、ICAM1的mRNA表達(dá)，且表達(dá)程度隨Met濃度梯度增加而下降，這表明Met能夠減輕PA誘導(dǎo)的H9C2型心肌細(xì)胞損傷，并且對(duì)受損細(xì)胞的保護(hù)作用在一定范圍內(nèi)隨Met濃度的增加而增強(qiáng)。另外，本實(shí)驗(yàn)對(duì)藥物的作用機(jī)制進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Met能夠顯著增強(qiáng)受損細(xì)胞p-AMPK的蛋白表達(dá)，與Met濃度增加呈正相關(guān)。這也證實(shí)了飽和脂肪酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷可以通過AMPK通路的激活而減輕[6]，繼而增加脂肪酸氧化分解，減少由NF-κB介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡，使細(xì)胞黏附因子和趨化因子表達(dá)降低。

綜上所述，激活A(yù)MPK通路很可能是Met對(duì)飽和脂肪酸誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷保護(hù)作用的機(jī)制，深入探討其機(jī)制，有助于證實(shí)Met在高脂肪酸血癥時(shí)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，對(duì)臨床上血脂異常癥患者降低心血管事件的發(fā)生率及受損心肌組織的恢復(fù)提供了新的思路。

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Protective effect of metformin on H9C2 rat myocardial cell damage induced by saturated fatty acid*

ZhangXiao1，ZhangHongming2△,LiuDanan1▲,LiXiaoyan2

(1.DepartmentofCardiology,AffiliatedHospital,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang,Guizhou550004,China;2.GeneralHospitalofJinanMilitaryRegion,Jinan,Shandong250031,China)

Objective To investigate the mechanisms of metformin (Met) for protecting H9C2 myocardial cells damage induced by saturated fatty acids (palmitic acid,PA) in rats.Methods Rat H9C2 myocardial cell lines in blank control group,PA group and three different concentrations of metformin and PA combination groups were cultured for 24 h.Then Western blot was adopted to detect the protein expression of nuclear factor κB p65 (NFκB p65),intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM1),phosphorylated inhibitor of nuclear factor κB (p-IκBα) and phosphorylated adenosine monophosphate activated protein kinase(p-AMPK);the quantitative real-time PCR(qRT-PCR) was used to detect the mRNA expression of nuclear factor of nuclear factor κB(NFκB),chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2) andintercellular cell adhesion molecule-1(ICAM1).Results Compared with the control groups,the protein expression of NFκB p65,p-IκBα and ICAM1 in the PA group was increased (P<0.05);compared with the PA group,the protein expression of NFκB p65,IκBα and ICAM1 in the Met+PA combination groups was decreased in various degrees with the Met concentration increase (allP<0.05),while the protein expression of p-AMPK was significantly risen with the Met concentration increase (allP<0.05).Compared with the control group,the mRNA expression of CCL2 and ICAM1 in the PA group was increased (P<0.05);compared with the PA group,the mRNA expression of CCL2 and ICAM1 in the Met+PA combination groups was decreased (P<0.05).Conclusion Met can alleviate H9C2 myocardial cellular damage caused by saturated fatty acid inducing increase of CCL2 and ICAM1 expression.

metformin;NF-Kappa B;chemokine;adenosine activated protein kinase

全軍后勤科研重大項(xiàng)目(AWS13C008)。 作者簡介:張驍(1990-)，碩士，主要從事高血壓、高血脂機(jī)制的病理生理研究?！?/p>

，E-mail：13295416075@163.com?！ㄐ抛髡?，E-mail:liudanau2000@sina.com。

? 著·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.20.002

R542.2

A

1671-8348(2017)20-2741-03

2017-02-05

2017-04-10)