華彩麗，楊紅玉

（1.舞陽(yáng)縣畜牧局，河南舞陽(yáng)462400；2.南陽(yáng)農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院）

獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)診斷的發(fā)展歷程及診斷技術(shù)綜述

華彩麗1，楊紅玉2

（1.舞陽(yáng)縣畜牧局，河南舞陽(yáng)462400；2.南陽(yáng)農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院）

診斷是獸醫(yī)工作的首要任務(wù)之一，診斷一詞來(lái)自希臘文，是辨認(rèn)和判斷的意思。獸醫(yī)通過(guò)詢問(wèn)病史，了解病情，臨床檢查以及實(shí)驗(yàn)室檢查，來(lái)判斷動(dòng)物所患疾病。通過(guò)前期收集的各種資料和數(shù)據(jù)，進(jìn)行科學(xué)辨證的分析，以期得到盡可能符合疾病本質(zhì)的結(jié)論，這就是一個(gè)診斷疾病的過(guò)程。這個(gè)過(guò)程無(wú)論對(duì)獸醫(yī)還是對(duì)患病畜禽都是十分重要的。正確的早期診斷能使患病畜禽得到及時(shí)有效治療，早日恢復(fù)健康，反之，錯(cuò)誤的診斷會(huì)導(dǎo)致病情惡化，甚至危及生命。

1 獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)診斷的作用

在現(xiàn)代獸醫(yī)學(xué)中，實(shí)驗(yàn)室的檢查在診斷工作中起著重要作用，提供重要的客觀診斷依據(jù)。例如在進(jìn)行大腸桿菌病的診斷時(shí)，實(shí)驗(yàn)室的檢查既明確了疾病的病原，為進(jìn)一步的藥敏試驗(yàn)提供了依據(jù)，又為患病畜禽的治療提出明確的辦法。

實(shí)驗(yàn)室診斷在疾病預(yù)防中的作用尤為明顯。這是因?yàn)榧膊≡缙谕狈γ黠@癥狀和體征，很難引起注意，只有通過(guò)實(shí)驗(yàn)室檢查確診，才能得到及時(shí)的治療。正是由于實(shí)驗(yàn)室檢查在診斷工作中的重要性，才從診斷學(xué)中逐步獨(dú)立出一門(mén)新的學(xué)科——實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)或臨床實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)。

2 獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)診斷的發(fā)展歷程

隨著現(xiàn)代獸醫(yī)學(xué)的發(fā)展，獸醫(yī)開(kāi)始借助一些實(shí)驗(yàn)室檢查對(duì)患病畜禽進(jìn)行診斷。18世紀(jì)，主要儀器是顯微鏡，除血液檢查外還開(kāi)展了對(duì)尿、糞、痰的檢查，逐步形成了以血、尿、便三大常規(guī)為主要檢驗(yàn)項(xiàng)目的實(shí)驗(yàn)室。從19世紀(jì)末開(kāi)始，在用顯微鏡檢查各種染色涂片中細(xì)菌的同時(shí)，還發(fā)展了各種細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)，這就構(gòu)成現(xiàn)代獸醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室的雛形。

實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)是與多種專業(yè)學(xué)科相關(guān)的一門(mén)邊緣學(xué)科，也是應(yīng)用基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)的理論和技術(shù)為臨床獸醫(yī)學(xué)服務(wù)的學(xué)科。它的基本任務(wù)是通過(guò)生物、微生物、血清、化學(xué)、生物物理、細(xì)胞或其他檢驗(yàn)以獲取病原體、病理變化和臟器功能狀態(tài)等資料，與其他檢查相配合以確定患病畜禽的診斷。實(shí)際上不僅在疾病診斷上，患病畜禽治療也有很多地方需要實(shí)驗(yàn)室的配合，有時(shí)甚至起著至關(guān)重要的作用。同樣在判斷疾病預(yù)后，治療療效時(shí)，實(shí)驗(yàn)室檢查常是較好的客觀指標(biāo)。

3 獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)診斷的方法

實(shí)驗(yàn)室診斷是疫病確診的主要手段，同時(shí)也是流行病學(xué)監(jiān)測(cè)的重要方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室診斷可以發(fā)現(xiàn)傳染源、確定各種傳播因素和易感動(dòng)物，在疫病預(yù)防和撲滅過(guò)程中具有重要意義。常見(jiàn)的獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)診斷方法如下。

3.1 微生物學(xué)診斷

運(yùn)用獸醫(yī)微生物學(xué)的方法進(jìn)行病原學(xué)檢查是診斷動(dòng)物疫病的重要方法之一。

3.1.1 病料的采集

正確采集病料是微生物學(xué)診斷的首要環(huán)節(jié)。病料力求新鮮，最好能在畜禽瀕死時(shí)或死后數(shù)小時(shí)內(nèi)采取，要求盡量減少雜菌污染，用具器皿應(yīng)盡可能?chē)?yán)格消毒。通?？筛鶕?jù)所懷疑病的類(lèi)型和特性來(lái)決定采取哪些器官或組織。原則上要求采取病原微生物含量多、病變明顯的部位，同時(shí)易于采取，易于保存和運(yùn)送。如果缺乏臨床資料，剖檢時(shí)又難于分析診斷可能為何種病時(shí)，應(yīng)比較全面地取材，例如血液、肝、脾、肺、腎、腦和淋巴結(jié)等，同時(shí)要注意采取帶有病變的部分。如懷疑炭疽，則非必要時(shí)不準(zhǔn)做尸體剖檢，只割取一塊耳朵即可。

3.1.2 涂片

鏡檢通常選擇有明顯病變的不同組織器官的不同部位進(jìn)行涂片、染色鏡檢。此法對(duì)于一些具有特殊形態(tài)的病原微生物（如炭疽桿菌、巴氏桿菌等）引起的疫病可以迅速做出診斷，但對(duì)大多數(shù)疫病來(lái)說(shuō)，僅能提供微生物學(xué)診斷的初步依據(jù)。

3.1.3 分離培養(yǎng)和鑒定

用人工培養(yǎng)的方法將病原微生物從病料中分離出來(lái)，然后再進(jìn)行形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性、動(dòng)物接種及免疫學(xué)試驗(yàn)等作出鑒定。

3.1.4 動(dòng)物接種試驗(yàn)

主要用于病原體致病力檢測(cè)，通常選擇對(duì)該種病原微生物最敏感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如家兔、小鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、家禽、鴿子等進(jìn)行人工感染試驗(yàn)。將病料用適當(dāng)?shù)姆椒ㄌ幚砗笕斯そ臃N實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，當(dāng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡或經(jīng)一定時(shí)間剖檢后，觀察病理變化，并采取病料進(jìn)行涂片檢查和分離鑒定。從病料中分離出病原微生物，雖是確診的重要依據(jù)，但也應(yīng)注意動(dòng)物的“健康帶菌”現(xiàn)象，其結(jié)果還需與臨床診斷結(jié)合起來(lái)進(jìn)行分析，有時(shí)即使沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病原微生物，也不能完全否定該種疫病的可能性。

3.2 血清學(xué)診斷

血清學(xué)診斷是疫病診斷和檢疫中常用的方法，是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)反應(yīng)進(jìn)行診斷?？梢杂靡阎乖瓉?lái)測(cè)定被檢動(dòng)物血清中的特異性抗體，也可以用已知的抗體（免疫血清）來(lái)測(cè)定被檢病料中的抗原。常用的血清學(xué)試驗(yàn)有中和試驗(yàn)（毒素抗毒素中和試驗(yàn)、病毒cfl試驗(yàn)等）、凝集試驗(yàn)（直接凝集試驗(yàn)、間接凝集試驗(yàn)、間接血凝試驗(yàn)、SPA協(xié)同凝集試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、血凝和血凝抑制試驗(yàn)）、沉淀試驗(yàn)（環(huán)狀沉淀試驗(yàn)、瓊膠擴(kuò)散沉淀試驗(yàn)和免疫電泳等）、溶細(xì)胞試驗(yàn)（溶菌試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)以及免疫熒光技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫酶技術(shù)、放射免疫分析等。近年來(lái)由于與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，血清學(xué)試驗(yàn)在方法上日新月異，發(fā)展很快，其應(yīng)用也越來(lái)越廣，已成為疫病快速診斷的重要工具。以豬瘟血清學(xué)診斷方法為例，分為以下幾種。

3.2.1 間接血凝試驗(yàn)

間接血凝試驗(yàn)是用已知血凝抗原檢測(cè)未知血清抗體的試驗(yàn)，稱為正向間接血凝試驗(yàn)（IHA）抗原，與其對(duì)應(yīng)的抗體相遇，在一定條件下會(huì)形成抗原抗體復(fù)合物，單這種復(fù)合物的分子團(tuán)很小，肉眼看不見(jiàn)。若將抗原吸附（致敏）在經(jīng)過(guò)特殊處理的紅細(xì)胞表面，只需少量抗原就能大大提高抗原和抗體的反應(yīng)靈敏性。這種經(jīng)過(guò)豬瘟純化抗原致敏的紅細(xì)胞與豬瘟抗體相遇，紅細(xì)胞便出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的凝集現(xiàn)象。間接血凝試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，易制定，既可檢測(cè)抗原，也可檢測(cè)抗體，可以有效監(jiān)測(cè)豬瘟免疫抗體水平。

3.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

豬瘟弱毒單抗純化酶聯(lián)抗原和豬瘟強(qiáng)毒單抗純化酶聯(lián)抗原，分別供檢測(cè)經(jīng)豬瘟弱毒疫苗免疫后產(chǎn)生的抗體和感染豬瘟強(qiáng)毒后產(chǎn)生的抗體之用。

3.2.3 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）

PCR技術(shù)是以待擴(kuò)增的兩條DNA為模板，在一對(duì)人工合成的寡核苷酸引物的介導(dǎo)下，通過(guò)耐高溫DNA聚合酶的酶促作用，快速特異地增出特定的DNA片段。廣泛用于豬瘟病毒感染和豬瘟的診斷。

3.2.4 間接免疫熒光試驗(yàn)

一般是采用發(fā)病動(dòng)物器官的冰凍組織切片直接進(jìn)行熒光抗體試驗(yàn)，許多國(guó)家和地區(qū)已將該法作為法定診斷方法，在我國(guó)的應(yīng)用也較為廣泛。此法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠，可在2 h內(nèi)完成。檢查器官可以是扁桃體、脾、腎等，以扁桃體為最佳。也可將病料乳劑接種細(xì)胞培養(yǎng)物，隨后再用熒光抗體檢出感染細(xì)胞，這樣可提高敏感性。

3.2.5 其他血清學(xué)診斷技術(shù)

除上述幾種常用的血清學(xué)診斷方法以外，還有一些其他的診斷技術(shù)，其中包括動(dòng)物試驗(yàn)、病毒分離、血清中和試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞學(xué)檢查法、核酸探針雜交試驗(yàn)等多種方法。

3.3 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是目前較為普遍使用的一種快速診斷技術(shù)，主要通過(guò)以膠體金富集物的顯色作為指示的一種直觀、快速的技術(shù)。膠體金通過(guò)正負(fù)電荷相互吸引與大蛋白分子聚合在一起，當(dāng)膠體金富集到一定程度時(shí)便會(huì)顯出顏色信號(hào)，以此來(lái)診斷特異性抗原或抗體的存在。該檢測(cè)技術(shù)具有高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、敏感度高等特點(diǎn)。

3.4 分子生物學(xué)診斷方法

3.4.1 PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種最為常見(jiàn)的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，該方法同樣被應(yīng)用到多種傳染病病原的檢測(cè)中。有學(xué)者還設(shè)計(jì)引物創(chuàng)建了套式RT-PCR方法并應(yīng)用于PRRSV抗原檢測(cè)，這種方法可以靈敏地區(qū)分不同來(lái)源的PRRSV毒株。

3.4.2 基因芯片

隨著人類(lèi)基因組測(cè)序的完成，新技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，一批新興的高通量基因檢測(cè)技術(shù)被發(fā)展起來(lái)，其中就包括基因芯片技術(shù)。大量臨床樣品的采集，勢(shì)必需要高通量的檢測(cè)方法，在這種趨勢(shì)的催生下，基因芯片技術(shù)也應(yīng)用到PRRS及其他傳染性疾病的診斷當(dāng)中。我國(guó)學(xué)者高淑霞等對(duì)PRRSV、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬圓環(huán)病毒2型、日本乙型腦炎病毒和豬瘟6種病毒進(jìn)行基因芯片檢測(cè)，應(yīng)用不同病毒的特異性探針檢測(cè)不同的信號(hào)，經(jīng)過(guò)一次操作同時(shí)獲得6種病毒抗原的檢測(cè)結(jié)果。該方法具有高效、便捷、同時(shí)檢測(cè)多種疾病的優(yōu)點(diǎn)，但因其成本相對(duì)較高，技術(shù)要求高，未能普及應(yīng)用，但隨著該技術(shù)的不斷發(fā)展及檢測(cè)成本的降低，相信這種高通量、高效率的檢測(cè)方法肯定能夠獲得普遍認(rèn)可及應(yīng)用。□

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1004-5090（2017）07-0043-02