辛婧，葉磊，楊可，沈亞非，鄧飛

[1.河南省漯河市中心醫(yī)院（漯河市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院）內(nèi)分泌科，河南 漯河 462000；2.河南省漯河市召陵區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 漯河 462000]

辛婧1，葉磊2，楊可1，沈亞非1，鄧飛1

[1.河南省漯河市中心醫(yī)院（漯河市醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院）內(nèi)分泌科，河南 漯河 462000；2.河南省漯河市召陵區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 漯河 462000]

目的構(gòu)建小鼠11β-羥類固醇脫氫酶基因的慢病毒真核表達(dá)載體PLJM1-11β-HSD1-GFP，建立小鼠前體脂肪細(xì)胞（3T3-L1）高表達(dá)基因的穩(wěn)定感染細(xì)胞株，為基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。方法利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）從小鼠肝臟cDNA中擴(kuò)增11β-HSD1開放閱讀框ORF，構(gòu)建針對基因的真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α菌株，抽提質(zhì)粒并進(jìn)行測序鑒定。用測序成功的質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，產(chǎn)生慢病毒并轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞。根據(jù)綠色熒光效率挑取單克隆細(xì)胞團(tuán)篩選出穩(wěn)定細(xì)胞株，通過Western blot鑒定PLJM1-11β-HSD1-GFP轉(zhuǎn)染成功。結(jié)果經(jīng)酶切、PCR及測序驗(yàn)證，PLJM1-11β-HSD1-GFP真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，并包裝慢病毒，綠色熒光效率90%以上，并利用其慢病毒懸液成功感染3T3-L1細(xì)胞，篩選出的穩(wěn)定感染細(xì)胞株的3T3-L1細(xì)胞成功高表達(dá)11β-HSD1蛋白。結(jié)論成功構(gòu)建了基因的真核表達(dá)載體，并建立高表達(dá)的穩(wěn)定感染細(xì)胞株P(guān)LJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1，為進(jìn)一步研究基因的功能，特別是在肥胖中的研究奠定了基礎(chǔ)。

基因；真核表達(dá)載體；前體脂肪細(xì)胞；肥胖

11β-羥類固醇脫氫酶（11beta-hydroxysteriod dehydrogenase，11β-HSD1）在體內(nèi)廣泛分布，表達(dá)于脂肪、肝臟、肌肉、性腺及中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，以脂肪組織和肝臟中的含量最高[1]。它是糖皮質(zhì)激素的代謝酶，有重要的生物學(xué)活性，有還原酶與氧化酶的雙重作用，但以還原酶作用為主，需要煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADP+）參與，有活化糖皮質(zhì)激素的作用，可以使人體無活性的可的松（動物的皮質(zhì)酮）轉(zhuǎn)化為有活性的氫化可的松（皮質(zhì)醇）[2]。資料顯示，11β-HSD1的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示內(nèi)臟脂肪組織肥厚；在代謝綜合征患者脂肪庫中細(xì)胞內(nèi)11β-HSD1的活性是普遍增加的[3]。這可能與糖皮質(zhì)激素能增加脂肪細(xì)胞內(nèi)合成代謝有關(guān)，而11β-HSD1主要使糖皮質(zhì)激素活化，提示其可能與向心性肥胖、胰島素抵抗及糖尿病有關(guān)[4]。本研究擬構(gòu)建基因的真核表達(dá)載體，并建立高表達(dá)該基因的穩(wěn)定感染細(xì)胞株，以進(jìn)一步研究該基因與肥胖、胰島素抵抗及糖脂代謝相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

PolyATtract_Series9600TMmRNA Isolation System試劑盒、末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）、逆轉(zhuǎn)錄酶（AMV）及Taq DNA聚合酶均購自美國Promega公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）及ExpandTMTemplate PCR System購自日本TaKaRa公司，DH5α菌株及PLJM1-NRG1-GFP載體由南京醫(yī)科大學(xué)分子遺傳研究室李建民教授饋贈，Lipofectamine 2000細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，3T3-L1前體脂肪細(xì)胞株、293T細(xì)胞購自上海細(xì)胞生物研究所，DMEM培養(yǎng)液、10%胎牛血清購自南京生興公司，3-異丁基-1-甲基磺嘌呤（MIX）、胰島素及地塞米松購自美國Sigma公司，11β-HSD1兔源抗體購自美國Research Genetics公司，二抗羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶及β-actin抗體購自武漢生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank登錄號NM_008288 mRNA序列設(shè)計(jì)引物，由上海華大基因科技有限公司合成。正向引物：GGGGCTAGCGGATCCGCCACC ATGGCAGTTATGAAAAATTACC；反向引物：GGGG AATTCCTCGAGCCTAGTTACTTACAAACATGTCC。正向引物酶切位點(diǎn)為，反向引物酶切位點(diǎn)為擴(kuò)增目的片段大小881 bp。

1.2.2 小鼠肝臟總RNA的抽提用PolyAT-tract_Series9600TMmRNA Isolation System試劑盒提取BABL/C 8周的小鼠肝臟組織總RNA，提取2μl經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察總RNA完整性，并用紫外分光光度計(jì)分別測定260 nm、280 nm波長下的光密度（OD）值，并檢測總RNA的純度，其余RNA于-70℃冰箱冷凍保存。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）擴(kuò)增目的基因取2μg mRNA加入PrimeSriptTMRT reagent Kit逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，42℃孵育90 min，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，結(jié)束后加入RNAase H內(nèi)切酶，37℃孵育30 min，降解RNA。以上述小鼠的cDNA為模板擴(kuò)增目的片段。PCR的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃10 min，4℃2 min，獲取小鼠基因全長開放閱讀框ORF。

1.2.4 真核表達(dá)質(zhì)粒PLJM-11β-HSD1-GFP制備以上述小鼠3T3-L1細(xì)胞的cDNA為模板，相應(yīng)引物擴(kuò)增11β-HSD1全長ORF，用TaKaRa DNA Fragment Purification Kit純化靶DNA片段。將純化后的PCR產(chǎn)物行雙酶切。對酶切后產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠行電泳檢測。并在切膠儀上切下目的片段。用Ultra-Sep Gel Extraction Kit（OMEGA）純化切膠產(chǎn)物。將酶切純化后的目的片段11β-HSD1連接至PLJM1-NRG1（NheI/EcoRI）載體（10μl體系：目的片段2μl，載體1μl，2×Ligase buffer 5μl，T4連接酶1μl，ddH2O 1μl；條件22℃1 h）。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，在氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）抗性的LB固體平板上生長過夜（37°孵箱16～18 h）。在過夜后的固體平板上挑取5個(gè)單克隆，分別加至Amp抗性的5 ml LB培養(yǎng)基里搖菌過夜并做好標(biāo)記，次日以菌液為模板，以11β-HSD1-F/R為引物作PCR并行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。對獲取的陽性克隆進(jìn)行保種，同時(shí)經(jīng)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，以CMV-F和11β-HSD1-R為測序引物并送上海華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.5 序列分析應(yīng)用NCBI網(wǎng)站BLAST分析軟件，對上述測序結(jié)果進(jìn)行序列比對，鑒定PLJM1-11β-HSD1-GFP載體多克隆位點(diǎn)區(qū)表達(dá)序列的可靠性和準(zhǔn)確性。

1.2.6 PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1慢病毒細(xì)胞株的構(gòu)建用中抽試劑盒抽取質(zhì)粒PLJM1-11β-HSD1-GFP及空載對照質(zhì)粒PLJM.1，保證OD值1.8～1.9，濃度在1 000μg/ml以上。轉(zhuǎn)染前24 h將處于對數(shù)生長期的293T細(xì)胞鋪6 cm培養(yǎng)皿，2×106～4×106個(gè)/皿。轉(zhuǎn)染體系如下：質(zhì)粒PLJM1-11β-HSD1-GFP（或空載對照質(zhì)粒PLJM.1）4μg，包裝質(zhì)粒PVSVG 2μg，delta 8.91 3μg，與Lipofectamine 2000 20μl混合共同孵育形成復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h換液3 ml，并用熒光顯微鏡觀察拍照。轉(zhuǎn)染后48和72 h收集包裝產(chǎn)生的病毒上清，經(jīng)0.45μm濾膜過濾后加入polybrene（Millipore），使終濃度為10μg/ml。感染前24 h將3T3-L1細(xì)胞接種至6 cm培養(yǎng)皿，使感染前細(xì)胞密度為10%～20%。24 h后棄去培養(yǎng)液，用上述病毒上清3 ml感染靶細(xì)胞，37℃培養(yǎng)6 h后換液加入3 ml完全培養(yǎng)液DMEM。感染48 h后觀察熒光表達(dá)情況。根據(jù)熒光效率挑單克隆篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株，并進(jìn)行冷凍保存。

1.2.7 Western blot檢測分別提取正常3T3-L1細(xì)胞、高表達(dá)11β-HSD1的3T3-L1及轉(zhuǎn)入空載質(zhì)粒的3T3-L1細(xì)胞的總蛋白質(zhì)，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度，制備14.7%分離膠和5%濃縮膠，60 V穩(wěn)壓電泳；半干轉(zhuǎn)膜，封閉，按Western blot檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。一抗為11β-HSD1多克隆抗體（抗體濃度為1∶200），二抗為羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶，（抗體濃度為1∶800），用免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法分別檢測3組細(xì)胞株的11β-HSD1蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)所得的Western blot條帶經(jīng)Photoshop軟件處理，在Bandscan分析軟件中測得各自總度值，采用自身β-actin灰度值校正并進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入Excel數(shù)據(jù)庫用Excel軟件進(jìn)行作圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對本研究中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用配對檢驗(yàn)，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠11β-HSD1 ORF片段擴(kuò)增及載體克隆

以小鼠肝臟cDNA為模板，用正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到小鼠11β-HSD1 ORF片段，目的片段為881 bp（見圖1）。

2.2 PLJM1-11β-HSD1-GFP重組載體的鑒定

以正向引物與反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用Promega PCR純化試劑盒進(jìn)行純化，酶切產(chǎn)物（見圖2）行切膠純化，將純化后產(chǎn)物連接至PLJM1-NRG1-GFP載體。隨機(jī)選取5個(gè)陽性克隆，行PCR鑒定（見圖3），獲取的陽性克隆經(jīng)堿裂解法提取質(zhì)粒DNA測序（見圖4），測序結(jié)果經(jīng)序列比對分析確認(rèn)無任何突變、插入等異常，慢病毒載體PLJM1-11β-HSD1-GFP構(gòu)建成功（見圖5）。

2.3 慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

圖1 小鼠11β-1基因ORF擴(kuò)增片段

圖2 小鼠11β-1基因PCR酶切產(chǎn)物

圖3 小鼠11β-基因ORF片段單克隆PCR結(jié)果

慢病毒載體PLJM1-11β-HSD1-GFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞24 h后熒光顯微鏡拍照見圖6，綠色熒光效率90%以上。

2.4 收取病毒上清感染3T3-L1細(xì)胞

收取293T細(xì)胞病毒上清感染3T3-L1細(xì)胞，48 h后熒光顯微鏡拍照結(jié)果見圖7。

2.53 T3-L1單克隆細(xì)胞株綠色熒光蛋白的表達(dá)

根據(jù)熒光情況挑單克隆并篩選穩(wěn)定感染細(xì)胞株，3T3-L1單克隆細(xì)胞株綠色熒光蛋白的表達(dá)見圖8。

圖4 PLJM1-11β-HSD1-GFP質(zhì)粒測序圖

圖5 PLJM1-11β-HSD1-GFP質(zhì)粒序列比對圖

圖6 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后綠色熒光蛋白的表達(dá)（熒光顯微鏡×100）

圖7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞后綠色熒光蛋白的表達(dá)（熒光顯微鏡×100）

2.6PLJM1-11β-HSD1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3T3-L1細(xì)胞蛋白水平驗(yàn)證

分別提取3T3-L1、PLJM1-3T3-L1及PLJM1-11β HSD1-GFP-3T3-L1細(xì)胞組蛋白進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果提示PLJM1-11βHSD1-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，PLJM1-11β-HSD1-GFP-3T3-L1組11β-HSD1蛋白表達(dá)水平明顯升高，見圖9。

圖83 T3-L1單克隆細(xì)胞株綠色熒光蛋白的表達(dá)（熒光顯微鏡×100）

圖9 各組細(xì)胞11β-HSD1蛋白表達(dá)情況

3 討論

11β-HSD1作為一種微線粒體酶，主要負(fù)責(zé)有活性與無活性的糖皮質(zhì)激素之間的互相轉(zhuǎn)化，通過控制底物即糖皮質(zhì)激素的利用率，從而調(diào)控組織特異性糖皮質(zhì)激素受體的活性[5-6]。11β-HSD有2種同工酶。其中11β-HSD2是輔酶Ⅰ（NAD）依賴性脫氫酶，主要使活性的可的松變?yōu)闊o活性的氫化可的松。主要作用于鹽皮質(zhì)激素敏感的靶組織如腎臟，結(jié)腸，唾液腺，胎盤等[7]。11β-HSD1直到最近才被發(fā)現(xiàn)并認(rèn)為是重要的生物酶，是還原型輔酶Ⅱ（NADPH）依賴性的還原酶，與11β-HSD2作用相反，主要負(fù)責(zé)將無活性的氫化可的松轉(zhuǎn)化為有活性的可的松[8]。它廣泛分布于各組織，主要分布于肝臟、脂肪、性腺、腦、脈管系統(tǒng)等，這些組織則以糖皮質(zhì)激素受體占優(yōu)勢。研究表明，11β-HSD1調(diào)節(jié)糖皮質(zhì)激素受體與配體的結(jié)合，參與了庫欣綜合征相似的疾病的發(fā)生發(fā)展，如向心性肥胖、糖尿病、多囊卵巢綜合征以及癡呆[9-10]。

慢病毒（Lentivirus）載體是以人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體[11]。攜帶有目的基因的慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒及細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過感染細(xì)胞或組織，實(shí)現(xiàn)目的基因在宿主細(xì)胞中得到長期而穩(wěn)定的表達(dá)[12]。經(jīng)過改建后的慢病毒載體能夠容納約10 kb左右的外源基因，因此大多數(shù)的cDNA都能夠被克隆入慢病毒載體。293T細(xì)胞由293細(xì)胞派生，屬人腎上皮細(xì)胞系，作為包裝細(xì)胞，在包裝后產(chǎn)生了高滴度的病毒顆粒，同時(shí)表達(dá)目的基因。

本文利用慢病毒載體技術(shù)成功構(gòu)建了帶有GFP目的基因HSD1的慢病毒載體PLJM1-HSD1-GFP，同時(shí)建立了3T3-L1穩(wěn)定感染細(xì)胞株P(guān)LJM1-HSD1-GFP-3T3-L1，為進(jìn)一步研究HSD1的生物學(xué)功能奠定了必要的基礎(chǔ)。

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（張蕾編輯）

Construction and role of mouse PLJM1-11β-HSD1-GFP plasmid

Jing Xin1,Lei Ye2,Ke Yang1,Ya-fei Shen1,Fei Deng1
(1.Department of Endocrinology,Luohe Central Hospital,Luohe,Henan 462000,China;2.Department of Neurology,the People's Hospital of Shaoling District,Luohe,Henan 462000,China)

ObjectiveTo construct a lentiviral vector of PLJM1-11β-HSD1-GFP and establish a stable cell line of 3T3-L1 with high expression of mousegene,and lay the foundation for the research ofgene.MethodsOpen reading frame(ORF)fragment of mouse tissues by RT-PCR,then inserted into the PLJM1-NRG1-GFP vector and transformed into competent DH5α strain ofThe plasmid was extracted and used for sequencing.The successfully-sequenced plasmid PLJM1-11β-HSD1-GFP and the packaging plasmid were transfected to 293T cell line to produce recombinant lentivirus.3T3-L1 cell line was transfected by recombinant virus and the stable cell line was isolated by selecting the single clone with GFP,and high expression of 11β-HSD1 was identified by Western blot.ResultsThe eukaryotic expression vector of PLJM1-11β-HSD1-GFP was constructed and confirmed by DNA sequencing.The lentivirus vector ofnamed PLJM1-11β-HSD1-GFP was successfully constructed and the virus was packaged in 293T cells.3T3-L1 cells were transfected by recombinant virus and the stable cell line was selected by green fluorescence efficiency,which showed that the lentivirus vector transfection rate was over 90%.A dramatically elevated protein level of 11β-HSDl was expressed in the positive clones of 3T3-L1 cells compared with the control group.Conclusions Mouse PLJM1-11β-HSD1-GFP plasmid has been successfully constructed.The 3T3-L1 cellsgene was amplified from mouse livertransfected by PLJM1-11β-HSD1-GFP could effectively elevate the expression ofgene,and can be used in the functional researches of mousegene,especially those related to obesity.

gene;eukaryotic expression vector;3T3-L1 cell;obesity

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.16.003

1005-8982（2017）16-0012-06

Q782

A

2016-11-28