歐麗娟+羅建新+孫愛明+陳思羽+王凌云

摘 要 三聚氰胺能與銅離子（Cu2+）形成配合物，對熒光銅納米簇的合成有明顯抑制作用，且其抑制程度與三聚氰胺濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系?；诖藰?gòu)建了一種簡單、快速檢測三聚氰胺的方法。以聚T單鏈DNA為模板合成的銅納米簇作為熒光探針，當三聚氰胺存在時，Cu2+與三聚氰胺生成配合物，阻礙銅納米簇的合成，導致熒光強度降低。在優(yōu)化的實驗條件下，三聚氰胺濃度在5～120 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限為1.5 μmol/L，牛奶樣品中三聚氰胺加標回收率為96.3%～104.4%。與傳統(tǒng)納米金/銀、量子點等方法相比，本方法具有簡單、快速、靈敏等優(yōu)點。

關(guān)鍵詞 銅納米簇； 銅-三聚氰胺配合物； 熒光； 非標記

1 引 言

三聚氰胺是一種低毒性的氮雜環(huán)有機化工原料，常用于制造三聚氰胺樹脂，是建筑業(yè)常用的防火材料。由于其分子中含氮量為66%，且無味，摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)，一些不良企業(yè)為降低成本，在乳制品和飼料中添加三聚氰胺，以提高食品檢測中蛋白質(zhì)含量指標。然而，三聚氰胺會與尿酸結(jié)合生成難溶于水的結(jié)石[1]，導致腎積水、腎結(jié)石等腎臟膀胱疾病，甚至死亡。因此，發(fā)展快速、準確、靈敏的三聚氰胺的測定方法對保障乳制品安全具有重要的實際意義。

傳統(tǒng)的三聚氰胺檢測方法包括高效液相色譜法[2]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3]、電位滴定法[4]、酶聯(lián)免疫吸附分析法[5]等，上述方法一般需要專業(yè)的操作人員，且存在選擇性低或者精確度不高的不足，難以滿足實際食品監(jiān)管中快速、高效、低成本的檢測要求。近年發(fā)展的新方法， 如納米材料比色法[6～8]、熒光探針法[9]、分子印跡聚合物法[10]和表面增強拉曼散射技術(shù)[11，12]等，與傳統(tǒng)方法相比，具有檢出限低、靈敏度高的優(yōu)勢，但是預處理過程繁瑣耗時，需要衍生或者昂貴的儀器。

最近，Qing等[13]發(fā)現(xiàn)，富含胸腺嘧啶T的單鏈DNA可作為合成銅納米簇的有效模板。聚T為模板合成的銅納米簇熒光強度高，而且尺寸和熒光強度可以通過聚T單鏈DNA的長度來調(diào)節(jié)；此外，基于聚T單鏈DNA 的銅納米簇的合成在幾分鐘內(nèi)即可完成，比其它金屬納米簇的合成快速、簡捷。如隨機dsDNA-銅納米簇合成中，為了保證雙鏈DNA模板的有效雜交，耗時需1 h以上[14]；DNA-銀納米簇的合成需要在黑暗中反應24 h[15]；BSA-金納米簇的合成需要2 d[16]。

三聚氰胺可以通過芳香環(huán)上的氮原子與Cu2+形成配合物[17]。基于此，本研究提出了一種檢測三聚氰胺的方法。利用聚T單鏈DNA為模板合成的銅納米簇作為熒光探針，由于三聚氰胺與Cu2+發(fā)生配位反應，阻礙了銅納米簇的合成，導致銅納米簇熒光信號減弱。此方法用于三聚氰胺的檢測快速、操作簡單、成本低，并成功用于實際牛奶樣品中三聚氰胺的檢測，在食品安全監(jiān)管等方面具有良好的應用前景。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

含30個堿基的聚胸腺嘧啶寡聚核苷酸鏈（T30）由上海生工生物工程公司合成。3-（N-嗎啉基）-丙磺酸（MOPs）、抗壞血酸、CuSO4·5H2O、NaCl 和三聚氰胺（北京鼎國生物技術(shù)公司）；其它試劑均為分析純；實驗用水為超純水（>18.25 MΩ·cm）。

Cary Eclipse熒光分光光度計（美國安捷倫公司），激發(fā)波長340 nm，掃描范圍500～660 nm，激發(fā)狹縫設定為5.0 nm，發(fā)射狹縫設定為10.0 nm。

2.2 熒光銅納米簇的制備

T30DNA為模板的銅納米簇的制備參照文獻[13]的方法稍作修改，簡述如下：將5 μmol/L T30-DNA、MOPs緩沖液（10 mmol/L MOPs，150 mmol/L NaCl，pH 7.6）、3 mmol/L抗壞血酸溶液混合均勻后，加入300 μmol/L CuSO4溶液，避光反應1 min，得到熒光銅納米簇。

2.3 三聚氰胺的檢測

將300 μmol/L CuSO4溶液與不同濃度的三聚氰胺溶液混勻，室溫下孵育20 min。反應后的溶液加入到含有5 μmol/L T30-DNA、MOPs緩沖液、3 mmol/L抗壞血酸溶液的體系中，室溫下避光反應1 min，立即進行熒光檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 實驗原理

三聚氰胺可以通過芳香環(huán)上的N與Cu2+形成配合物[17]，基于此，本研究構(gòu)建了檢測三聚氰胺的策略，如圖1所示。以含30個堿基的聚胸腺嘧啶的單鏈DNA為模板，以抗壞血酸為還原劑， Cu2+被還原為Cu0，并富集在T30單鏈DNA上，生成具有強熒光的銅納米簇，并作為信號報告探針（圖1A）。當三聚氰胺存在時，與Cu2+發(fā)生配位反應，不利于Cu2+被還原為Cu0簇擁在單鏈DNA上，從而阻礙銅納米簇的合成，導致合成銅納米簇的熒光強度大大降低（圖1B），熒光強度降低的程度與三聚氰胺的濃度相關(guān)，基于此可以實現(xiàn)三聚氰胺的檢測。

3.2 三聚氰胺對熒光銅納米簇合成的影響

為了考察三聚氰胺是否能夠間接抑制CuNCs的合成，測定了三聚氰胺存在與否時CuNCs的熒光光譜。如圖2a所示， Cu2+不存在時，無熒光信號，說明未合成CuNCs；Cu2+存在時，630 nm出現(xiàn)強的熒光發(fā)射峰（圖2b），證明在抗壞血酸作用下，Cu2+被還原為Cu0，聚集在T30單鏈DNA上，生成CuNCs，產(chǎn)生強的熒光信號。當加入120 μmol/L三聚氰胺后，熒光強度大大降低（圖2c），說明三聚氰胺與Cu2+形成配合物，阻礙了銅納米簇的合成，導致體系的熒光強度降低。以上結(jié)果表明，可以利用三聚氰胺對銅納米簇熒光強度的減弱程度檢測三聚氰胺。

3.3 實驗條件優(yōu)化

銅納米簇的合成時間對熒光檢測三聚氰胺有重要影響。研究表明，隨著銅納米簇合成時間的延長，不加三聚氰胺時的空白熒光信號值F0基本趨于平穩(wěn)，但是加三聚氰胺的響應熒光信號強度F有略微的增加，導致F0/F逐漸降低，降低了信噪比（圖3A）。因此，實驗選用銅納米簇合成時間為1 min。

三聚氰胺與銅離子發(fā)生配位反應，繼而阻礙銅納米簇的合成，導致熒光強度降低。因此，配位反應時間也是一個重要因素。從圖3B可見，隨著絡合時間延長，F(xiàn)0/F逐漸增加， 20 min達到最大并趨于平穩(wěn)。故選取三聚氰胺與Cu2+的配位反應時間為20 min。

Cu2+被還原為Cu0結(jié)合在單鏈DNA上，形成熒光銅納米簇[14]。低濃度的Cu2+不利于合成銅納米簇。但是高濃度的Cu2+可與抗壞血酸產(chǎn)生氧的自由基降解DNA鏈，導致模板濃度降低，從而使銅納米簇熒光強度降低[18]。因此，Cu2+的濃度對銅納米簇的熒光信號有重要影響。從圖3C可見，Cu2+濃度在100～700 μmol/L范圍內(nèi)時，F(xiàn)0/F先增加，于300 μmol/L達到最大值，繼續(xù)增大Cu2+濃度，F(xiàn)0/F反而降低。故選擇最佳Cu2+濃度為300 μmol/L。

抗壞血酸濃度也是影響銅納米簇合成的一個重要參數(shù)。從圖3D可知，隨著抗壞血酸濃度的增加，F(xiàn)0/F逐漸增大，在3 mmol/L處達到最大。故選取3 mmol/L作為最佳抗壞血酸濃度。

3.4 傳感器的分析性能

在最佳的實驗條件下，對不同濃度的三聚氰胺進行了檢測。圖4A為630 nm處熒光強度與三聚氰胺濃度的校正曲線圖。結(jié)果表明，隨著三聚氰胺濃度升高，熒光信號逐漸降低，在5～120 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為R2=0.998，檢出限為1.5 μmol/L （S/N=3），遠低于國家規(guī)定的三聚氰胺限量值1 mg/kg[19]。與文獻報道的納米金、納米銀等方法[6，7，8，11，12]相比， 本方法檢出限更低，并且方法操作簡單、快速。

為了證明本方法對三聚氰胺檢測的特異性，考察了牛奶中存在的常見金屬離子（Ca2+，F(xiàn)e3+，Zn2+）及氨基酸（甘氨酸Gly，賴氨酸Lys，組氨酸His）等其它可能產(chǎn)生干擾的物質(zhì)（葡萄糖Glc，苯胺Ani）的影響。從圖4B可見，只有三聚氰胺會導致銅納米簇熒光顯著降低，大多數(shù)干擾物質(zhì)的加入對銅納米簇熒光沒有影響。盡管L-組氨酸的咪唑環(huán)也可與Cu2+發(fā)生配位反應，導致銅納米簇熒光減弱，但是響應信號遠小于三聚氰胺。

3.5 實際牛奶樣品分析

采用本方法檢測了牛奶樣品中三聚氰胺。牛奶樣品處理方法同文獻[20]：在牛奶樣品中加入三氯乙酸，超聲提取20 min，15000 r/min離心兩次。上清液過濾后，用NaOH溶液調(diào)至pH 7.0，采用本法進行檢測。結(jié)果表明，牛奶樣品中未檢測出三聚氰胺。加標回收實驗結(jié)果見表1。樣品的加標回收率在96.3%～104.4%之間，表明本方法具有良好的可靠性和準確性，可用于實際樣品中三聚氰胺的檢測。

4 結(jié) 論

基于三聚氰胺與Cu2+絡合形成配合物，阻礙銅納米簇的合成，從而降低銅納米簇的熒光，建立了一種檢測三聚氰胺的靈敏方法。本方法成本低、無需標記，操作簡單、快速、靈敏度高、特異性好，可用于牛奶樣品中三聚氰胺檢測，具有良好的的應用前景。

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