裴興麗+黃煜宇+龔燦+許旭

摘 要 將離子液體2，5-二羥基苯甲酸丁胺用于改進基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜分析寡糖的定量重復(fù)性，并進一步用于大豆和豆葉中寡糖的質(zhì)譜成像研究。實驗中設(shè)定正電荷檢測模式、激光能量為70%，采用將離子液體2，5-二羥基苯甲酸丁胺甲醇溶液（20%，V/V）直接覆蓋樣品的簡單加基質(zhì)方法，分析寡糖樣品及大豆和豆葉寡糖分布的質(zhì)譜成像。結(jié)果表明，離子液體2，5-二羥基苯甲酸丁胺作為基質(zhì)，用基質(zhì)輔助激光解吸電離化質(zhì)譜分析蔗糖、棉子糖、水蘇糖3種寡糖樣品，點內(nèi)重復(fù)性RSD<3%，點間重復(fù)性RSD<4%，在0.062～1.00 mg/mL 范圍內(nèi)測定的線性相關(guān)系數(shù)R2≥ 0.996，顯示出較好的定量分析潛力。將此基質(zhì)用于基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像分析大豆切片和豆葉表面的二糖、三糖和四糖，得到空間分辨率為150 μm的3種寡糖質(zhì)譜成像圖。3種寡糖在大豆中大致均衡分布，在豆葉的分布均以葉尖為多，并且根據(jù)標準曲線和圖中的信號強度可以估計其含量。

關(guān)鍵詞 質(zhì)譜成像； 離子液體； 基質(zhì)輔助激光解吸； 寡糖

1 引 言

基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜（Matrix-assisted laser desorption ionization-mass spectrometry， MALDI-MS）成像技術(shù)是分析組織或不同組織狀態(tài)之間組分變化非常有價值的工具，近年得到快速發(fā)展[1，2]，已廣泛應(yīng)用于病理學[3]、藥物代謝[4]、動植物生理[5]等諸多生命科學領(lǐng)域。該技術(shù)在分子水平上對生物組織切片進行多組分“直接”分析，經(jīng)過圖像重建軟件獲得組織中目標成分的定位、定性和定量的信息，并提供可視化的組織分布信息[6，7]。

由于質(zhì)譜成像中包含樣品的含量信息，這也需要解決MALDI-MS用于定量分析的問題，目前已有不少實驗室用不同方法對各種樣品進行定量分析[8]。這些工作內(nèi)容大致可以分為四方面： 一是優(yōu)化實驗參數(shù)，通過控制樣品制備和預(yù)處理過程降低測量差異[9，10]； 二是從分析方法入手，采用同位素稀釋法[11]、內(nèi)標法定量[12，13]、定量為與已知內(nèi)源性組分的比值[14]等； 三是改善基質(zhì)覆蓋均勻性，如噴霧-液滴法[15]，化學噴墨打印法[16]等； 四是選擇不同的基質(zhì)，張珍英等[17]采用新型香豆素類化合物分別與2，5-二羥基苯甲酸（2，5-Dihydroxybenzoic acid， DHB）混合組成兩種二元基質(zhì)，顯著改善了基質(zhì)和葡聚糖樣品的共結(jié)晶狀況，使樣品分布更均勻。Jiao等[18]采用一種新型肼基煙酸做基質(zhì)分析低聚糖，發(fā)現(xiàn)比傳統(tǒng)的基質(zhì)DHB重復(fù)性好。MALDI-MS成像和定量分析的關(guān)鍵與選擇合適的基質(zhì)密切相關(guān)。傳統(tǒng)的單一固體基質(zhì)容易形成熱點（Hot spot）導(dǎo)致結(jié)晶不均勻、信號重復(fù)性差等問題，其樣品點內(nèi)（In-spot）、點與點之間（Spot-to-spot）等的重復(fù)性仍然存在不少問題[19]。

離子液體（Ionic liquid， IL）是在室溫下呈液態(tài)， 是由離子構(gòu)成的有機鹽[20]。Armstrong等[21]首次將離子液體引入MALDI-MS作為基質(zhì)，顯示出靈敏度高、真空穩(wěn)定性好、能與樣品均勻混合、重復(fù)性好等優(yōu)點。進一步使用離子液體的MALDI-MS研究[22～24]對多種樣品獲得了良好的重復(fù)性、線性和靈敏度。使用α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid， CHCA）或DHB與等摩爾有機堿（如三丁胺、吡啶和1-甲基咪唑等）得到的離子液體作為MALDI基質(zhì)，具有可忽略的蒸氣壓，特別是其與樣品形成均勻的混合物表面，減少了點與點之間的信號差異， MALDI-MS的定量重復(fù)性明顯改善[25～27]。如Yoon等[28]采用CHCA與1-甲基咪唑得到的離子液體基質(zhì)對聚六甲基胍樣品進行定量分析。將離子液體用于MALDI-MS成像也顯示出較好的成像效果。Chan等[29]將CHCA與1-甲基咪唑的離子液體基質(zhì)用于MALDI-MS成像分析小鼠腦中神經(jīng)節(jié)苷脂的分布。Shrivas等[30]將CHCA丁胺和DHB丁胺離子液體基質(zhì)用于小鼠肝組織和腦部切片中磷脂的MALDI-MS成像分析。 Meriaux等[31]采用DHB和苯胺、DHB和3-乙酰合成的離子液作為基質(zhì)，用于MALDI-MS成像分析大鼠腦部和人卵巢癌的脂質(zhì)。

寡糖具有特殊的生理功能，不但對促進植物生長、增強抗逆性等方面有重要作用，在疾病防治、植物生長與抗病害、畜牧養(yǎng)殖等方面的應(yīng)用也備受關(guān)注[32]。

本研究以離子液體2，5-二羥基苯甲酸丁胺（2，5-Dihydroxybenzoate acid butylamine， DHB-BuN）為基質(zhì)，使用傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜，MALDI-MS分析寡糖樣品，在獲得MALDI-MS較好定量重復(fù)性和靈敏度的基礎(chǔ)上，將此基質(zhì)用于MALDI-MS成像分析大豆切片和大豆葉片表面的二糖、三糖和四糖，為寡糖的MALDI-MS成像分析提供了實驗參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SolariX 7.0 型傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FT-ICR-MS，瑞士 Bruker公司），配備Nd：YAG二級管泵浦固體激光器（波長為355 nm）和HyStar Version 3.4（Build 8）成像分析軟件； BS224S 型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）； PS-20超聲波清洗儀（東莞潔康公司）； XW-80A旋渦混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）； ZX98-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）； Finesse325型旋轉(zhuǎn)石蠟切片機（賽默飛世爾科技（上海）有限公司）。

甲醇、乙腈、吡啶、苯胺、N，N-二甲基苯胺、正丁胺、D-（+）-蔗糖（分析純，上海泰坦科技股份有限公司）。L-脯氨酸（生化試劑）、D，L-焦谷氨酸（純度98%）、L-精氨酸鹽酸鹽（生化試劑）、D，L-酪氨酸（純度98.5%）均購自國藥集團化學試劑有限公司。2，5-二羥基苯甲酸（DHB，純度為99%）、水蘇糖（純度為98%）、D-（+）-葡萄糖（純度99%）均購自北京百靈威科技技術(shù)有限公司。β-環(huán)糊精（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）。棉子糖（純度98%，上海同田生物技術(shù)股份有限公司）。谷胱甘肽（還原型，純度99%，如吉生物科技有限公司）。血管緊張素Ⅱ（純度90%。阿拉丁試劑）。L-苯丙氨酸（純度98%，Adamas試劑有限公司）。蒸餾水和葵花籽油購自本地超市。大豆（當年收獲，產(chǎn)地： 江蘇大豐），豆葉采自本地當季豆田。

2.2 實驗方法

2.2.1 基質(zhì)配制與樣品制備 （1）離子液體基質(zhì)的合成 參考文獻[33]方法，取2，5-二羥基苯甲酸置于圓底燒瓶，加入甲醇溶解，配成0.2 mol/L 的溶液。加入稍過量的正丁胺或者其它有機胺，混合1 min， 旋蒸（40℃）除去多余的丁胺和甲醇，直到液體體積不再減少，得到純的離子液體2，5-二羥基苯甲酸丁胺（DHB-BuN）。直接加入4倍體積的甲醇并渦旋10 min，配成20% （V/V） 的溶液，待用。合成的基質(zhì)在2天內(nèi)使用，或者充入氮氣（避免氧化）密封保存。（2）固體基質(zhì)的制備 固體基質(zhì)2，5-二羥基苯甲酸（DHB）用乙腈-水（7∶3， V/V）配成濃度為10 mg/mL的溶液。（3）樣品準備 取適量蔗糖（二糖）、棉子糖（三糖）、水蘇糖（四糖）、β-環(huán)糊精、脯氨酸、焦谷氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、D，L-酪氨酸、血管緊張素Ⅱ、谷胱甘肽、葵花籽油，分別溶于水-乙腈（1∶1， V/V）溶液，配制成0.5 mg/mL的溶液。（4）材料的處理 大豆： 用石蠟切片機切成厚度為25 μm的薄片，切片位置離胚芽約0.3 mm，垂直切下，然后取切下的一半。豆葉： 摘下的豆葉，用剪刀剪下尖端部分（得到面積約2 cm2的三角形）待用。分析時用雙面膠分別貼在不銹鋼靶板上。

2.2.2 儀器條件 （1）MALDI-MS條件 點靶后采用正離子模式檢測，使用離子液體時分析樣品的采集與成像參數(shù)如表1所示。固體基質(zhì)DHB的采集參數(shù)除激光能量為45%外，其它與使用離子液體基質(zhì)分析的采集參數(shù)相同。（2）MALDI-MS成像實驗 質(zhì)譜成像的過程如圖1所示。首先將樣品薄片用雙面膠直接貼在不銹鋼靶板上（或者貼在成像玻片上，并裝入成像靶板），然后采用干滴法，用移液槍取制備好的的離子液體基質(zhì)滴在樣品薄片上，待溶劑揮發(fā)后，放入質(zhì)譜儀。在Compass solariXcontrol質(zhì)譜操作軟件中設(shè)置采集參數(shù)見表1。成像結(jié)果由Hystar Version 3.4（Build 8））軟件處理得到。

3 結(jié)果與討論

3.1 MALDI-MS實驗條件的影響

選用葡萄糖（單糖）、蔗糖（二糖）、棉子糖（三糖）、水蘇糖（四糖）、β-環(huán)糊精（七糖）作為寡糖樣品。樣品濃度均為0.5 mg/mL。考察了不同基質(zhì)類型、基質(zhì)溶液濃度、基質(zhì)溶液與樣品溶液用量比、激光能量、點樣方法等對測試的影響。

用2，5-二羥基苯甲酸（DHB）分別與吡啶、苯胺、N，N-二甲基苯胺、正丁胺合成了4種離子液體基質(zhì)。用于3種寡糖樣品測定時均有響應(yīng)，其中DHB與正丁胺形成的離子液體DHB-BuN作為基質(zhì)對3種寡糖的響應(yīng)均較好。因此，選擇DHB-BuN作為進一步研究的基質(zhì)。

考察DHB-BuN甲醇溶液濃度分別在14%～50%（V/V）時的MALDI-MS點樣效果，在DHB-BuN濃度低于20%（V/V）時， 溶液在靶板上能均勻鋪展，不易聚集，得到均勻且薄的基質(zhì)點。但降低濃度，信噪比也會下降。故DHB-BuN甲醇溶液濃度選擇20%（V/V）。

以蔗糖為樣品，考察在基質(zhì)溶液與樣品溶液的用量（DHB-BuN∶蔗糖）分別為2∶1、1∶1、1∶2（V/V）時的測試結(jié)果，當基質(zhì)與樣品溶液的體積比為1∶1時，得到的質(zhì)譜峰信噪比較好。

當激光能量低于55%，樣品不出峰； 考慮到能量大于80%可能影響激光壽命，所以激光能量選擇為70%。

比較了3種點樣方法，包括（A）先用基質(zhì)DHB-BuN甲醇溶液 0.5 μL點靶，然后點樣0.5 μL蔗糖溶液（濃度0.5 mg/mL）； （B）先取樣品蔗糖溶液（0.5 mg/mL）0.5 μL 點樣，然后用基質(zhì)DHB-BuN溶液 0.5 μL 點樣； （C）基質(zhì)DHB-BuN溶液和樣品蔗糖溶液（0.5 mg/mL）等體積混合后超聲1 min，再渦旋2 min充分混勻后，取1.0 μL點靶。用MALDI-MS成像的方法（實驗參數(shù)見表1）評價組分在靶板上分布的均勻性。結(jié)果表明，基質(zhì)-樣品混合后點樣重復(fù)性較好，具有最好的均勻性。

因此，實驗中將20%（V/V）的DHB-BuN甲醇溶液和樣品溶液等體積混合后超聲1 min，再渦旋2 min充分混勻后，取1.0 μL點靶，按照2.2.2節(jié)MALDI-MS方法測定。5種寡糖樣品測試結(jié)果與理論值的比較見表2，除葡萄糖以[M+Na]+的形式出峰外，其它成分都以[M+Na]+、[M+K]+的形式出峰。

3.2 重復(fù)性

選擇混合點樣方法（C），將上述配制的濃度均為0.5 mg/mL的蔗糖、棉籽糖、水蘇糖分別與基質(zhì)混合，在以上MALDI-MS條件下，分別用離子液體基質(zhì)DHB-BuN和固體基質(zhì)DHB測試樣品，比較兩者的重復(fù)性。在比較點內(nèi)（In-spot）重復(fù)性時，按照九宮格的形式，將1個點分成大致9個區(qū)域，然后手動將激光束聚焦在每個區(qū)域的位置上，采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)。選擇[M+Na]+峰為重復(fù)性數(shù)據(jù)的目標峰，每個區(qū)域的數(shù)據(jù)是重復(fù)采集區(qū)內(nèi)不同位置的5次樣品信號強度的平均值（采用DHB-BuN時，RSD<6%； 采用DHB時，RSD<15%）。點間（Spot-to-spot）的重復(fù)性是測定6個不同樣品點的結(jié)果，在每個樣品點中間區(qū)域的不同位置采集5次數(shù)據(jù)的平均值。由圖2可見，采用DHB-BuN基質(zhì)測定的點內(nèi)峰強度RSD<3%，點間RSD<4%，可較好地進行定量分析和成像研究。

采用MALDI-MS成像方法測定靶上樣品在不同區(qū)域的信號強度分布，靶點的光學圖像和MS成像如圖3所示。從DHB基質(zhì)的光學圖像（A）可以看到產(chǎn)生了結(jié)晶，而DHB-BuN做基質(zhì)時的光學圖像（D）中可以看到DHB-BuN仍然以液體狀態(tài)存在。在質(zhì)譜儀高倍放大鏡頭下的分布見圖3B和3E。MALDI-MS成像的方法測定靶上樣品在不同區(qū)域的信號強度分布見圖3C和3F。采用DHB-BuN基質(zhì)時的信號強度分布明顯比DHB為基質(zhì)時樣品信號強度分布更均勻，這與文獻[34]和圖2的結(jié)果一致。

3.3 質(zhì)譜信號強度與樣品濃度間的（線性）關(guān)系

分別將6種不同濃度的（0.062～1.000 mg/mL）蔗糖、棉籽糖、水蘇糖樣品與基質(zhì)混合超聲超1 min， 再用旋渦混合2 min，使基質(zhì)和分析物充分混勻。用移液槍分別取1 μL各濃度混合溶液，分別點在靶板上，MALDI-MS測定質(zhì)譜峰強度。測定樣品濃度與[M+Na]+峰強度的線性關(guān)系（圖4），其中每個濃度的峰強度同樣是重復(fù)采集5次數(shù)據(jù)求平均值得到（5次質(zhì)譜峰強度數(shù)據(jù)RSD<6%）。在本實驗測定的濃度范圍內(nèi)各寡糖樣品的質(zhì)譜峰信號強度與樣品濃度， 線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥ 0.996。

3.4 靈敏度

用離子液體基質(zhì)DHB-BuN和固體基質(zhì)DHB（10 mg/mL）分別測試濃度為0.5 mg/mL的蔗糖、棉子糖、水蘇糖標準樣品的MALDI-MS譜圖（圖5）。不同基質(zhì)測得各樣品信號強度和信噪比見表3，DHB-BuN相對固體基質(zhì)DHB的信號強度、基線噪音、信噪比均有不同程度的提高，蔗糖、棉子糖和水蘇糖的信噪比分別提高了約2倍、8.4倍和5.5倍。按照3倍信噪比計算，各寡糖樣品的檢出限為7～25 μg/mL。 表明離子液液體基質(zhì)DHB-BuN具有較高的靈敏度。

在測試標準樣品和實際樣品時，標準樣品主要以[M+Na]+出峰，而實際測大豆樣品時，主要以 [M+K]+出峰。因此考察了加入Na+和K+對信號強度的影響。首先在標準樣品（1.0 mg/mL）中加入不同濃度的鹽（NaCl或者KBr），測定結(jié)果見圖6，

當加入KBr的濃度低于8 mmol/L時， [M+K]+的信號響應(yīng)增強； 但KBr的濃度超過8 mmol/L后，樣品的信號強度降低。加入NaCl溶液濃度在低于7 mmol/L時，有助于增強 [M+Na]+的信號； NaCl濃度超過7 mmol/L時，信號強度也降低。因此，加入適量的Na+和K+會增強樣品峰強度，但濃度高則有抑制作用。大豆樣品中的[M+K]+峰則可能來自于樣品中的K+。

以DHB-BuN為基質(zhì)，MALDI-MS測試了脯氨酸、焦谷氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、D，L-酪氨酸、血管緊張素Ⅱ、谷胱甘肽和葵花籽油樣品。結(jié)果表明，只有苯丙氨酸、谷胱甘肽和血管緊張素Ⅱ有質(zhì)譜峰出現(xiàn)，其它樣品均不出峰。進一步考察苯丙氨酸、谷胱甘肽和血管緊張素Ⅱ?qū)烟菧y定的影響，將蔗糖和血管緊張素Ⅱ配成等摩爾濃度的溶液，然后以兩種不同的體積比混合（1∶1～1∶10），MALDI-MS測定結(jié)果見圖7，當蔗糖-血管緊張素Ⅱ的體積比為1∶10時，蔗糖仍有很強的峰，而同樣摩爾濃度的血管緊張素Ⅱ質(zhì)譜峰的強度僅約為蔗糖質(zhì)譜峰強度的1/4，如圖7B所示。說明DHB-BuN基質(zhì)能選擇性地使低聚糖離子化，而此時對血管緊張素Ⅱ類的離子化能力不強。同樣測試苯丙氨酸，也有類似現(xiàn)象出現(xiàn)。但采用蔗糖+谷胱甘肽測試時，兩者的峰強度相近，寡糖的峰強度與單獨測試時基本相同。因此，離子液體作為基質(zhì)時，對不同的氨基酸或者多肽樣品的MALDI-MS響應(yīng)存在明顯差異，在本實驗條件下，不會影響對寡糖的質(zhì)譜分析。

與常規(guī)的基質(zhì)（如DHB）相比，離子液體基質(zhì)也需從紫外吸收基團獲取激光的能量，實驗中還需使用較高的激光能量，這可能與樣品離子化時需要克服液體的表面張力有關(guān)。對于多肽等樣品，本方法的檢測靈敏度比固體基質(zhì)有不同程度的提高（這也與其能量偏高有關(guān)）。文獻中也報道測定寡核苷酸[35]、磷脂[36]樣品時有靈敏度提高的現(xiàn)象。

3.6 大豆中的寡糖的成像

將大豆用石蠟切片機切成厚度為25 μm的薄片。按照2.2.2節(jié)的方法，取30 μL DHB-BuN，分3次（每次10 μL）盡可能均勻地滴在大豆上，得到的大豆切片的MAILDI-MS結(jié)果如圖8所示。本實驗的質(zhì)譜條件無法區(qū)分同分異構(gòu)體，大豆中主要的寡糖為二糖（蔗糖）、三糖（棉子糖）和四糖（水蘇糖），與文獻[37]報道一致。且這些二糖、三糖、四糖主要是[M+K]+峰，[M+Na]+峰很低。

MALDI-MS成像分辨率介于二次離子質(zhì)譜（Secondary ion mass spectrometry， SIMS）成像與常壓敞開式離子化質(zhì)譜成像技術(shù)之間[38]，本實驗的儀器可以使用25 μm的空間分辨率，但耗時較長，通常僅在局部樣品分析時使用。本實驗中設(shè)置150 μm空間分辨率，由Hystar軟件測試得到大豆切片（8.0 mm×3.4 mm）的MALDI-MS成像圖見圖9，各種寡糖在該切片中大致均勻分布，但不同寡糖的分布不完全一樣。根據(jù)前面的線性關(guān)系和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，可以大致估計不同寡糖的最高濃度（粉色區(qū)域）分別約為130 μg/mL（二糖）、25 μg/mL（三糖）和100 μg/mL（四糖）。

對豆葉的質(zhì)譜成像測定時同樣采用2.2.2節(jié)的方法，取30 μL DHB-BuN溶液，分3次（每次10 μL）盡可能均勻地滴在豆葉樣品（底寬22 mm，高16 mm）上，MALDI-MS測豆葉樣品表面的質(zhì)譜圖如圖10所示， 豆葉中的寡糖的質(zhì)譜峰都是[M+K]+峰。MALDI質(zhì)譜成像如圖11所示。根據(jù)3.3節(jié)的線性關(guān)系，可大致推算最高濃度（粉色區(qū)域）分別為300 μg/mL（二糖）、76 μg/mL（三糖）和40 μg/mL（四糖）。其中藍色區(qū)域的含量基本在檢出限附近。各寡糖在豆葉的分布均以葉尖為多。

從表1可知， DHB-BuN為基質(zhì)可測定出單糖（葡萄糖）和七糖（β-環(huán)糊精），但在豆葉的質(zhì)譜中并沒有發(fā)現(xiàn)除二糖、三糖、四糖以外的其它單糖和寡糖的質(zhì)譜峰。本方法測定單糖（葡萄糖）的檢出限為0.1 mg/mL， β-環(huán)糊精的檢出限為16 μg/mL。樣品中沒有測出單糖和其它寡糖，說明大豆和豆葉表面這些成分的含量低于檢出限。

4 結(jié) 論

離子液體基質(zhì)DHB-BuN用于MALDI-MS分析寡糖樣品，操作簡便，重復(fù)性和靈敏度優(yōu)于固體基質(zhì)，可用于寡糖的MALDI-MS定量和成像分析。本研究將此離子液基質(zhì)用于MALDI-MS成像，獲得了大豆和豆葉中寡糖分布的質(zhì)譜成像圖。實驗中的大豆切片內(nèi)主要為二糖、三糖和四糖，且分布較為均勻； 豆葉中也僅測出這3種寡糖，且在葉尖部位較多。本方法無需復(fù)雜的樣品前處理過程，能夠直觀反映寡糖的分布和濃度等原位信息，質(zhì)譜檢測背景干擾低。離子液體基質(zhì)DHB-BuN對寡糖類物質(zhì)的MALDI-MS分析在定量和MALDI-MS成像方面具有較好的應(yīng)用潛力。

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