陳成+王宏喜+康虹健+姚要+卿光焱+李秀玲+梁鑫淼

摘 要 本研究采用原子轉(zhuǎn)移自由聚合（Atom-transfer radical-polymerization， ATRP）法合成了一種新型四肽親水作用色譜材料 （Poly-DAPD），用于糖肽的選擇性富集。通過氮?dú)馕摳?、熱重分析和X射線光電子能譜等技術(shù)進(jìn)行表征，結(jié)果表明，四肽已成功接枝到硅球上。固相萃取富集實(shí)驗(yàn)表明，合成的親水材料對牛胎球蛋白（Fetuin）糖肽富集選擇性高； 與商品化ZIC-HILIC材料相比，Poly-DAPD材料富集摻有5摩爾倍數(shù)牛血清蛋白（BSA）的Fetuin樣品時(shí)，在獲得的糖肽數(shù)目及抗干擾性能方面都更具優(yōu)勢。此Poly-DAPD材料可進(jìn)一步用于不同糖蛋白的糖基化分析研究。

關(guān)鍵詞 親水作用色譜； 四肽； 糖肽富集； 質(zhì)譜

1 引 言

蛋白質(zhì)糖基化是糖鏈通過共價(jià)鍵結(jié)合到蛋白上[1]。 糖蛋白參與許多重要的生命進(jìn)程，如免疫應(yīng)答、信息傳遞、細(xì)胞遷移等[2]。糖蛋白上糖鏈的改變會導(dǎo)致其所修飾的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，甚至?xí)?dǎo)致疾病[3]。蛋白質(zhì)的糖基化分析對其生物學(xué)功能及闡明相關(guān)疾病的致病機(jī)理具有重要意義。

蛋白質(zhì)的糖基化分析通常通過質(zhì)譜（Mass spectrometry， MS）分析實(shí)現(xiàn)[4]。雖然生物質(zhì)譜的進(jìn)步推動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，但由于復(fù)雜樣品中糖肽濃度低，以及質(zhì)譜分析中非糖肽對糖肽的離子抑制作用， 蛋白質(zhì)的糖基化分析仍具有挑戰(zhàn)性。因此，發(fā)展合適的糖肽富集方法具有重要意義。

近年來，科研工作者發(fā)展了一些糖肽富集方法，主要包括肼化學(xué)反應(yīng)法[5]、硼酸化學(xué)反應(yīng)法[6]、凝集素親和法[7]和親水作用色譜（Hydrophilic interaction liquid chromatography， HILIC）[8]等。每種方法在糖肽富集方面都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，如凝集素色譜法對糖肽的專一性高，但是只對含有某一類末端糖的糖肽有效。在這些方法中，HILIC因其對糖基化覆蓋率高，方法重現(xiàn)性好，易于與MS聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)[9]而備受關(guān)注。用于糖肽富集的HILIC材料主要包括酰胺基[10]糖基[11]、氨基酸、二肽等[12]。含有不同官能團(tuán)的HILIC材料對糖肽富集的效果也不同，因此，發(fā)展新型親水材料將有助于進(jìn)一步提高糖肽富集的效率。

凝集素親和色譜法是利用肽-糖之間的相互作用通過多重氫鍵和特定的空間實(shí)現(xiàn)凝集素對糖蛋白/糖肽的特異性富集[7]。本研究將四肽引入到聚合物中，擬通過四肽與糖肽間的多重氫鍵作用和電荷可調(diào)控性，實(shí)現(xiàn)糖肽的選擇性富集。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

LC-20AT液相色譜儀（日本島津有限公司）； CS136XT多肽合成儀 （美國希施生物儀器有限公司）； QuadraSorb SI4物理吸附儀（美國康塔儀器公司）； STA 449 F3同步熱分析儀（德國耐馳公司）； ESCALAB 250 Xi光電子能譜儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）； MicroTOF-Q液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（德國布魯克集團(tuán)）； nanoESI Q-TOF MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters 公司）； Milli-Q超純水儀（美國默克密理博公司）。

實(shí)驗(yàn)中所用的溶劑、化學(xué)樣品均購于Merck公司。所有溶液均采用Milli-Q 超純水配制。GELoader 吸頭小柱（德國 Eppendorf公司）； 300硅球、C18HC材料（浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司）； ZIC-HILIC材料（美國BioChem公司）； DAPD由上海杰肽公司合成。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 Poly-DAPD材料的合成 四肽材料的合成采用原子轉(zhuǎn)移自由聚合ATRP法進(jìn)行接枝共聚[13]，反應(yīng)流程見圖1。首先取2 mmol高純度DAPD放入圓底燒瓶，加入15 mL無水N，N-二甲基甲酰胺（DMF），在0℃冰浴攪拌，加入三乙胺穩(wěn)定10 min，再使用恒壓漏斗滴加同三乙胺體積的丙烯酰氯，反應(yīng)30 min，移至常溫?cái)嚢柙俜磻?yīng)24 h，減壓蒸餾去除溶劑，甲醇再溶解后去除溶劑，重復(fù)3次，低溫保存?zhèn)溆?。? g 300 硅球混入HCl，常溫?cái)嚢?8 h，水洗過濾，直到濾液呈中性，真空干燥。稱取干燥后的羥基化硅球1 g，加入無水甲苯，冰浴攪拌并通入N2，滴加10%3-氨丙基三甲氧基硅烷常溫反應(yīng)12 h，反應(yīng)完成后用無水乙醇沖洗，真空干燥。取氨基化的硅球1 g，加入15 mL無水DMF，在0 ℃冰浴攪拌，穩(wěn)定后加入0.3 mL吡啶， 通入N2， 滴加溴代異丁酰溴，避光常溫反應(yīng)12 h。所得產(chǎn)物用DCM多次清洗，真空干燥后密封保存。將0.8 g 酰氯化 DAPD（溶于3 mL純水）和1 g酰溴化的硅球（混于4 mL純水）移至茄型瓶中，超聲混勻后在常溫下密封，液氮凍融循環(huán)，并用油泵抽干空氣?？焖偌尤隒uBr后，通入N2，再加入160 μL N，N，N'，N'，N''-五甲基二亞乙基三胺（PMDETA），等反應(yīng)液變成墨綠色后避光油浴加熱，60℃下反應(yīng)6 h。過濾并轉(zhuǎn)移至錐形瓶， 加入50% 甲醇-水溶液50 mL，加熱冷凝回流24 h， 過濾干燥。合成后的材料通過TGA、XPS、氮?dú)馕摳降燃夹g(shù)進(jìn)行表征或分析。

2.2.2 胎球蛋白和BSA蛋白酶解 分別將1 mg胎球蛋白（Fetuin）和牛血清蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品加入100 μL 6 mol/L 尿素，充分溶解后加入5 μL 200 mmol/L 二硫蘇糖醇，在56℃下振蕩45 min，然后加入20 μL 200 mmol/L 碘代乙酸銨， 避光常溫放置30 min。用50 mmol/L NH4HCO3溶液稀釋10倍，加入胰蛋白酶25 μg， 在37℃反應(yīng)過夜，最后加入5 μL甲酸終止反應(yīng)。所得的酶解液濃度約為1 mg/mL。上述溶液均溶于50 mmol/L NH4HCO3水溶液。

2.2.3 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品酶解液脫鹽 稱取1 mg C18HC 材料加20 μL乙腈混勻，均勻加壓裝填入塞有單層 3M C18膜片的GELoader小柱。所得的固相萃取 （SPE） 小柱首先用20 μL 50% ACN/0.1% FA 溶液沖洗活化，再加入20 μL 0.1% FA 溶液平衡，然后將要去鹽的酶解液上樣。上樣后用40 μL 0.1% FA 溶液淋洗、20 μL 50% ACN/0.1% FA 溶液洗脫。洗脫液進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2.2.4 Poly-DAPD材料和 ZIC-HILIC材料富集糖肽 稱取1 mg Poly-DAPD材料，按2.2.3節(jié)的方法裝填成SPE小柱。將5 μL Fetuin酶解液溶于20 μL 80% ACN/0.1% FA后上樣，再用20 μL 75% ACN/0.1% FA淋洗兩次，最終用20 μL 40% ACN/0.1% FA洗脫。洗脫液進(jìn)行質(zhì)譜分析。ZIC-HILIC材料富集糖肽的實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。

2.2.5 質(zhì)譜分析 Nano ESI Q-TOF MS進(jìn)樣流速為1 μL/min； 正離子模式下， nanospray 電壓為2.5 kV； 掃描范圍為m/z 600～2000。通過整理文獻(xiàn)報(bào)道的糖型和胰蛋白酶酶解后的肽鏈等信息并做成理論糖肽表格[8]，手動(dòng)核對m/z值及電荷數(shù)（±0.3 Da），電荷數(shù)必須一致，部分糖肽由二級質(zhì)譜確認(rèn)。

3 結(jié)果和討論

3.1 Poly-DAPD材料的合成及表征

采用ATRP方法合成了Poly-DAPD，具體合成路線見圖1。合成后的材料通過TGA、XPS、氮?dú)馕摳降葴貎x等進(jìn)行表征。氮?dú)馕摳降葴鼐€表明，硅球樣品呈標(biāo)準(zhǔn)的III型等溫線，而不是Ⅱ型等溫線，曲線沒有拐點(diǎn)，說明硅球上接枝有聚合物（圖2A）； 從圖2B可見，接枝后聚合后孔隙率變小，硅球的孔徑從38 nm變成32 nm（BJH模型），說明接枝到硅球孔中的四肽厚度為3 nm； 熱重分析結(jié)果表明，DAPD 接枝到硅球表面的質(zhì)量為材料質(zhì)量的5.7%（圖3B）。 XPS譜圖顯示所合成聚合物上含有N、C、O等元素，進(jìn)一步說明材料合成成功，（圖3A）。綜上所述，四肽已經(jīng)成功地聚合到硅球上。

3.2 Poly-DAPD材料富集糖肽及其與ZIC-HILIC材料結(jié)果對比

Fetuin是實(shí)驗(yàn)室最常見的一種糖蛋白，因其糖基化位點(diǎn)明確，肽段序列清晰，糖肽數(shù)目相對豐富[15，16]，常被用于評價(jià)合成材料的富集效果。首先將合成的Poly-DAPD材料裝在Eppendorf 凝膠吸頭中，做成SPE微柱。本實(shí)驗(yàn)用Fetuin酶解液在微型SPE模式下評價(jià)了Poly-DAPD材料對糖肽富集的選擇性。圖4A為Fetuin酶解液去鹽液的質(zhì)譜分析譜圖，未經(jīng)過富集的Fetuin酶解液質(zhì)譜圖中大部分信號都是高豐度的非糖肽，糖肽只有兩條，分別是1470.2671（4+）和1634.1296（4+）。圖4B是Poly-DAPD材料富集Fetuin中糖肽后的質(zhì)譜檢測譜圖。對比富集前，富集后樣品中非糖肽數(shù)量從18條減少至6條，且剩下的非糖肽信號豐度均較低； 糖肽數(shù)量從2條增加至 39 條。新材料處理后的樣品中能檢測出較多的糖肽，證明新材料對糖肽富集有一定的選擇性。

為了進(jìn)一步考察Poly-DAPD材料對糖肽富集選擇性， 采用更加復(fù)雜的樣品評價(jià)，并與廣泛用于糖肽富集的商品化材料ZIC-HILIC材料進(jìn)行了對比。采用Poly-DAPD材料富集摻比有5摩爾倍數(shù)的BSA酶解液和Fetuin酶解液的混合物，在優(yōu)化后的富集條件下可檢測到35條Fetuin糖肽（圖5A）。同倍數(shù)摻比BSA， ZIC-HILIC材料則富集到14條Fetuin糖肽，如圖5B所示。兩種材料都富集到糖肽但有所不同，如糖肽1316.1968（3+）在Poly-DAPD材料處理后并未檢測到，說明新材料的選擇性與ZIC-HILIC有所不同。進(jìn)一步對比富集到的共有糖肽的相對豐度，ZIC-HILIC材料富集的糖肽豐度是Poly-DAPD材料結(jié)果（以下豐度對比均以ZIC-HILIC材料富集到最高豐度糖肽1634.1296（4+）為例，在Poly-DAPD材料結(jié)果中該糖肽豐度排行第二）的4倍。但ZIC-HILIC材料富集結(jié)果中最高非糖肽（1057.4550（2+））豐度是糖肽豐度的6倍，而Poly-DAPD材料富集的最高非糖肽豐度（1006.5145（3+））是糖肽豐度的1倍。結(jié)果表明，Poly-DAPD材料比ZIC-HILIC材料富集到的糖肽數(shù)目多21條，其富集結(jié)果受非糖肽的影響也更小。Poly-DAPD材料作為一種新的親水材料，對Fetuin 糖肽選擇性優(yōu)于ZIC-HILIC材料， 并具有一定的抗干擾能力， 證明此材料在實(shí)際樣品糖基化研究當(dāng)中的潛力。

4 結(jié) 論

合成了一種基于四肽的新型 HILIC材料，并對其結(jié)構(gòu)和形貌進(jìn)行了表征。Poly-DAPD對糖肽的富集選擇性顯著高于商品化ZIC-HILIC材料， 表明此新型HILIC材料用于糖肽富集中具有較好的應(yīng)用前景。

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