卓莎+王瑩+亢曉峰

摘 要 本研究利用合成的全-6-季銨基-β-環(huán)糊精（Per-6-quaternary ammonium-β-cyclodextrin，p-QABCD）裝備基因工程化的α-溶血素（α-Hemolysin，αHL）蛋白質(zhì)納米孔（M113R）7，構(gòu)建全新的單分子納米孔反應(yīng)器，在單分子水平實(shí)現(xiàn)對(duì)谷胱甘肽（GSH）和鎘離子（Cd2+）的絡(luò)合反應(yīng)的實(shí)時(shí)原位監(jiān)測(cè)，并辨認(rèn)絡(luò)合反應(yīng)的不同路徑、反應(yīng)中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物。結(jié)果表明，溶液的pH值顯著影響GSH與Cd2+絡(luò)合產(chǎn)物的絡(luò)合比例。pH=7.4時(shí)，GSH與Cd2+絡(luò)合反應(yīng)的最終產(chǎn)物為Cd（GSH）2； pH=9.0時(shí)，最終產(chǎn)物為Cd（GSH）2和Cd2（GSH）2。其中，Cd2（GSH）2的形成遵循兩種路徑：（1）一個(gè)Cd2+首先結(jié)合兩個(gè)GSH分子的巰基形成Cd（GSH）2，然后，第二個(gè)Cd2+結(jié)合去質(zhì)子化的氨基形成Cd2（GSH）2； （2）兩個(gè)Cd2+分別結(jié)合同一個(gè)GSH分子的巰基和去質(zhì)子化的氨基形成Cd2（GSH）1，然后，第二個(gè)GSH分子的巰基和去質(zhì)子化的氨基結(jié)合Cd2（GSH）1的Cd2+形成Cd2（GSH）2。本研究實(shí)現(xiàn)了在單分子水平無(wú)標(biāo)記和無(wú)化學(xué)修飾研究金屬離子和生物小分子的反應(yīng)，對(duì)理解細(xì)胞內(nèi)重金屬的解毒機(jī)理和拓展納米孔單分子技術(shù)的研究領(lǐng)域具有重要意義。

關(guān)鍵詞 納米通道； 單分子檢測(cè)； 全-6-季銨基-β-環(huán)糊精； 谷胱甘肽； 鎘離子

1 引 言

鎘是人體的非必需元素，入侵人體會(huì)結(jié)合含巰基和氨基的蛋白質(zhì)破壞肝和腎臟等器官中酶系統(tǒng)正常的生理功能，干擾細(xì)胞內(nèi)的鈣代謝引起成骨過(guò)程和正常骨代謝的紊亂，降低抗氧化酶的活性造成機(jī)體氧化損傷等[1，2]。谷胱甘肽（Glutathione， γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine， GSH）是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的含巰基三肽，具有獨(dú)特的還原性和親和性，易與入侵人體的Cd2+、Zn2+、Pb2+和Ni2+等重金屬離子結(jié)合形成復(fù)合物并排出體外，是生物體內(nèi)重要的重金屬解毒物質(zhì)[3～7]。因此，研究Cd2+與GSH的相互作用對(duì)探索生物體內(nèi)重金屬離子的生理功能和解毒機(jī)理具有重要意義。

GSH與金屬離子絡(luò)合反應(yīng)的研究已有報(bào)道，主要集中于絡(luò)合反應(yīng)的作用位點(diǎn)和絡(luò)合產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)。常用的研究方法包括核磁共振法（NMR）[8，9]、 吸收光譜法[10]、電位滴定法[11]、熒光法[12]、循環(huán)伏安法（CV）[13，14]、紅外光譜法[15，16]、示差脈沖極譜法（DPP）結(jié)合多變量曲線分析技術(shù)[17]等。GSH含有兩個(gè)羧基（pKa1=2.12， pKa2=3.59 ）、一個(gè)氨基（pKa3=875）和一個(gè)巰基（pKa4=9.65），不同pH值下與金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)不同[18]，因此，絡(luò)合反應(yīng)過(guò)程的研究相對(duì)困難。發(fā)展一種直接、靈敏、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)絡(luò)合反應(yīng)過(guò)程的方法，尤其是在納米空間內(nèi)監(jiān)測(cè)單分子水平的絡(luò)合反應(yīng)的方法，將為GSH與金屬離子相互作用的研究提供新的平臺(tái)。

以蛋白質(zhì)納米孔，如α-溶血素納米孔，作為基礎(chǔ)元件的納米孔單分子檢測(cè)技術(shù)在單分子分析、單分子化學(xué)反應(yīng)研究和DNA測(cè)序等方面具有重要的研究和應(yīng)用價(jià)值，研究對(duì)象包括金屬離子、有機(jī)小分子和DNA等多種物質(zhì)[19～23]。此技術(shù)是基于單個(gè)分子與納米孔相互作用時(shí)納米孔內(nèi)離子電流的改變而建立的單分子分析技術(shù)[24～26]，已成功實(shí)現(xiàn)在單分子水平對(duì)化學(xué)反應(yīng)的中間態(tài)以及反應(yīng)路徑的研究，包括二硫鍵的形成和斷裂[24]，半胱氨酸與有機(jī)砷化合物共價(jià)鍵的形成和斷裂[25]，砷與硫醇取代反應(yīng)中七種產(chǎn)物的相互轉(zhuǎn)化等[26]。但常需要在納米孔中修飾反應(yīng)物，容易受到分子構(gòu)象的影響。本研究將合成的帶正電的全-6-季銨基-β-環(huán)糊精分子適配器嵌入（M113R）7 αHL蛋白質(zhì)納米孔中，作為納米反應(yīng)器和傳感器研究Cd2+與GSH的絡(luò)合比例和反應(yīng)中間產(chǎn)物，并成功區(qū)分不同絡(luò)合比例的絡(luò)合產(chǎn)物，揭示了Cd2+與GSH的反應(yīng)路徑。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Axopatch 200B膜片鉗放大器和1440A A/D 數(shù)字轉(zhuǎn)換器（美國(guó)Axon Instruments公司）； 4040A函數(shù)發(fā)生器（美國(guó)BK Precision公司）； UltiMate3000液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用電噴霧四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Dionex公司）。

植烷酸卵磷脂（DPhPC，美國(guó)Avanti Polar Lipids公司）； 戊烷（99.7%，美國(guó)Honeywell Burdick & Jackson公司）； 聚四氟乙烯膜（Teflon膜， 英國(guó)Goodfollow公司）； 正十六烷（99%）、谷胱甘肽（≥98%）、碘甲烷（99%）、KCl（≥99.0%）、CdCl2（≥98%）、 KOH（≥85%）、甲酸（≥95%）、甲醛（≥36.0%）、二甲基甲酰胺（≥99%）、四氫呋喃（≥99.9%）和全-6-氨基-β-環(huán)糊精（Per-6-amino-β-cyclodextrin，98%），均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

2.2 全-6-季銨基-β-環(huán)糊精（Per-6-quaternary ammonium-β-cyclodextrin，p-QABCD）的合成[27]

取0.2360 g全-6-氨基-β-環(huán)糊精（Per-6-amino-β-cyclodextrin）與15.0 mL甲酸、8.0 mL甲醛和15.0 mL H2O混合，70℃下攪拌反應(yīng)18 h。反應(yīng)結(jié)束后，混合物真空干燥得到全-6-叔胺基-β-環(huán)糊精。將制備的全-6-叔胺基-β-環(huán)糊精和0.0150 g KOH懸浮在二甲基甲酰胺溶液中，添加300 μL碘甲烷，4℃，N2保護(hù)下反應(yīng)4 h。將反應(yīng)后的混合物減壓濃縮到10.0 mL，添加60.0 mL四氫呋喃沉淀產(chǎn)物。四氫呋喃多次洗滌沉淀并真空干燥獲得白色的p-QABCD固體。ESI-MS表征：[M]7+ m/z 208.4。

2.3 （M113R）7 αHL蛋白質(zhì)納米孔制備[28]

M113R αHL單體采用大腸桿菌BL21（DE3）pLysS原核表達(dá)制備，超濾離心純化，并進(jìn)一步在兔血紅細(xì)胞膜上組裝成（M113R）7 αHL七聚體。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法[29]

中間有微米級(jí)小孔（直徑120～150 μm）的Telfon膜將電解池分為兩個(gè)腔室，用戊烷-正十六烷混合液（99∶1， V/V）預(yù)處理小孔使孔周圍為疏水界面，電解池兩端分別加入1 mL緩沖液（1 mol/L KCl， 10 mmol/L Tris-HCl， pH 7.4或pH 9.0）和一滴DPhPC，插入兩根Ag/AgCl電極，靜置5 min，加入0.5 mL緩沖液，使液面沒過(guò)小孔，并在孔上形成磷脂雙分子層。電解池一端加入終濃度為0.05～0.3 ng/mL的（M113R）7 αHL蛋白質(zhì)（cis端，接地），另一端施加電壓（trans端），待蛋白質(zhì)擴(kuò)散至小孔附近并插入脂雙層形成單通道后，體系形成導(dǎo)通回路。膜片鉗放大器采集電流信號(hào)，采樣頻率為100 kHz，濾波頻率3 kHz。pClamp 10.3和Origin 8.5軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，平均滯留時(shí)間（τoff）、捕獲頻率（1/τon）經(jīng)相應(yīng)的事件數(shù)柱狀圖單指數(shù)擬合得到，平均阻塞電流值（I）經(jīng)電流與事件數(shù)柱狀圖高斯擬合得到。

3 結(jié)果與討論

3.1 分子適配器p-QABCD裝備的（M113R）7 αHL納米孔分別檢測(cè)Cd2+和GSH （M113R）7αHL納米孔是常用的突變型αHL納米孔[30]，由7個(gè)113位的甲硫氨酸被精氨酸取代后的αHL單體聚合而成，腔內(nèi)最窄處為7個(gè)精氨酸構(gòu)成的正電荷環(huán)狀結(jié)構(gòu)，易于捕獲帶負(fù)電的分子或減小帶負(fù)電分子的穿孔速度。Cd2+與GSH的絡(luò)合物進(jìn)入（M113R）7 αHL納米孔，無(wú)電流響應(yīng)信號(hào)。為了檢測(cè)Cd2+-GSH絡(luò)合物，將p-QABCD作為分子適配器嵌入（M113R）7 αHL納米孔形成新型納米反應(yīng)器和傳感器，即p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔（圖 1A）。納米孔的最窄處形成第二個(gè)正電荷的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通道內(nèi)徑明顯縮小，靜電作用位點(diǎn)增多，易于捕獲Cd2+-GSH絡(luò)合物。

檢測(cè)電壓為+160 mV時(shí)，（M113R）7αHL通道開放電流I0=（155.32 ± 5.11）pA（Level 0； 圖1B）。 p-QABCD在電壓驅(qū)動(dòng)下從trans端嵌入納米孔時(shí)，通道電流變?yōu)镮1=（61.35 ± 4.12）pA（Level 1； 圖1C）。將Cd2+加入trans端或?qū)ж?fù)電的GSH加入cis端，無(wú)電流響應(yīng)信號(hào)產(chǎn)生（圖1D和1E）。結(jié)果表明， Cd2+或GSH單獨(dú)進(jìn)入p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔時(shí)不能引起電流的明顯變化，推測(cè)原因是Cd2+和GSH的體積太小或穿過(guò)納米孔的速度太快，現(xiàn)有的儀器分辨率不能捕獲到明顯的電流信號(hào)。

3.2 p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔監(jiān)測(cè)Cd2+與GSH的反應(yīng)進(jìn)程

pH=9.0時(shí)，cis端加入GSH分子，trans端加入Cd2+，在正電壓的驅(qū)動(dòng)下， GSH和Cd2+進(jìn)入納米孔并在納米孔或p-QABCD內(nèi)部相遇（圖 2A）發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，產(chǎn)生5種類型的電流信號(hào)，如圖2B和2C中Ⅰ～Ⅴ所示，包含兩種無(wú)過(guò)渡態(tài)的信號(hào)（Ⅰ和Ⅱ）和3種有過(guò)渡態(tài)的信號(hào)（Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ）。推測(cè)無(wú)過(guò)渡態(tài)信號(hào)（Ⅰ和Ⅱ）是由Cd2+與GSH在納米孔的大腔中相遇發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)后形成的絡(luò)合物被p-QABCD捕獲產(chǎn)生； 有過(guò)渡態(tài)信號(hào)（Ⅲ，Ⅳ和Ⅴ）是由Cd2+與GSH分子直接在p-QABCD內(nèi)部相遇并逐步發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)生，p-QABCD作為傳感器記錄絡(luò)合反應(yīng)過(guò)程。這5種信號(hào)集中在3個(gè)電流平臺(tái)，分別為I2A = （42.52 ± 3.27） pA （Level 2A）； I2B = （34.21 ± 2.21） pA （Level 2B）； I2C = （24.52 ± 3.08） pA （Level 2C）； 相應(yīng)的平均滯留時(shí)間τoff分別為τoff2A = （0.07 ± 0.01） ms； τoff2B = （0.26 ± 0.03） ms； τoff2C = （0.34 ± 0.04） ms（圖2D～2G）。結(jié)果表明，pH=9.0時(shí)，Cd2+與GSH絡(luò)合反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生3種不同結(jié)構(gòu)的絡(luò)合中間產(chǎn)物或最終產(chǎn)物。

文獻(xiàn)[9～17]表明，GSH的巰基與金屬離子的結(jié)合幾乎不受pH值的影響，而去質(zhì)子化的氨基與金屬離子的結(jié)合受pH值影響較大，在堿性條件下才會(huì)與金屬發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。因此，為了確認(rèn)3種絡(luò)合中間產(chǎn)物或最終產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，在pH=7.4和pH=9.0時(shí)，將不同濃度比的Cd2+與GSH同時(shí)加入cis端，使其在本體溶液中形成絡(luò)合最終產(chǎn)物，記錄絡(luò)合最終產(chǎn)物進(jìn)入p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔的電流響應(yīng)信號(hào)。

3.3 p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔檢測(cè)Cd2+-GSH 絡(luò)合最終產(chǎn)物

3.3.1 pH=7.4時(shí)， p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔檢測(cè)Cd2+-GSH絡(luò)合最終產(chǎn)物pH=7.4時(shí)，將Cd2+和GSH同時(shí)加入cis端，二者在電解液中反應(yīng)形成絡(luò)合最終產(chǎn)物并進(jìn)入p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔，只產(chǎn)生一種電流信號(hào)I2=（33.32±2.08） pA，τoff2 = （0.24±0.13） ms（Level 2； 圖3A～3D），結(jié)果表明，pH=7.4時(shí)絡(luò)合反應(yīng)的產(chǎn)物只有1種。圖3E表明，固定cis端GSH濃度為20 μmol/L， 隨著Cd2+濃度增加，事件頻率呈現(xiàn)先增大后穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)Cd2+與GSH濃度比<0.5時(shí)， Level 2事件頻率呈線性增加，當(dāng)濃度比>0.5時(shí)，Level 2事件頻率趨于定值。結(jié)合文獻(xiàn)[9，14，17]，Level 2由絡(luò)合產(chǎn)物Cd（GSH）2產(chǎn)生。與GSH分子相比，Cd（GSH）2具有更大的分子結(jié)構(gòu)并且在穿孔時(shí)有4個(gè)離子化的羧基與p-QABCD相互作用，易被捕獲引起電流變化。Level 2的電流值和滯留時(shí)間與圖2中Level 2B相似（I2B = （34.21 ± 2.21）pA； τoff2B = （0.26 ± 0.03） ms），表明Level 2B由絡(luò)合產(chǎn)物Cd（GSH）2產(chǎn)生。

3.3.2 pH=9.0時(shí)，p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔檢測(cè)Cd2+-GSH絡(luò)合最終產(chǎn)物 pH=9.0時(shí)，同樣將Cd2+和GSH同時(shí)加入cis端，共產(chǎn)生兩種類型的電流信號(hào)： I3=（34.71 ±2.12） pA，τoff3 = （0.23±0.03） ms （Level 3） 和I4=（24.32±3.08） pA，τoff4 = （0.30±0.03） ms （Level 4）（圖4A～4E），結(jié)果表明，pH=9.0時(shí)，Cd2+與GSH絡(luò)合反應(yīng)有兩種產(chǎn)物。其中Level 3與圖3中Cd（GSH）2的電流值和滯留時(shí)間接近（I2=（33.32±2.08）pA，τoff2 = （0.24±0.13） ms），表明Level 3是由絡(luò)合產(chǎn)物Cd（GSH）2產(chǎn)生。圖4F表明，固定cis端GSH濃度為20 μmol/L，隨著Cd2+濃度增加，絡(luò)合產(chǎn)物的相對(duì)比例發(fā)生明顯改變。當(dāng)Cd2+與GSH的濃度比低于0.5時(shí)，電流平臺(tái)以Level 3為主，即絡(luò)合產(chǎn)物Cd（GSH）2； 當(dāng)濃度比在0.5～1.0之間時(shí)，Level 3的事件頻率減小，Level 4的事件頻率增大； 當(dāng)濃度比>1時(shí)，Level 3和Level 4的事件頻率趨于定值，以電流值較小的Level 4為主，表明產(chǎn)生Level 4的絡(luò)合產(chǎn)物具有比Cd（GSH）2 （Level 3）更大的分子結(jié)構(gòu)，結(jié)合文獻(xiàn)[10，13，14]，表明Level 4是由絡(luò)合產(chǎn)物Cd2（GSH）2產(chǎn)生。Level 4與圖2中Level 2C的電流值和滯留時(shí)間相似（I2C = （24.52 ± 3.08） pA； τoff2C = （0.34 ± 0.04） ms），表明Level 2C是由絡(luò)合產(chǎn)物Cd2（GSH）2產(chǎn)生的。

3.4 鎘離子與谷胱甘肽的反應(yīng)進(jìn)程分析

上述實(shí)驗(yàn)表明，絡(luò)合最終產(chǎn)物Cd（GSH）2和Cd2（GSH）2的電流響應(yīng)信號(hào)與監(jiān)測(cè)絡(luò)合反應(yīng)進(jìn)程中的Level 2B 和Level 2C的電流值與滯留時(shí)間相似， Level 2B和Level 2C的信號(hào)分別是由Cd（GSH）2和Cd2（GSH）2產(chǎn)生。文獻(xiàn)[9～17]表明，pH=9.0，GSH的巰基與去質(zhì)子化的氨基均會(huì)與金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，但巰基與氨基很難絡(luò)合同一種金屬離子，因此推測(cè)Level 2A的信號(hào)由中間產(chǎn)物Cd（GSH）1或Cd2（GSH）1產(chǎn)生。典型的電流信號(hào)Ⅰ～Ⅴ表面，Cd2（GSH）2的形成遵循兩種路徑：（1）1個(gè)Cd2+首先結(jié)合2個(gè)谷胱甘肽分子的巰基，形成Cd（GSH）2，然后，第二個(gè)Cd2+結(jié)合去質(zhì)子化的氨基形成Cd2（GSH）2（TypeⅠ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ； 圖2D）； （2）2個(gè)Cd2+分別結(jié)合同一個(gè)GSH分子的巰基和去質(zhì)子化的氨基，形成Cd2（GSH）1，然后，第二個(gè)GSH分子的巰基和去質(zhì)子化的氨基與Cd2（GSH）1的Cd2+結(jié)合形成Cd2（GSH）2（TypeⅡ和Ⅴ； 圖2D）。

3.5 p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔檢測(cè)其它金屬離子與GSH的絡(luò)合反應(yīng)

pH=9.0時(shí)，cis端加入GSH，trans端分別加入金屬離子Pb2+、Zn2+和Ni2+。GSH與金屬離子在納米孔或p-QABCD中相遇并發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)生的典型電流信號(hào)如圖5所示，均只產(chǎn)生兩種類型的電流信號(hào)。GSH與Pb2+絡(luò)合產(chǎn)物的電流平臺(tái)集中在（21.27 ± 1.27） pA和（32.12 ± 1.04） pA，GSH與Zn2+絡(luò)合產(chǎn)物的電流平臺(tái)集中在（25.63 ± 2.02） pA和（36.35 ± 1.07） pA，GSH與Ni2+絡(luò)合產(chǎn)物的電流平臺(tái)集中在（26.73 ± 2.07） pA和（37.16 ± 1.12） pA，表明這3種金屬離子與谷胱甘肽的絡(luò)合產(chǎn)物為兩種，但是均未產(chǎn)生有過(guò)渡態(tài)的電流信號(hào)，因此，p-QABCD-（M113R）7 αHL納米孔不能觀測(cè)到GSH與Pb2+、Zn2+或Ni2+絡(luò)合反應(yīng)的中間過(guò)程。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，p-QABCD-（M113R）7αHL作為納米反應(yīng)器和傳感器，能在單分子水平上特異性地檢測(cè)Cd2+與GSH的反應(yīng)中間產(chǎn)物并監(jiān)測(cè)反應(yīng)路徑。

4 結(jié) 論

本研究采用分子適配器p-QABCD裝備基因工程化的（M113R）7αHL蛋白質(zhì)納米孔，構(gòu)建全新的單分子納米反應(yīng)器和傳感器，實(shí)現(xiàn)在單分子水平對(duì)Cd2+與GSH的反應(yīng)中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物的識(shí)別以及反應(yīng)路徑的特異性監(jiān)測(cè)。研究結(jié)果表明，pH=7.4時(shí)，Cd2+與GSH的絡(luò)合產(chǎn)物僅為Cd（GSH）2，pH=9.0時(shí)有兩種絡(luò)合產(chǎn)物，分別為Cd（GSH）2和Cd2（GSH）2。通過(guò)分析Cd2+與GSH絡(luò)合進(jìn)程中的電流響應(yīng)信號(hào)，揭示了Cd2（GSH）2的生成路徑。本研究拓展了蛋白質(zhì)納米孔在單分子檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單分子反應(yīng)的反應(yīng)進(jìn)程和探索復(fù)雜反應(yīng)的反應(yīng)路徑提供了新思路。

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