王瑋+江輝+劉國海+梅從立+吉奕

摘 要 提出了一種基于近紅外光譜分析技術(shù)的酵母菌生長過程描述方法。利用Antaris Ⅱ型傅里葉變換近紅外光譜儀獲取酵母菌培養(yǎng)過程中，發(fā)酵物樣本在10000～4000 cm1范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)，同時采用光電比濁法測定各樣本的光密度（Optical density， OD）值； 運用競爭性自適應(yīng)重加權(quán)采樣（Competitive adaptive reweighted sampling， CARS）算法優(yōu)選特征光譜，再利用極限學(xué)習(xí)機(jī)（Extreme learning machine， ELM）建立酵母菌生長過程4個階段的分類模型。研究結(jié)果顯示，參與CARS-ELM模型建立的波長個數(shù)為30，其10次運行在訓(xùn)練集和測試集中的平均識別率分別為98.68%和97.37%。研究結(jié)果表明，利用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計量學(xué)方法描述酵母菌生長過程是可行的。

關(guān)鍵詞 酵母菌； 近紅外光譜； 競爭性自適應(yīng)重加權(quán)采樣法； 極限學(xué)習(xí)機(jī)

1 引 言

在全球能源逐漸匱乏的大環(huán)境下，利用酵母菌發(fā)酵生物質(zhì)產(chǎn)酒精作為能源替代品越來越引起重視。在工業(yè)生產(chǎn)過程中，酵母菌生長過程的測定對發(fā)酵具有重要的指導(dǎo)作用[1～3]。目前，酵母菌檢測的方法主要有血球計數(shù)板計數(shù)法和平板菌落計數(shù)法等， 這些方法雖然檢測過程直觀、快速，但檢測結(jié)果受操作人員因素影響較大，其穩(wěn)定性和均一性難以保證[4]。

近紅外光是介于紫外可見光和中紅外光之間的電磁波，其光譜信息主要來自有機(jī)物中含氫基團(tuán)倍頻與合頻的吸收，不同基團(tuán)或同一基團(tuán)在不同化學(xué)環(huán)境中的近紅外吸收波長與強(qiáng)度都有明顯差別，適用于有機(jī)化合物理化參數(shù)的間接測量[5～7]。在酵母菌培養(yǎng)過程中，基質(zhì)中的有機(jī)物大分子包含了大量的含氫基團(tuán)[8]。近年來，已有一些學(xué)者利用近紅外光譜分析技術(shù)對微生物發(fā)酵過程中的底物、產(chǎn)物和生物量濃度進(jìn)行檢測，取得了較理想的結(jié)果[9～11]。而在利用近紅外光譜分析技術(shù)對微生物生長過程動態(tài)跟蹤方面的研究卻鮮有報道。大量研究表明，近紅外光譜信息是由很多弱的、寬的、非特征重疊譜帶所構(gòu)成[12]， 這些光譜信息包含了很大數(shù)目的波長變量，這些波長變量有些是無信息變量和冗余變量，波長變量之間也存在著很嚴(yán)重的線性關(guān)系[13]。這些波長變量不僅會增大計算量，而且對光譜的有用信息進(jìn)行干擾，從而降低模型的預(yù)測能力。因此，在利用近紅外光譜分析技術(shù)對酵母菌生長過程進(jìn)行定性分析時，光譜特征和化學(xué)計量學(xué)模型的選擇與優(yōu)化至關(guān)重要，直接影響最終檢測結(jié)果的精度[12]。因此，本研究提出基于近紅外光譜分析技術(shù)的酵母菌生長過程快速描述方法。采用競爭性自適應(yīng)重加權(quán)采樣（Competitive adaptive reweighted sampling， CARS）算法篩選預(yù)處理后的近紅外光譜特征波長，然后利用極限學(xué)習(xí)機(jī)（Extreme learning machine， ELM）建立酵母菌生長過程4個時期的識別模型，實現(xiàn)了利用近紅外光譜分析技術(shù)高精度檢測酵母菌生長狀態(tài)。

2 實驗部分

2.1 酵母菌培養(yǎng)及數(shù)據(jù)采集

2.1.1 酵母菌的擴(kuò)大培養(yǎng) 從上海瑞楚生物科技有限公司購買工業(yè)發(fā)酵酵母菌種1 mL，再配制麥芽汁培養(yǎng)基，然后將原代酵母菌菌種接種到培養(yǎng)基中做平行擴(kuò)大培養(yǎng)，每次取生長狀況良好的菌種作為下一次接種母菌，直到培養(yǎng)得到酵母菌種40 mL結(jié)束。

2.1.2 酵母菌的分裝培養(yǎng) 酵母菌擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)束后，分別在3個250 mL 容量瓶內(nèi)裝入125 mL 無菌麥芽汁培養(yǎng)基和0.5 mL 酵母菌懸液，分別將3個容量瓶標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h，溫度設(shè)置為28℃，轉(zhuǎn)速為110 r/min。按以上方案共進(jìn)行6批酵母菌培養(yǎng)實驗。

2.1.3 數(shù)據(jù)采集 在酵母菌培養(yǎng)過程中，從接種開始每隔4 h采樣一次，共有19個采樣時間點（即0， 4， 8， ……72 h）。為了避免采樣次數(shù)過多而引起容量瓶內(nèi)發(fā)酵污染，采樣時，將19個采樣時間點分為三部分，即0～24 h、28～48 h和52～72 h時間內(nèi)的采樣分別在容量瓶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中進(jìn)行。這樣每批實驗可獲得19個樣本數(shù)據(jù)。共進(jìn)行6批實驗，可獲得114個樣本。

2.2 光譜采集

采用Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀（美國Thermo Scientific公司）的透射模式采集各樣本的近紅外光譜數(shù)據(jù)。光譜采集時，室內(nèi)溫度保持在25℃左右，濕度基本恒定。樣品池采用光程5 mm標(biāo)準(zhǔn)管，掃描次數(shù)為32次，分辨率為8 cm1，掃描波數(shù)范圍為10000～4000 cm1。每個樣本采集3次，取其平均光譜作為該樣本的原始光譜。

2.3 光電比濁法測定OD值

在樣本光密度（Optical density， OD）值測定時，首先將UV-2204PC型紫外可見分光光度計的波長設(shè)置為600 nm，透光率調(diào)為100%，取光程為1 cm比色皿裝入3.5 mL無菌麥芽汁培養(yǎng)基為對照組； 樣本溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，移入比色皿測量其OD值。每個樣本測量3次，再取其平均值。若樣本溶液過稠，需稀釋后再進(jìn)行測量，使得OD值保持在0.1～0.65之間[14，15]。

2.4 數(shù)據(jù)分析方法

2.4.1 競爭性自適應(yīng)重加權(quán)采樣算法 為了消除光譜變量之間的冗余和共線性信息，需要對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行變量篩選。競爭性自適應(yīng)重加權(quán)采樣（Competitive adaptive reweighted sampling ， CARS）是模擬達(dá)爾文進(jìn)化論中“適者生存”原則[16]，通過蒙特卡羅采樣法隨機(jī)選擇80%的樣本，建立偏最小二乘法（Partial least square， PLS）模型，保留回歸系數(shù)絕對值大的波長點，同時去除權(quán)重小的波長點，多次重復(fù)篩選后，選出交叉驗證均方根誤差RMSECV最小的變量子集，即為特征波長變量[17，18]。

2.4.2 極限學(xué)習(xí)機(jī)判別分析法 極限學(xué)習(xí)機(jī)算法（Extreme learning machine， ELM）是由新加坡南洋理工大學(xué)的Huang等[19]提出的一種針對單隱含層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)算法。該算法能隨機(jī)產(chǎn)生輸入層與隱含層之間的連接權(quán)值和隱含層神經(jīng)元的閾值，并且在訓(xùn)練過程中無需調(diào)整，只需設(shè)置隱含層神經(jīng)元的個數(shù)，就可以獲得唯一的最優(yōu)解，克服了傳統(tǒng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練速度慢、易陷入局部最優(yōu)的問題[20]，并以其學(xué)習(xí)速度快、泛化性能好等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于模式分類領(lǐng)域。

3 結(jié)果與討論

3.1 光譜分析

酵母菌發(fā)酵液主要是由蛋白質(zhì)、碳水化合物等大分子化合物和乙醇組成[21]。其中，碳水化合物的主要吸收波段在6298.4～5650.4 cm1之間，蛋白質(zhì)的主要吸收波段在6506.4～6776.6 cm1之間，乙醇的主要吸收波段在7154.6～6954.1 cm1和9997.2～9981.7 cm1之間[22]。圖1A為所有酵母菌發(fā)酵液樣本的原始光譜圖。從圖1可見，不同時間段獲取的酵母菌發(fā)酵液樣本的光譜吸收峰基本與文獻(xiàn)[22]描述的大分子化合物的吸收波段范圍吻合，很好地反映了酵母菌培養(yǎng)過程中大分子有機(jī)化合物的微量變化，這為近紅外光譜分析技術(shù)用于酵母菌發(fā)酵過程定性分析提供了理論依據(jù)。

為了消除發(fā)酵液中固態(tài)顆粒及光散射等因素對采集光譜的影響，研究采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換（Standard normal variate transformation， SNV）對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，該方法可有效消除液態(tài)樣品中懸浮顆粒及光程變化等外部因素對光譜采集的影響[23，24]。SNV預(yù)處理光譜圖如圖1B所示。

3.2 酵母菌生長曲線及樣本集劃分

為了直觀地反映酵母菌的動態(tài)生長過程，本研究根據(jù)各采樣時間點所測的樣本OD值擬合出酵母菌的生長曲線。如圖2所示，0～8 h為酵母菌生長的遲滯期，8～28 h為酵母菌生長的對數(shù)期，28～60 h為酵母菌生長的穩(wěn)定期，60～72 h為酵母菌生長的衰亡期，很好地反映了酵母菌的4個生長階段。

在模型校正過程中，將前4批實驗獲取的樣本作為訓(xùn)練集，后兩批實驗獲取的樣本作為獨立測試集，用于校正模型的驗證。表1列出了酵母菌生長過程中采集的所有樣本的OD值在訓(xùn)練集和測試集中的分布情況。

3.3 光譜變量篩選

圖3呈現(xiàn)了應(yīng)用CARS算法對預(yù)處理后的光譜進(jìn)行特征波長篩選的過程。從圖3A可見，隨著采樣次數(shù)增加，被保留的波長變量呈指數(shù)規(guī)律衰減，較好地反映了CARS算法在執(zhí)行時對變量粗選和精選的過程。圖3B為CARS采樣過程中，交互驗證均方根誤差（RMSECV）隨采樣次數(shù)的變化情況。從圖3B可見，當(dāng)采樣次數(shù)為28時，RMSECV值達(dá)到最?。?.1736）； 此時，入選的波長變量數(shù)為30，它們在全光譜區(qū)域的分布如圖4所示。對上述篩選變量的NIR吸收譜帶解析為：5650.4， 5932.0， 5935.8， 5939.7， 5943.5， 6059.2， 6159.5和6298.4 cm1是位于CH基團(tuán)一級倍頻振動吸收的波段范圍； 6506.4， 6564.2， 6583.8， 6587.6， 6595.4， 6599.2， 6618.2， 6695.6， 6699.5，6768.9， 6772.8和6776.6 cm1為胺基NH鍵伸縮振動的一級倍頻附近； 6954.1， 6957.9， 6996.5， 7089.0， 7131.5， 7154.6 cm1和9981.7， 9985.6， 9989.5， 9997.2 cm1分別位于醇類OH基團(tuán)伸縮振動的一級和二級倍頻附近。分析上述篩選的30個波長變量的波數(shù)可知，這些波數(shù)光譜基本都在酵母菌發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)、碳水化合物等大分子和乙醇的光譜主要吸收波段內(nèi)。因此，利用CARS算法篩選的特征波長變量能較好地反映酵母菌培養(yǎng)過程中基質(zhì)中有機(jī)物的微量變化。

3.4 ELM判別模型建立及預(yù)測

選用經(jīng)CARS算法優(yōu)選后的30個特征波長變量建立ELM判別模型，完成酵母菌生長階段的定性描述。在ELM模型建立過程中，其隱含層神經(jīng)元個數(shù)K是影響其性能的重要參數(shù)。因此，在ELM模型建立過程中需對其進(jìn)行優(yōu)化。研究初始化K=10，并以11為間隔增加，依據(jù)模型在訓(xùn)練集和測試集中的預(yù)測正確率來確定最佳的隱含層神經(jīng)元個數(shù)。由于ELM算法權(quán)重初始化時具有隨機(jī)性，因此，針對每個K，研究均運行10次，取其中5次預(yù)測效果較好模型的記錄于表2中。從表2可知，當(dāng)K=43時，訓(xùn)練集和測試集的平均預(yù)測準(zhǔn)確率分別達(dá)到了100%和99.47%，性能最佳。因此，最終確定為K=43。確定ELM算法關(guān)鍵參數(shù)后，10次運行ELM，其在訓(xùn)練集中的平均預(yù)測準(zhǔn)確率為98.68%，在訓(xùn)練集中的平均預(yù)測正確率為97.37%，很好地對酵母菌生長的4個階段進(jìn)行有效區(qū)分。

4 結(jié) 論

本研究利用近紅外光譜分析技術(shù)實現(xiàn)酵母菌培養(yǎng)過程的動態(tài)監(jiān)測。利用CARS算法對預(yù)處理后的光譜進(jìn)行特征波長篩選，優(yōu)化ELM隱含層神經(jīng)元數(shù)，最后建立酵母菌生長過程定性識別模型。結(jié)果表明，建立在由CARS篩選法30個特征波長變量基礎(chǔ)上的最佳ELM識別模型， 10次運行在測試集中的平均識別率達(dá)到97.37%。因此，利用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合合適的化學(xué)計量學(xué)方法快速監(jiān)測酵母菌生長過程是可行的。本研究結(jié)果為酵母菌生長過程的快速在線監(jiān)測提供了技術(shù)支持。

References

1 Yu J， Xu Z， Tan T. Fuel Process. Technol.， 2008， 89（11）： 1056-1059

2 Sablayrolles J M. Pandey A， Rao L V， Soccol C R. Food Res. Int.， 2009， 42（4）： 418-424

3 Doran J B， Cripe J， Sutton M， Foster B. Appl. Biochem. Biotechnol.， 2000， 84-86（1）： 141-152

4 Wu Y J， Jin Y， Li Y R， Sun D， Liu X S， Chen Y. Vib. Spectrosc.， 2012， 58（1）： 109-118

5 TAO Lin-Li， YANG Xiu-Juan， DENG Jun-Ming， ZHANG Xi. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2013， 33（11）： 3002-3009

陶琳麗， 楊秀娟， 鄧君明，張 曦. 光譜學(xué)與光譜分析， 2013， 33（11）： 3002-3009

6 ZHANG Li-Juan， WU Wei， QIU Lin， LIU Ying. Modern Instrument & Medical Treatment， 2012， 18（4）： 76-79

張麗娟， 吳 煒， 邱 琳， 劉 瑩. 現(xiàn)代儀器與醫(yī)療， 2012， 18（4）： 76-79

7 CHEN Huan-Wen， HU Bin， ZHANG Xie. Chinese J. Anal.Chem.， 2010， 38（8）： 1069-1088

陳煥文， 胡 斌， 張 燮. 分析化學(xué)， 2010， 38（8）： 1069-1088

8 XU Bao-Cheng， LIU Jian-Xue， YI Jun-Peng， ZHONG Xian-Feng， CUI Guo-Ting. China Brewing， 2007， 26（3）： 8-10

徐寶成， 劉建學(xué)， 易軍鵬， 鐘先鋒， 崔國庭. 中國釀造， 2007， 26（3）： 8-10

9 HUANG Chang-Yi， FAN Hai-Bin， LIU Fei， XU Gan-Rong. Journal of Instrumental Analysis， 2014， 33（5）： 520-526

黃常毅， 范海濱， 劉 飛， 許贛榮. 分析測試學(xué)報， 2014， 33（5）： 520-526

10 ZHANG Shu-Ming， YANG Yang，NI Yuan-Ying. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2012， 32（11）： 2997-3001

張樹明， 楊 陽， 倪元穎. 光譜學(xué)與光譜分析， 2012， 32（11）： 2997-3001

11 PENG Bang-Zhu， YUE Dian-Li， YUAN Ya-Hong， GAO Zhen-Peng. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2009， 29（3）： 652-655

彭幫柱， 岳田利， 袁亞宏， 高振鵬. 光譜學(xué)與光譜分析， 2009， 29（3）： 652-655

12 LIU Guo-Hai， XIA Rong-Sheng， JAING Hui， MEI Cong-Li， HUANG Yong-Hong. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2014， 34（8）： 2094-2097

劉國海， 夏榮盛， 江 輝， 梅叢立， 黃永紅. 光譜學(xué)與光譜分析， 2014， 34（8）： 2094-2097

13 Blanco M， Coello J， Iturriaga H， Maspoch S， González Baó R. Analyst， 2000， 50（1）： 75-82

14 LI Qin. Light Ind. Sci. Technolo.， 2014， （8）： 7-8

李 勤. 輕工科技， 2014， （8）： 7-8

15 LI Li， YANG Ze-Xian， WANG Su-Xia， DU Jin-Min. Feed Res.， 2015， （1）： 71-73

李 麗， 楊澤賢， 王素霞， 杜進(jìn)民. 飼料研究， 2015， （1）： 71-73

16 Fan W， Shan Y， Li G Y， Lyu H Y， Li H D， Liang Y Z. Food Anal. Method， 2012， 5（3）： 585-590

17 Xie C， Ning X， ShaoY， He Y. Spectrochim. Acta A， 2015， 149 ： 971-977

18 Tang G， Huang Y， Tian K D， Song X Z， Yan H， Hu J， Xiong Y M， Min S G. Analyst， 2014， 139（19）： 4894-4902

19 Huang G B， Zhu Q Y， Siew C K. Neurocomputing， 2006， 70（1-3）： 489-501

20 SHI Feng， WANG Hui， YU Lei， HU Fei. MATLAB Intelligence Algorithm-30 Case Analysis. Beijing： Beihang University Press， 2011： 290-302

史 峰， 王 輝， 郁 磊， 胡 斐. MATLAB智能算法-30個案例分析. 北京： 北京航空航天大學(xué)出版社， 2011： 290-302

21 HAN Run-Ping， BAO Gai-Ling， ZHU Lu. Spectroscopy and Spectral Analysis， 2004， 24（7）： 820-822

韓潤平， 鮑改玲， 朱 路. 光譜學(xué)與光譜分析， 2004， 24（7）： 820-822

22 LU Wan-Zhen. Modern Near Infrared Spectroscopy Analytical Technology （Second Edition）. China Petrochemical Press， 2007： 30-32

陸婉珍. 現(xiàn)代近紅外光譜分析技術(shù) （第2版）. 中國石化出版社， 2007： 30-32

23 Bi Y M， Yuan K L， Xiao W Q， Wu J Z， Shi C Y， Xia J， Chu G H， Zhang G X， Zhou G J. Anal. Chim. Acta， 2016， 909： 30-40

24 Barnes R J， Dhanoa M S， Lister S J. Appl. Spectrosc.， 1989， 43（5）： 772-777