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        近紅外光譜法定性描述酵母菌的生長過程

        2017-08-14 20:25:52王瑋江輝劉國海梅從立吉奕
        分析化學(xué) 2017年8期
        關(guān)鍵詞:酵母菌生長模型

        王瑋+江輝+劉國海+梅從立+吉奕

        摘 要 提出了一種基于近紅外光譜分析技術(shù)的酵母菌生長過程描述方法。利用Antaris Ⅱ型傅里葉變換近紅外光譜儀獲取酵母菌培養(yǎng)過程中,發(fā)酵物樣本在10000~4000 cm1范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù),同時采用光電比濁法測定各樣本的光密度(Optical density, OD)值; 運用競爭性自適應(yīng)重加權(quán)采樣(Competitive adaptive reweighted sampling, CARS)算法優(yōu)選特征光譜,再利用極限學(xué)習(xí)機(jī)(Extreme learning machine, ELM)建立酵母菌生長過程4個階段的分類模型。研究結(jié)果顯示,參與CARS-ELM模型建立的波長個數(shù)為30,其10次運行在訓(xùn)練集和測試集中的平均識別率分別為98.68%和97.37%。研究結(jié)果表明,利用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計量學(xué)方法描述酵母菌生長過程是可行的。

        關(guān)鍵詞 酵母菌; 近紅外光譜; 競爭性自適應(yīng)重加權(quán)采樣法; 極限學(xué)習(xí)機(jī)

        1 引 言

        在全球能源逐漸匱乏的大環(huán)境下,利用酵母菌發(fā)酵生物質(zhì)產(chǎn)酒精作為能源替代品越來越引起重視。在工業(yè)生產(chǎn)過程中,酵母菌生長過程的測定對發(fā)酵具有重要的指導(dǎo)作用[1~3]。目前,酵母菌檢測的方法主要有血球計數(shù)板計數(shù)法和平板菌落計數(shù)法等, 這些方法雖然檢測過程直觀、快速,但檢測結(jié)果受操作人員因素影響較大,其穩(wěn)定性和均一性難以保證[4]。

        近紅外光是介于紫外可見光和中紅外光之間的電磁波,其光譜信息主要來自有機(jī)物中含氫基團(tuán)倍頻與合頻的吸收,不同基團(tuán)或同一基團(tuán)在不同化學(xué)環(huán)境中的近紅外吸收波長與強(qiáng)度都有明顯差別,適用于有機(jī)化合物理化參數(shù)的間接測量[5~7]。在酵母菌培養(yǎng)過程中,基質(zhì)中的有機(jī)物大分子包含了大量的含氫基團(tuán)[8]。近年來,已有一些學(xué)者利用近紅外光譜分析技術(shù)對微生物發(fā)酵過程中的底物、產(chǎn)物和生物量濃度進(jìn)行檢測,取得了較理想的結(jié)果[9~11]。而在利用近紅外光譜分析技術(shù)對微生物生長過程動態(tài)跟蹤方面的研究卻鮮有報道。大量研究表明,近紅外光譜信息是由很多弱的、寬的、非特征重疊譜帶所構(gòu)成[12], 這些光譜信息包含了很大數(shù)目的波長變量,這些波長變量有些是無信息變量和冗余變量,波長變量之間也存在著很嚴(yán)重的線性關(guān)系[13]。這些波長變量不僅會增大計算量,而且對光譜的有用信息進(jìn)行干擾,從而降低模型的預(yù)測能力。因此,在利用近紅外光譜分析技術(shù)對酵母菌生長過程進(jìn)行定性分析時,光譜特征和化學(xué)計量學(xué)模型的選擇與優(yōu)化至關(guān)重要,直接影響最終檢測結(jié)果的精度[12]。因此,本研究提出基于近紅外光譜分析技術(shù)的酵母菌生長過程快速描述方法。采用競爭性自適應(yīng)重加權(quán)采樣(Competitive adaptive reweighted sampling, CARS)算法篩選預(yù)處理后的近紅外光譜特征波長,然后利用極限學(xué)習(xí)機(jī)(Extreme learning machine, ELM)建立酵母菌生長過程4個時期的識別模型,實現(xiàn)了利用近紅外光譜分析技術(shù)高精度檢測酵母菌生長狀態(tài)。

        2 實驗部分

        2.1 酵母菌培養(yǎng)及數(shù)據(jù)采集

        2.1.1 酵母菌的擴(kuò)大培養(yǎng) 從上海瑞楚生物科技有限公司購買工業(yè)發(fā)酵酵母菌種1 mL,再配制麥芽汁培養(yǎng)基,然后將原代酵母菌菌種接種到培養(yǎng)基中做平行擴(kuò)大培養(yǎng),每次取生長狀況良好的菌種作為下一次接種母菌,直到培養(yǎng)得到酵母菌種40 mL結(jié)束。

        2.1.2 酵母菌的分裝培養(yǎng) 酵母菌擴(kuò)大培養(yǎng)結(jié)束后,分別在3個250 mL 容量瓶內(nèi)裝入125 mL 無菌麥芽汁培養(yǎng)基和0.5 mL 酵母菌懸液,分別將3個容量瓶標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h,溫度設(shè)置為28℃,轉(zhuǎn)速為110 r/min。按以上方案共進(jìn)行6批酵母菌培養(yǎng)實驗。

        2.1.3 數(shù)據(jù)采集 在酵母菌培養(yǎng)過程中,從接種開始每隔4 h采樣一次,共有19個采樣時間點(即0, 4, 8, ……72 h)。為了避免采樣次數(shù)過多而引起容量瓶內(nèi)發(fā)酵污染,采樣時,將19個采樣時間點分為三部分,即0~24 h、28~48 h和52~72 h時間內(nèi)的采樣分別在容量瓶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中進(jìn)行。這樣每批實驗可獲得19個樣本數(shù)據(jù)。共進(jìn)行6批實驗,可獲得114個樣本。

        2.2 光譜采集

        采用Antaris Ⅱ傅里葉變換近紅外光譜儀(美國Thermo Scientific公司)的透射模式采集各樣本的近紅外光譜數(shù)據(jù)。光譜采集時,室內(nèi)溫度保持在25℃左右,濕度基本恒定。樣品池采用光程5 mm標(biāo)準(zhǔn)管,掃描次數(shù)為32次,分辨率為8 cm1,掃描波數(shù)范圍為10000~4000 cm1。每個樣本采集3次,取其平均光譜作為該樣本的原始光譜。

        2.3 光電比濁法測定OD值

        在樣本光密度(Optical density, OD)值測定時,首先將UV-2204PC型紫外可見分光光度計的波長設(shè)置為600 nm,透光率調(diào)為100%,取光程為1 cm比色皿裝入3.5 mL無菌麥芽汁培養(yǎng)基為對照組; 樣本溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后,移入比色皿測量其OD值。每個樣本測量3次,再取其平均值。若樣本溶液過稠,需稀釋后再進(jìn)行測量,使得OD值保持在0.1~0.65之間[14,15]。

        2.4 數(shù)據(jù)分析方法

        2.4.1 競爭性自適應(yīng)重加權(quán)采樣算法 為了消除光譜變量之間的冗余和共線性信息,需要對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行變量篩選。競爭性自適應(yīng)重加權(quán)采樣(Competitive adaptive reweighted sampling , CARS)是模擬達(dá)爾文進(jìn)化論中“適者生存”原則[16],通過蒙特卡羅采樣法隨機(jī)選擇80%的樣本,建立偏最小二乘法(Partial least square, PLS)模型,保留回歸系數(shù)絕對值大的波長點,同時去除權(quán)重小的波長點,多次重復(fù)篩選后,選出交叉驗證均方根誤差RMSECV最小的變量子集,即為特征波長變量[17,18]。

        2.4.2 極限學(xué)習(xí)機(jī)判別分析法 極限學(xué)習(xí)機(jī)算法(Extreme learning machine, ELM)是由新加坡南洋理工大學(xué)的Huang等[19]提出的一種針對單隱含層前饋神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的學(xué)習(xí)算法。該算法能隨機(jī)產(chǎn)生輸入層與隱含層之間的連接權(quán)值和隱含層神經(jīng)元的閾值,并且在訓(xùn)練過程中無需調(diào)整,只需設(shè)置隱含層神經(jīng)元的個數(shù),就可以獲得唯一的最優(yōu)解,克服了傳統(tǒng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練速度慢、易陷入局部最優(yōu)的問題[20],并以其學(xué)習(xí)速度快、泛化性能好等優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于模式分類領(lǐng)域。

        3 結(jié)果與討論

        3.1 光譜分析

        酵母菌發(fā)酵液主要是由蛋白質(zhì)、碳水化合物等大分子化合物和乙醇組成[21]。其中,碳水化合物的主要吸收波段在6298.4~5650.4 cm1之間,蛋白質(zhì)的主要吸收波段在6506.4~6776.6 cm1之間,乙醇的主要吸收波段在7154.6~6954.1 cm1和9997.2~9981.7 cm1之間[22]。圖1A為所有酵母菌發(fā)酵液樣本的原始光譜圖。從圖1可見,不同時間段獲取的酵母菌發(fā)酵液樣本的光譜吸收峰基本與文獻(xiàn)[22]描述的大分子化合物的吸收波段范圍吻合,很好地反映了酵母菌培養(yǎng)過程中大分子有機(jī)化合物的微量變化,這為近紅外光譜分析技術(shù)用于酵母菌發(fā)酵過程定性分析提供了理論依據(jù)。

        為了消除發(fā)酵液中固態(tài)顆粒及光散射等因素對采集光譜的影響,研究采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換(Standard normal variate transformation, SNV)對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理,該方法可有效消除液態(tài)樣品中懸浮顆粒及光程變化等外部因素對光譜采集的影響[23,24]。SNV預(yù)處理光譜圖如圖1B所示。

        3.2 酵母菌生長曲線及樣本集劃分

        為了直觀地反映酵母菌的動態(tài)生長過程,本研究根據(jù)各采樣時間點所測的樣本OD值擬合出酵母菌的生長曲線。如圖2所示,0~8 h為酵母菌生長的遲滯期,8~28 h為酵母菌生長的對數(shù)期,28~60 h為酵母菌生長的穩(wěn)定期,60~72 h為酵母菌生長的衰亡期,很好地反映了酵母菌的4個生長階段。

        在模型校正過程中,將前4批實驗獲取的樣本作為訓(xùn)練集,后兩批實驗獲取的樣本作為獨立測試集,用于校正模型的驗證。表1列出了酵母菌生長過程中采集的所有樣本的OD值在訓(xùn)練集和測試集中的分布情況。

        3.3 光譜變量篩選

        圖3呈現(xiàn)了應(yīng)用CARS算法對預(yù)處理后的光譜進(jìn)行特征波長篩選的過程。從圖3A可見,隨著采樣次數(shù)增加,被保留的波長變量呈指數(shù)規(guī)律衰減,較好地反映了CARS算法在執(zhí)行時對變量粗選和精選的過程。圖3B為CARS采樣過程中,交互驗證均方根誤差(RMSECV)隨采樣次數(shù)的變化情況。從圖3B可見,當(dāng)采樣次數(shù)為28時,RMSECV值達(dá)到最?。?.1736); 此時,入選的波長變量數(shù)為30,它們在全光譜區(qū)域的分布如圖4所示。對上述篩選變量的NIR吸收譜帶解析為:5650.4, 5932.0, 5935.8, 5939.7, 5943.5, 6059.2, 6159.5和6298.4 cm1是位于CH基團(tuán)一級倍頻振動吸收的波段范圍; 6506.4, 6564.2, 6583.8, 6587.6, 6595.4, 6599.2, 6618.2, 6695.6, 6699.5,6768.9, 6772.8和6776.6 cm1為胺基NH鍵伸縮振動的一級倍頻附近; 6954.1, 6957.9, 6996.5, 7089.0, 7131.5, 7154.6 cm1和9981.7, 9985.6, 9989.5, 9997.2 cm1分別位于醇類OH基團(tuán)伸縮振動的一級和二級倍頻附近。分析上述篩選的30個波長變量的波數(shù)可知,這些波數(shù)光譜基本都在酵母菌發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)、碳水化合物等大分子和乙醇的光譜主要吸收波段內(nèi)。因此,利用CARS算法篩選的特征波長變量能較好地反映酵母菌培養(yǎng)過程中基質(zhì)中有機(jī)物的微量變化。

        3.4 ELM判別模型建立及預(yù)測

        選用經(jīng)CARS算法優(yōu)選后的30個特征波長變量建立ELM判別模型,完成酵母菌生長階段的定性描述。在ELM模型建立過程中,其隱含層神經(jīng)元個數(shù)K是影響其性能的重要參數(shù)。因此,在ELM模型建立過程中需對其進(jìn)行優(yōu)化。研究初始化K=10,并以11為間隔增加,依據(jù)模型在訓(xùn)練集和測試集中的預(yù)測正確率來確定最佳的隱含層神經(jīng)元個數(shù)。由于ELM算法權(quán)重初始化時具有隨機(jī)性,因此,針對每個K,研究均運行10次,取其中5次預(yù)測效果較好模型的記錄于表2中。從表2可知,當(dāng)K=43時,訓(xùn)練集和測試集的平均預(yù)測準(zhǔn)確率分別達(dá)到了100%和99.47%,性能最佳。因此,最終確定為K=43。確定ELM算法關(guān)鍵參數(shù)后,10次運行ELM,其在訓(xùn)練集中的平均預(yù)測準(zhǔn)確率為98.68%,在訓(xùn)練集中的平均預(yù)測正確率為97.37%,很好地對酵母菌生長的4個階段進(jìn)行有效區(qū)分。

        4 結(jié) 論

        本研究利用近紅外光譜分析技術(shù)實現(xiàn)酵母菌培養(yǎng)過程的動態(tài)監(jiān)測。利用CARS算法對預(yù)處理后的光譜進(jìn)行特征波長篩選,優(yōu)化ELM隱含層神經(jīng)元數(shù),最后建立酵母菌生長過程定性識別模型。結(jié)果表明,建立在由CARS篩選法30個特征波長變量基礎(chǔ)上的最佳ELM識別模型, 10次運行在測試集中的平均識別率達(dá)到97.37%。因此,利用近紅外光譜分析技術(shù)結(jié)合合適的化學(xué)計量學(xué)方法快速監(jiān)測酵母菌生長過程是可行的。本研究結(jié)果為酵母菌生長過程的快速在線監(jiān)測提供了技術(shù)支持。

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