陳汝+王金政+薛曉敏+王貴平

摘要：采集具有炭疽病癥狀的紅富士果實樣品進(jìn)行組織分離、培養(yǎng)，獲得蘋果炭疽病菌株（編號為Acg1），采用形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對其進(jìn)行鑒定。根據(jù)分離菌株的菌落、分生孢子形態(tài)特征、rDNA-ITS序列分析將分離到的Acg1菌株鑒定為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）。

關(guān)鍵詞：蘋果；炭疽病菌；分離；鑒定；膠孢炭疽菌

中圖分類號： S436.611.1+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）11-0079-02[HS）][HT9.SS]

我國是世界蘋果生產(chǎn)第一大國[1]，紅富士是從普通富士的芽變中選育出的著色系的統(tǒng)稱，病害是制約蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因子。李保華等針對蘋果病害管理中存在的問題進(jìn)行分析并對蘋果病害方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述[2]。炭疽菌屬（Colletotrichum）是一類重要的植物病原真菌，可引起果實和葉子發(fā)生炭疽病害，并廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)[3]。近年來，炭疽菌屬分類研究一直是國內(nèi)外研究熱點，并且分子生物學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于炭疽菌的分類研究[4-7]。研究表明，膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）是蘋果生長期和貯藏期的主要侵染性病害，是造成產(chǎn)量和品質(zhì)損失的主要原因之一[8-10]。本研究從疑似炭疽病的紅富士發(fā)病果實上采用組織分離法獲得炭疽病源菌株，并采用rDNA-ITS序列分析和形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法對其進(jìn)行鑒定，為蘋果炭疽病害的生物防控提供依據(jù)并奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1樣品采集

具有炭疽病癥狀的紅富士果實樣品采自山東省果樹研究所天平湖基地紅富士蘋果園。

1.2病原菌的分離及形態(tài)特征觀察

采用組織分離法。先用70%乙醇表面消毒具有炭疽病癥狀的紅富士蘋果樣品，再用滅菌的解剖刀在病健交界處切下3 mm×5 mm的組織塊，用70%乙醇消毒1 min，再用01%氯化汞處理40 s，最后用無菌水沖洗干凈后置于PDA培養(yǎng)基上，25 ℃下暗培養(yǎng)3 d，挑取單個菌落菌絲，轉(zhuǎn)移到新的PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃下暗培養(yǎng)6 d，保存得到的純菌株，觀察并記錄菌落形態(tài)學(xué)特征，挑取分生孢子進(jìn)行顯微形態(tài)觀測并記錄孢子的形狀大小。

1.3DNA提取和PCR擴增

真菌總DNA提取采用OMEGA公司試劑盒，提取的DNA溶解后于-20 ℃貯存?zhèn)溆?。以菌絲總DNA為模板，對ITS區(qū)進(jìn)行擴增，以ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）[11]、ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[12]為引物（由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成）。

25 μL PCR反應(yīng)體系：2.5 μL 10×PCR buffer（2.50 mmol/L，含Mg2+）、2.00 μL dNTPs（2.50 mmol/L）、050 μL ITS1（10.00 μmol/L）、0.50 μL ITS4（10.0 μmol/L）、0.75 μL DNA模板、0.25 μL（5.00 U/μL）Taq酶、18.50 μL滅菌水。

PCR擴增反應(yīng)在BIO-RAD S1000TM PCR擴增儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物由1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物回收純化后與pMD 18-T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌DH5α），挑取陽性克隆送上海鉑尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4序列分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

所得序列在國際核酸數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中進(jìn)行同源序列搜索。將分離菌株序列用Clustal X軟件[13]進(jìn)行多個序列比對，并與GenBank中的相關(guān)序列進(jìn)行同源性比較，然后用MEGA 4.1軟件中鄰位加入（neighbor-joining，簡稱NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌形態(tài)特征

經(jīng)組織分離，獲得病原物的純培養(yǎng)物（編號為Acg1），PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)，菌落呈圓形生長，邊緣規(guī)則，氣生菌絲較發(fā)達(dá)，初期為白色，培養(yǎng)4～6 d后逐漸變?yōu)闇\灰色至灰黑色（圖1-A）。菌落在25 ℃時的生長速率是（11.90±0.61）mm/d。后期產(chǎn)生橘紅色分生孢子團，分生孢子長橢圓形，分生孢子表面光滑，無色，單胞，圓柱形或橢圓形，多數(shù)兩端鈍圓，大小為（17～22.6×4.0～6.0）μm（n=50）（圖1-B）。以上結(jié)果顯示，菌株形態(tài)特征與符丹丹等描述的蘋果炭疽菌的形態(tài)[14]基本一致。因此，紅富士蘋果的炭疽病原菌可以初步確定為炭疽菌屬。

2.2序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

以純培養(yǎng)物總DNA為模板，ITS1、ITS4為引物，經(jīng)PCR擴增，獲得大小為584 bp的rDNA-ITS基因片段。Blast搜索結(jié)果顯示，該片段與炭疽菌的同源性高達(dá)99%以上。采用Clustal X軟件多序列比對后用MEGA 4.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，從染病紅富士果實分離的炭疽病菌株與C. gloeosporioides（GenBank編號為EU552111）、C. gloeosporioides（GenBank編號為AJ301908）、C. gloeosporioides（GenBank編號為GU174543）、C. gloeosporioides（GenBank編號為KC122769）聚在同一分支上（圖2）。據(jù)此，將該炭疽病原菌3結(jié)論與討論

炭疽病是危害蘋果生產(chǎn)的重要病害，嚴(yán)重影響蘋果的產(chǎn)量及品質(zhì)。炭疽菌種類多、變異大，種間形態(tài)學(xué)特征近似，僅基于形態(tài)學(xué)的炭疽菌鑒定是不夠準(zhǔn)確的。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子技術(shù)廣泛用于植物病原菌的分類與鑒定。近年來，rDNA核酸序列逐漸應(yīng)用于真菌分類鑒定系統(tǒng)中，相對保守的18S、28S區(qū)域用于屬、種的分類鑒定，而變異性較大的ITS區(qū)域能反映出種間以及種內(nèi)不同個體間的差異。國內(nèi)學(xué)者依據(jù)病原菌形態(tài)特征及DNA序列分析的方法對蘋果[14]、藍(lán)莓[6]、茶樹[7]、甜柿[15]炭疽病菌進(jìn)行鑒定，表明炭疽病菌在果樹上存在多樣性。

蘋果炭疽病菌主要包括膠孢刺盤孢[Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Penz.&Sacc.]和尖孢刺盤孢[Colletotrichum acutatum J. H. Simmonds]兩大復(fù)合類群中的物種[14]。本研究根據(jù)傳統(tǒng)的真菌形態(tài)學(xué)鑒定及病原菌rDNA-ITS序列的同源性與系統(tǒng)聚類分析結(jié)果，確定采集的具有炭疽病癥狀的紅富士果實樣品中分離得到的病原菌是膠孢刺盤孢。今后將對更多蘋果園中感病樣品進(jìn)行分析，炭疽菌的準(zhǔn)確鑒定能為炭疽病的防治提供理論依據(jù)。

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