范金茹，歐陽(yáng)過(guò)，陳 彤，王建湘，廖建萍，周斐然，謝榮苑

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急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表達(dá)與心肌損傷、心律失常、虛實(shí)辨證的相關(guān)性分析

范金茹，歐陽(yáng)過(guò)，陳 彤，王建湘，廖建萍，周斐然，謝榮苑

目的 分析急性心肌梗死大鼠肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶信使RNA(SERCA2a mRNA)表達(dá)與心肌組織形態(tài)學(xué)，心律失常及虛實(shí)辨證評(píng)分的相關(guān)性。方法 將40只SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組、心痛方組、硫氮卓酮組。采用結(jié)扎法制備心肌梗死模型，采用RT-PCR法測(cè)定SERCA2a mRNA表達(dá)，心肌細(xì)胞HE染色觀察形態(tài)學(xué)改變，心電圖檢測(cè)心律失常，虛實(shí)辨證評(píng)分進(jìn)行虛實(shí)辨證。結(jié)果 心肌損傷程度與SERCA2a mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.780，P=0.00)；未發(fā)生心律失常組SERCA2a mRNA表達(dá)明顯增多(P<0.00)；SERCA2a mRNA表達(dá)與虛實(shí)辨證評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.969，P=0.01)。結(jié)論 SERCA2a mRNA對(duì)心肌組織具有保護(hù)作用，SERCA2a mRNA表達(dá)與心律失常、虛實(shí)辨證具有相關(guān)性。

急性心肌梗死；肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶信使RNA；心律失常；心肌損傷；虛實(shí)辨證

最新研究調(diào)查顯示，心血管病為我國(guó)居民的首位死因，其中急性心肌梗死死亡率呈快速上升態(tài)勢(shì)，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，急性心肌梗死早期心律失常的發(fā)生與鈣通道調(diào)節(jié)基因肌漿網(wǎng)Ca2+-ATP酶信使RNA(SERCA2a mRNA)密切相關(guān)[2]。心肌梗死屬中醫(yī)“胸痹、心痛”范疇，病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜[3]。目前尚缺少鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)與中醫(yī)虛實(shí)辨證相關(guān)性研究。本課題對(duì)SERCA2a mRNA進(jìn)行研究，觀察對(duì)心肌損傷及心律失常的影響，并探討與中醫(yī)虛實(shí)證型的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD雄性大鼠40只，體重200 g～250 g，鼠齡8周～10周，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(湘)2011-003。

1.2 主要儀器和試劑 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司，BL-420F)；動(dòng)物人工呼吸機(jī)(浙江醫(yī)科大學(xué)儀器實(shí)驗(yàn)廠，DH-140)；熒光定量PCR儀(廠家ABI，Step One Plus)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Heal Force，Neofuge 15R)；PCR試劑盒、PCR引物(武漢谷歌生物試劑有限公司提供)。

1.3 藥品 心痛方中藥超微顆粒(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，批號(hào)：681211)組方：柴胡10 g，瓜蔞10 g，桃仁10 g，川芎10 g，白芥子10 g，蒲黃10 g，郁金10 g，九香蟲(chóng)5 g，甘草5 g；硫氮卓酮(湖南中達(dá)騖馬制藥有限責(zé)任公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)：H20065734)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，按隨機(jī)表隨機(jī)分組，分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、心痛方組(C組)、硫氮卓酮組(D組)4組，每組10只。

1.4.2 造模方法 以結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支建立大鼠急性心肌梗死模型[4-5]。穿線、或結(jié)扎后即刻記錄心電圖，以左室前壁呈發(fā)紺或Ⅱ?qū)?lián)S-T段弓背向上抬高大于0.1 mV并持續(xù)0.5 h以上，并于結(jié)扎點(diǎn)下心肌顏色改變?yōu)榻Y(jié)扎成功標(biāo)志(S-T段無(wú)改變者淘汰)。假手術(shù)組僅開(kāi)胸，不結(jié)扎。

1.4.3 給藥方案 手術(shù)后給藥7 d(前3 d給藥同時(shí)予青霉素鈉肌注抗感染)，均采用灌胃法給藥，以60 kg人為標(biāo)準(zhǔn)，參照劑量-體表面積換算方法計(jì)算大鼠給藥量，藥物濃度按大鼠1 mL/100 g灌胃容量配制，心痛方組采用中藥超微顆粒沖調(diào)成湯劑，濃縮后以1.08 g/kg劑量給藥；硫氮卓酮組以2.61 mg/kg劑量藥液灌胃；模型組和假手術(shù)組均予以等量生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)7 d，于第7 d灌胃30 min后處死大鼠。

1.4.4 RT-PCR法測(cè)定SERCA2a mRNA表達(dá) 取左心室心肌(結(jié)扎缺血及壞死區(qū)域)約50 mg，將其剪碎，放入1 mL Trizo液中，用1‰ 集碳酸二乙酯(DEPC)液體浸泡的電動(dòng)勻漿器勻漿，Trizo法提取RNA，參考AMV反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)基因庫(kù)基因序列，以Primer5軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)SERCA 2am RNA和β-actin引物：SERCA2a引物，上游5'-AGA TAG CGG GCA TAC TG-3'，下游5'-TCT ATC GCC CGT ATG AC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)592 bps；β-actin引物，上游5'-CAC TAT CGG CAA TGA GCG-3'，下游5'-GTG ATA GCC GTT ACT CGC-3'，擴(kuò)增片段長(zhǎng)223 bps。通過(guò)凝膠圖像分析儀實(shí)行吸光度掃描來(lái)觀察條帶的灰度強(qiáng)弱，SERCA2a mRNA吸光度值同GAPDH吸光度的比值表示結(jié)果。

1.4.5 HE染色法觀察心肌形態(tài)學(xué)改變 取心室組織浸沒(méi)于4%多聚甲醛24 h固定，置入梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，經(jīng)修片，切片成片厚4 μm，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察心肌形態(tài)學(xué)[6]。根據(jù)心肌形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行心肌損傷程度評(píng)分：心肌纖維排列整齊、無(wú)壞死、無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)記0分；心肌纖維出現(xiàn)凝固性壞死并輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)記1分；大量心肌纖維凝固性壞死并重度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)記2分。

1.4.6 心電圖觀察大鼠心律失常 觀察大鼠心律失常發(fā)生：第1次在造模(或假手術(shù))成功后給藥前進(jìn)行心電圖常規(guī)記錄；第2次給藥后第7天，大鼠處死前并根據(jù)實(shí)際情況隨時(shí)記錄。

1.4.7 大鼠虛實(shí)辨證評(píng)分 根據(jù)中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)，大鼠一般狀況(精神狀態(tài)、皮膚毛發(fā)、鼻尾顏色、呼吸頻率、活動(dòng)量)為觀測(cè)指標(biāo)[7]，采取量化分級(jí)評(píng)分判斷虛證實(shí)證。根據(jù)大鼠精神狀態(tài)、皮膚毛發(fā)、鼻尾顏色、呼吸頻率、活動(dòng)量情況分級(jí)打分：精神狀態(tài)評(píng)分(精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，眼瞼下垂計(jì)1分；倦怠乏力，反應(yīng)欠靈敏計(jì)2分；動(dòng)作緩慢，缺乏生氣計(jì)3分；活潑好動(dòng)，反應(yīng)靈敏計(jì)4分)；皮膚及毛發(fā)評(píng)分(皮膚松弛，皮下無(wú)脂肪，抓之觸骨，全身毛發(fā)枯槁，豎立計(jì)1分；皮膚松弛，少許脂肪，易抓取，背部毛發(fā)干枯，無(wú)光澤計(jì)2分；皮膚張力減小，背部毛發(fā)少光澤計(jì)3分；皮膚與脂肪連接緊密，柔韌有彈性，毛發(fā)柔順有光澤計(jì)4分)；鼻、尾顏色(淡紅少澤計(jì)1分，粉紅光淡計(jì)2分，紅潤(rùn)有光澤計(jì)3分、青紫少澤計(jì)4分)；呼頻率：動(dòng)物安靜時(shí)，測(cè)每分鐘呼吸次數(shù)，取3次均值(呼吸頻率170次/min～200次/min計(jì)1分；呼吸頻率130次/min～169次/min計(jì)2分，呼吸頻率110次/min～129次/min計(jì)3分；呼吸頻率計(jì)70次/min～109次/min計(jì)4分)；活動(dòng)量評(píng)分(活動(dòng)少1分；活動(dòng)量較少計(jì)2分；活動(dòng)較多計(jì)3分；活動(dòng)多計(jì)4分)。大鼠累計(jì)得分≤10分辨為虛證，累計(jì)得分>10分辨為實(shí)證。

2 結(jié) 果

2.1 造模結(jié)果 40只大鼠，手術(shù)中模型組死亡1只，造模后用藥前假手術(shù)組、硫氮卓酮組、心痛方組各死亡1只，每組納入實(shí)驗(yàn)大鼠為9只。造模用藥后假手術(shù)組大鼠未出現(xiàn)心律失常及死亡；模型組7只發(fā)生心律失常(5例室性早搏，1例室速，1例室顫)，3只大鼠死亡；硫氮卓酮組6只發(fā)生心律失常(2例室性早搏，2例房性心律失常，1例傳導(dǎo)阻滯，1例室速)，2只大鼠死亡；心痛方組1只發(fā)生心律失常(室速)，1只大鼠死亡。由于死亡大鼠均發(fā)生心律失常，未納入統(tǒng)計(jì)。

2.2 各組大鼠心肌損傷程度比較 與假手術(shù)組比較，模型組及硫氮卓酮組心肌損傷程度評(píng)分明顯增高(P<0.01)；心痛方組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型組比較，心痛方組心肌損傷程度評(píng)分明顯降低(P<0.01)；與硫氮卓酮組比較，心痛方組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心肌損傷程度比較(±s) 分

2.3 大鼠心肌SERCA2a mRNA表達(dá)與心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變相關(guān)系分析 大鼠SERCA2a mRNA表達(dá)量與心肌損傷程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.780，P=0.00)。

2.4 大鼠心肌SERCA2a mRNA表達(dá)與心律失常關(guān)系 與心律失常組比較，未發(fā)生心律失常組SERCA2a mRNA表達(dá)明顯增多(P<0.01)，提示大鼠心肌SERCA2a mRNA的表達(dá)增高能減少急性心肌梗死大鼠心律失常的發(fā)生。詳見(jiàn)表2。

組別nSERCA2amRNA心律失常組80.79±0.20未發(fā)生心律失常組221.37±0.281) 與心律失常組比較,1)P<0.01。

2.5 急性心肌梗死大鼠心肌SERCA2a mRNA的表達(dá)與虛實(shí)評(píng)分相關(guān)性分析 SERCA2a mRNA表達(dá)增加，評(píng)分越高，SERCA2a mRNA表達(dá)與心肌評(píng)分損傷程度關(guān)系呈正相關(guān)(r=0.969，P<0.01)。

3 討 論

急性心肌梗死具有高死亡率、高致殘率特點(diǎn)，這與冠狀動(dòng)脈急性閉塞后心肌損傷和并發(fā)心律失常密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，心肌Ca2+濃度增加引起心肌損傷，心肌梗死面積顯著增大[8]，心肌Ca2+濃度增加可能是急性心肌缺血早期室性心律失常的主要機(jī)制[9]。心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+主要儲(chǔ)存于肌漿網(wǎng)和線粒體內(nèi)，靜息狀態(tài)胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度低，缺血缺氧造成心肌細(xì)胞損傷后胞漿內(nèi)Ca2+濃度明顯升高[10]。SERCA2a是一種P型離子激活型ATP酶，通過(guò)消耗三磷酸腺苷(adenosine triphos-phate，ATP)將胞漿中多余的Ca2+泵入肌漿網(wǎng)中，以維持心肌細(xì)胞內(nèi)外巨大的濃度差，因此SERCA2a可調(diào)控心肌胞漿濃度和維持心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)[11]。已有研究表明，SERCA2a表達(dá)增多通過(guò)增加肌漿網(wǎng)的Ca2+再攝取以改善心力衰竭[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SERCA2a mRNA表達(dá)增強(qiáng)時(shí)，心肌損傷程度降低，提示SERCA2a mRNA表達(dá)對(duì)急性缺血缺氧后心肌具有明顯保護(hù)作用。未發(fā)生心律失常組SERCA2a mRNA表達(dá)明顯升高，提示增加SERCA2aRNA活性可減少心律失常發(fā)生。SERCA2aRNA減輕心肌損傷，減少心律失常發(fā)生的機(jī)制尚未明確，可能與SERCA2a將心肌胞漿多余的Ca2+泵到肌漿網(wǎng)，減少Ca2+超載有關(guān)。

冠心病屬中醫(yī)“胸痹、心痛”范疇，急性期主要表現(xiàn)邪盛標(biāo)實(shí)，后發(fā)展多為虛證或虛實(shí)夾雜[14]。急性心肌梗死則類(lèi)似中醫(yī)“真心痛”，屬胸痹嚴(yán)重病證，發(fā)生時(shí)以痰瘀互結(jié)，寒凝氣滯表現(xiàn)為主，常因?qū)嵵绿?，甚者亡陰亡?yáng)，陰陽(yáng)離決。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌梗死后實(shí)證組大鼠SERCA2a mRNA表達(dá)明顯高于虛證組大鼠，兩者關(guān)系呈正相關(guān)。推測(cè)其原因可能與心肌能量物質(zhì)ATP含量相關(guān)。冠狀動(dòng)脈閉塞后，心肌供血急劇減少，而SERCA2a依賴能量將胞漿中的Ca2+攝入肌漿網(wǎng)中。故ATP增多時(shí)，SERCA2a mRNA活性增強(qiáng)，中醫(yī)癥狀學(xué)多表現(xiàn)為實(shí)證；ATP產(chǎn)生減少時(shí)，SERCA2a mRNA活性減弱，中醫(yī)癥狀學(xué)多表現(xiàn)為虛證。

心痛方以“心痛治肝，肝心同治”，“急則治其標(biāo)，治實(shí)以防虛變”為特色，根據(jù)疏肝化瘀豁痰法立方，為主治痰瘀互結(jié)氣郁證胸痹心痛的有效驗(yàn)方，其臨床療效確切，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從炎癥反應(yīng)通路證實(shí)心痛方能縮小大鼠心肌梗死面積，抑制血小板-白細(xì)胞相互反應(yīng)，對(duì)心肌有保護(hù)作用[15-16]。本實(shí)驗(yàn)顯示，心痛方能顯著增加SERCA2a mRNA表達(dá)，明顯降低心肌損傷，減少心律失常的發(fā)生，對(duì)心肌組織具有保護(hù)作用，提示其保護(hù)機(jī)制可能與增加SERCA2a活性密切相關(guān)。SERCA2a活性與虛實(shí)辨證密切相關(guān)，但機(jī)制尚未明確需進(jìn)一步研究。

[1] 陳偉偉，高潤(rùn)霖，劉力生，等.《中國(guó)心血管病報(bào)告2015》概要[J].中國(guó)循環(huán)雜志，2016，31(6)：521-528.

[2] 劉建和，何少平，胡熙苒，等.柴胡三參膠囊對(duì)心肌缺血心律失常模型大鼠心肌細(xì)胞Ca2+及SERCA2a mRNA表達(dá)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，25(10)：1574-1576.

[3] 王永剛，齊婧，鐘偉，等.冠心病中醫(yī)病因病機(jī)的認(rèn)識(shí)與探索[J].中醫(yī)雜志，2015，56(17)：1449-1452.

[4] 黃紹湘，路超，李峰，等.大鼠心肌梗死模型的建立[J].遼寧中醫(yī)雜志，2014，41(3)：586-588.

[5] 陳學(xué)娟，范金茹，廖建萍，等.冠脈結(jié)扎法大鼠心肌梗死模型的改進(jìn)[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2014，23(10)：1806-1807.

[6] 吳海游，邱楚群，梁美婷，等.人參輔酶Q(10)防曬霜對(duì)紫外線損傷小鼠的保護(hù)作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2016，24(6)：601-606.

[7] 王碩仁，王振濤，趙明鏡，等.心氣虛病證動(dòng)物模型及其評(píng)價(jià)體系的構(gòu)建[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2002，10(1)：33-38.

[8] 孔令恒，顧曉明，南瑛，等.鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ抑制劑KN-93加重大鼠離體心臟鈣超載損傷[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2016，32(6)：832-836.

[9] 張銘慧，尹永強(qiáng)，康毅，等.?；撬徭V對(duì)缺氧/復(fù)氧致大鼠心肌細(xì)胞鈣離子通道異常的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2014，30(10)：1367-1372.

[10] 李俊平，郭麗麗，陳中，等.鈣超載與心肌缺血再灌注損傷及中藥干預(yù)策略[J].中國(guó)中藥雜志，2016，41(11)：2168-2173.

[11] 劉燕琴，冷建春.鈣調(diào)控與心肌缺血再灌注損傷的中西醫(yī)防治研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(17)：2011-2013.

[12] Niwano K，Arai M，Koitabashi N，et al.Lentiviral vector-media-ted SERCA2a gene transfer protects against heart failure and left ventricular remodeling after myoardical infarction in rats[J].Mol Ther，2008，16(6)：1036-1032.

[13] Byrne MJ，Power JM，Preovolos A，et al.Recirculating cardiac delivery of AAV2/SERCA2a improves myocardical function in an large animals[J].Gene Ther，2008，15(23)：1550-1557.

[14] 王義強(qiáng)，鄧悅，于金娜，等.冠心病中醫(yī)病因、病機(jī)及診治的古代文獻(xiàn)回顧[J].環(huán)球中醫(yī)藥，2013，6(4)：297-300.

[15] 熊杜，范金茹，陳彤，等.心痛方對(duì)急性心肌梗死大鼠血漿ICAM-1、VCAM-1的影響[J].中醫(yī)藥通報(bào)，2015，14(6)：66-68.

[16] 范金茹，那奕文，劉小瑗，等.PS/PSGL-1在冠心病合并頸動(dòng)脈粥樣斑塊痰瘀互阻證中的作用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2015，33(1)：104-107.

(本文編輯薛妮)

Correlation of SERCA2a mRNA with Myocardial Injury,Arrhythmia,Syndrome Differentiation of Deficiency and Excess in Rats with Acute Myocardial Infarction

Fan Jinru，Ouyang Guo，Chen Tong， Wang Jianxiang， Liao Jianping， Zhou Feiran，Xie Rongyuan

The First Hospital，Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410007，Hunan，China

Objective To investigate the correlation of sarco-endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a (SERCA2a) mRNA with myocardial injury，arrhythmia，syndrome differentiation of deficiency and excess in rats with acute myocardial infarction (AMI).Methods Forty Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into sham operation group，model group，Xintongfang group and Diltiazem control group.The myocardial infarction model was established by using ligation method.Expression of SERCA2a mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) method.The arrhythmia was tested by electrocardiogram. The morphological changes were observed by Hematoxylin-Eosin (HE) staining. The syndrome differentiation of deficiency and excess was made by scoring criteria. Results The degree of myocardial injury was negatively correlated with SERCA2a mRNA expression(r=-0.780，P=0.00).Expression of SERCA2a mRNA in non- arrhythmia group was significantly increased (P<0.01) . The expression of SERCA2a mRNA was positively correlated with syndrome differentiation score (r=0.969，P=0.01).Conclusion SERCA2a mRNA has protective effect on myocardial tissue，and SERCA2a mRNA expression is associated with arrhythmia and syndrome differentiation of deficiency and excess.

acute myocardial infarction；sarco-endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a mRNA；arrhythmia；myocardialinjang；syndrome differentiation of deficiency and excess

湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(No.16A159)

湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(長(zhǎng)沙 410007)，E-mail：fanjr218@sina.com

信息：范金茹，歐陽(yáng)過(guò)，陳彤，等.急性心肌梗死大鼠SERCA2a mRNA表達(dá)與心肌損傷、心律失常、虛實(shí)辨證的相關(guān)性分析[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(14)：1716-1718.

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.14.010

1672-1349(2017)14-1716-03

2017-02-28)