葉嶺，吳濤

(簡陽市人民醫(yī)院腫瘤科二1、病理科2，四川簡陽641400)

lncRNA_HOTAIR在宮頸癌組織及HeLa細胞中的表達及其生物學功能研究

葉嶺1，吳濤2

(簡陽市人民醫(yī)院腫瘤科二1、病理科2，四川簡陽641400)

目的探討長鏈非編碼RNA HOTAIR在宮頸癌組織中的表達及其生物學功能。方法選取簡陽市人民醫(yī)院2014年8月至2016年7月收治并手術(shù)治療的宮頸癌患者47例，采用實時熒光定量PCR檢測患者癌組織及癌旁正常宮頸組織中HOTAIR RNA的相對表達量；以人宮頸癌Hela細胞為研究材料，應用小RNA干擾技術(shù)下調(diào)宮頸癌Hela癌細胞HOTAIR RNA表達，分別應用CCK-8實驗、Wound Healing實驗檢測小干擾RNA下調(diào)HOTAIR表達前后Hela細胞增殖和遷移能力變化情況。結(jié)果HOTAIR在宮頸癌患者癌組織與癌旁正常宮頸組織中的相對表達量分別為(6.89±2.12)與(4.02±1.89)，癌組織顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；與對照組細胞相比，外源性小干擾RNA可顯著敲低Hela細胞中HOTAIR的表達并影響其增殖和遷移(P＜0.05)。結(jié)論宮頸癌患者癌組織中HOTAIR表達水平高于癌旁正常宮頸上皮；HOTAIR可能參與了宮頸癌細胞增殖和遷移等生物學功能。

宮頸癌；長鏈非編碼RAN；增殖；遷移；干擾RNA

宮頸癌是婦科常見的實體惡性腫瘤之一，其好發(fā)年齡為35～55歲[1]。流行病學研究證實，宮頸癌的發(fā)生與高危型乳頭瘤病毒(HPV)感染存在明顯的相關(guān)性[2]。其他危險因素還包括多性伴侶、初次性生活較為年輕及早育等。早期非浸潤性宮頸癌預后較好，遠期生存率較高，但晚期患者發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移者預后不良。目前，關(guān)于宮頸癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的確切機制并未完全闡明。隨著分子生物學研究的不斷深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展方面發(fā)揮重要作用。已有研究顯示，HOTAIR在多種實體腫瘤包括乳腺癌、肺癌及腸癌中呈現(xiàn)異常高表達，并與患者預后存在相關(guān)性[3-4]。然而，HOTAIR與人宮頸癌細胞生物學行為關(guān)系的研究鮮有報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2014年8月至2016年6月簡陽市人民醫(yī)院47例手術(shù)切除宮頸癌標本(癌組織及癌旁組織)。納入標準：(1)病理學明確診斷為宮頸癌；(2)患者術(shù)前未接受過新輔助放化療；(3)年齡大于18周歲；(4)組織學標本獲取經(jīng)家屬簽字，并經(jīng)簡陽市人民醫(yī)院倫理委員會討論通過。排除標準：(1)宮頸癌診斷不明確者；(2)術(shù)前接受新輔助放化療者；(3)合并其他惡性腫瘤者；(4)HIV陽性患者。術(shù)中切除患者宮頸癌組織標本即可放入預先準備好的液氮中迅速冷凍，防治RNA降解，然后置入-80°C冰箱保存待檢。

1.2 主要試劑Trizol試劑，購自Life Technologies公司；DMEM細胞培養(yǎng)基，購自Gibco公司；10%胎牛血清，購自Gibco公司；RNA提取試劑盒，購自Ta-KaRa公司；熒光定量PCR試劑盒，購自TaKaRa公司，CCK-8試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000，購自Life Technologies公司。Transwell試劑盒，購自美國BD公司。針對HOTAIR的小干擾RNAshRNA_HOTAIR由吉瑪公司合成。

1.3 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染人宮頸癌Hela細胞，購自中科院上海細胞庫，在5%CO2的水套式培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。Hela細胞密度在80%～90%時，用0.05%的胰酶進行消化傳代，應用吉瑪公司合成的shRNA_HOTAIR及對照shRNA_control進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過程根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑操作說明進行。

1.4 qPCR檢測HOTAIR表達提取癌組織、癌旁組織及宮頸癌Hela細胞中的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，應用實時熒光定量PCR儀進行HOTAIR表達水平檢測。對所得待測基因的Ct值進行校正，分別用待測基因HOTAIR的Ct值減去內(nèi)參基因GAPDH的Ct值，代表待測基因的相對拷貝數(shù)，ΔΔCt=Ct待測基因-CtGAPDH；算出每組ΔΔCt的平均值。

1.5 CCK-8實驗將轉(zhuǎn)染shRNA_HOTAIR及shRNA_Control的Hela細胞按5 000個/孔接種于96孔板，每組設(shè)置6個復孔，于接種后24 h、48 h、72 h和96 h，按照CCK-8試劑盒說明，檢測細胞增殖。于450 nm波長處測定每組細胞的吸光度值。取6孔平均值為結(jié)果(A值)，以時間為橫軸，A值為縱軸繪制細胞增殖曲線。

1.6 Transwell實驗應用無血清培養(yǎng)基重懸5× 104左右Hela細胞置入Transwell上室內(nèi)，下室加入600 μL的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，100倍鏡下觀察穿過Transwell小室的細胞數(shù)目，隨機取3個視野，計算平均細胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計學方法應用STATA12.0統(tǒng)計軟件分析相關(guān)數(shù)據(jù)，RNA表達水平等計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，組間比較采用兩樣本均數(shù)t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HOTAIR在宮頸癌組織中表達HOTAIR在宮頸癌患者癌組織和癌旁正常宮頸組織中的相對表達量分別為(6.89±2.12)和(4.02±1.89)，癌組織顯著高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.66，P＜0.05)，見圖1。

圖1 癌組織與癌旁組織中HOTAIR相對表達量比較

2.2 HOTAIR與宮頸癌細胞增殖侵襲能力與對照組細胞比較，小干擾RNA可顯著下調(diào)HOTAIR在Hela細胞中的表達水平，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2A；下調(diào)后宮頸癌Hela細胞中HOTAIR表達后，細胞增殖能力明顯降低，見圖2B；細胞遷移能力也下降，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2C。

圖2 下調(diào)宮頸癌Hela癌細胞HOTAIR后細胞增殖及遷移能力

3 討論

長鏈非編碼RNA是一類長度大于200 nt的RNA分子，由于此類RNA分子不具備開放閱讀框，從而不能作為模板被進一步翻譯成蛋白質(zhì)而行使生物學功能[5]。因此，在相當長的一段時間內(nèi)，生物學界普遍認為此類RNA分子不具備任何生物學功能，只是DNA在轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的“噪音”或“垃圾”。但近年來隨著生物學技術(shù)及研究的不斷深入和發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明此類RNA分子不但不是“噪音”反而在細胞的分裂增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄激活及染色質(zhì)修飾等多方面發(fā)揮著重要作用。HOTAIR為HOX基因轉(zhuǎn)錄反義RNA，是近年來發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA分子，其全長為2.2 kb，其轉(zhuǎn)錄本位于人12號染色體長臂13帶13區(qū)[6]。HOTAIR可作為骨架分子起到腳手架作用，導致不同靶基因特異性組蛋白修飾改變，從而導致如干基因沉默、促進乳腺癌轉(zhuǎn)移[7]。同時，在多種實體腫瘤中發(fā)現(xiàn)HOTAIR存在癌與正常組織的差異表達且這種差異與患者預后存在一定的關(guān)系。崔玲等[8]采用實時熒光定量PCR方法檢測了44例卵巢癌組織及14例癌旁組織中HOTAIR的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其表達與腫瘤類型、分化程度存在相關(guān)性。Nakagawa等[9]探討了HOTAIR在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用，證實HOTAIR在晚期肺癌及肺癌轉(zhuǎn)移患者中呈高表達。

關(guān)于HOTAIR在人宮頸癌中的表達情況及與宮頸癌Hela細胞增殖、侵襲能力關(guān)系的研究報道較少。鄭婷華等[10]探討了HOTAIR與人宮頸癌Hela細胞凋亡的關(guān)系，研究結(jié)果認為下調(diào)Hela細胞中HOTAIR的表達，將導致Hela細胞凋亡比例增加細胞停滯于G0/G1期。而該研究未對HOTAIR與宮頸癌細胞侵襲能力進行研究。本研究中，HOTAIR在宮頸癌患者癌組織與癌旁組織中的相對表達量為(6.89±2.12)與(4.02±1.89)，癌組織顯著高于癌旁組織，這與張艷梅等[11]的研究結(jié)果一致。癌組織與正常宮頸組織的差異表達提示HOTAIR在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮著重要作用。shRNA下調(diào)HOTAIR，可影響Hela細胞增殖及遷移能力，說明HOTAIR在宮頸癌細胞的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的表觀遺傳調(diào)控作用，但其作用機制是否與在乳腺癌細胞中相同，有待進一步研究證實。

[1]Siegel RL,Miller KD,Jemal A.Cancer statistics,2016[J].CA Cancer J Clin,2016,66(1)：7-30.

[2]烏恩奇,趙煥虎,劉微,等.中國不同地區(qū)宮頸癌中HPV型別分布數(shù)據(jù)橫向比較分析[J].中華腫瘤防治雜志,2013,20(23)：1845-1851.

[3]王昌亮,王禮泉,林明臻,等.長鏈非編碼RNA-HOTAIR與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究[J].中國醫(yī)學創(chuàng)新,2015,12(2)：38-41.

[4]薛世民,賈娟,沈華.非小細胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA HOTAIR的表達及臨床意義[J].臨床腫瘤學雜志,2016,21(9)：780-784.

[5]Zhang H,Chen Z,Wang X,et al.Long non-coding RNA：a new player in cancer[J].J Hematol Oncol,2013,6(3)：37-44.

[6]Yu X,Li Z.Long non-coding RNA HOTAIR：a novel oncogene(Review)[J].Mol Med Rep,2015,12(8)：5611-5618.

[7]Woo CJ,Kingston RE.HOTAIR lifts noncoding RNAs to new levels [J].Cell,129(7)：1257-1257.

[8]崔玲,謝曉硯,王和,等.長鏈非編碼RNA HOTAIR mRNA在卵巢癌中的表達[J].四川大學學報(醫(yī)學版),2013,15(1)：57-59.

[9]Nakagawa T,Endo H,Yokoyama M,et al.Large noncoding RNA HOTAIR enhances aggressive biological behavior and is associated with short disease-free survival in human non-small cell lung cancer [J].Biochem Biophys Res Commun,2013,436(2)：319-324.

[10]鄭婷華,王茜,楊小杰,等.長鏈非編碼RNA HOTAIR在宮頸癌患者組織及HeLa細胞中的表達和影響[J].基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床,2016,36 (1)：94-98.

[11]張艷梅,陳曉忠.長鏈非編碼RNA HOTAIR在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌HeLa細胞增殖和凋亡的影響[J].腫瘤,2015,17(4)：446-452.

Long non-coding RNA HOTAIR expression in cervical cancer tissue and HeLa cells and its biology function.

YE Ling1,WU Tao2.Second Department of Oncology1,Department of Pathology2,People's Hospital of Jianyang City,Jianyang 641400,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo discuss the long non-coding RNA HOTAIR expression in cervical cancer tissue,corresponding normal tissue and its biology function.MethodsForty-seven cervical cancer patients who

operation for cervical cancer were included in this study from Aug.2014 to Jul.2016.HOTAIR relative expression was tested by real-time PCR in the cancer tissue and corresponding normal tissue.HOTAIR was knock down in HeLa cells by small interfering RNA(shRNA).CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation ability,and the wound healing assay was used to detect the migration ability after inhibiting HOTAIR expression in HeLa cells.ResultsThe relative HOTAIR expression in cervical cancer and normal tissue were(6.89±2.12)and(4.02±1.89),with statistically significant difference(P＜0.05).shRNA_HOTAIR could successfully decrease HOTAIR expression in HeLa cells,and the proliferation and migration ability were inhibited by knocking down HOTAIR in HeLa cells compared to shRNA_control cell(P＜0.05).ConclusionHOTAIR is highly expressed in cervical cancer tissue and plays important roles in the proliferation and migration of HeLa cell.

Cervical cancer;Long non-coding RNA;Proliferation;Migration;Small interfering RNA

R737.33

A

1003—6350（2017）14—2285—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.14.015

2017-02-13)

葉嶺。E-mail：yeling_jy@yeah.net