紀(jì)志華，賈丙申，于鵬，付昆，孟志斌，云大科

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)創(chuàng)傷科1、脊柱骨病科2，海南?？?70102)

激素性股骨頭壞死中MMP2作用的研究

紀(jì)志華1，賈丙申1，于鵬1，付昆1，孟志斌2，云大科1

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)創(chuàng)傷科1、脊柱骨病科2，海南海口570102)

目的觀察家兔激素性股骨頭壞死股骨頭中基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)的表達(dá)，探討MMP2在股骨頭壞死中的作用。方法將12只家兔按隨機(jī)數(shù)表法分為模型組和對(duì)照組，每組6只。模型組采用靜脈注射內(nèi)毒素和肌肉注射甲基強(qiáng)的松龍的方法造模。對(duì)照組則應(yīng)用等量的生理鹽水。10周后，檢測(cè)股骨頭的空骨陷窩率，髓腔脂肪面積和MMP2。結(jié)果模型組的空骨陷窩率、髓腔脂肪面積和MMP2分別為(20.26±9.83)%、(236.30±34.78)μm2和67.3%，均明顯高于對(duì)照組的(3.12±1.05)%、(178.80±21.82)μm2和21.1%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論激素性股骨頭壞死中MMP2的高表達(dá)與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

激素性股骨頭壞死；基質(zhì)金屬蛋白酶；家兔

激素性股骨頭壞死(glucocorticoid-induced necrosis of femoral head，GNFH)是一種常見的骨壞死疾病[1]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinase，MMPs)屬于金屬蛋白酶家族，其在組織降解、修復(fù)等過程具有重要作用[2]。MMP2是MMPs中重要成員，其表達(dá)程度對(duì)骨組織的降解吸收具有重要作用，可能是骨壞死吸收的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

TIMP2和MMP2的對(duì)比變化在激素性股骨頭壞死中發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，TIMP2的低表達(dá)與股骨頭壞死發(fā)生密切相關(guān)。MMP2作為TIMP2的拮抗劑，其在股骨頭中的表達(dá)程度亦可能對(duì)激素性股骨頭壞死的發(fā)生產(chǎn)生影響。因此，我們檢測(cè)了MMP2在激素性股骨頭壞死中的表達(dá)程度，進(jìn)而探究激素性股骨頭壞死中MMP2的作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物家兔12只，雌雄各半，按照隨機(jī)數(shù)表法分為模型組和對(duì)照組，每組6只。家兔均由我單位動(dòng)物試驗(yàn)中心提供，平均體質(zhì)量為(3.7±0.3)kg。

1.2 主要儀器與試劑MMP2試劑盒(武漢博士德公司)，顯微鏡(奧林巴斯)，甲強(qiáng)龍注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(比利時(shí)輝瑞公司)，內(nèi)毒素(Sigma)。

1.3 造模方法按照紀(jì)志華等[3]研究的方法造模。具體為6只家兔均經(jīng)耳緣靜脈注射l0μg/(mL·kg)的內(nèi)毒素(LPS)一次；次日，再臀部肌肉注射40 mg/kg甲基強(qiáng)的松龍，并同時(shí)給予臀部肌肉注射青霉素鈉40萬U，預(yù)防感染。連續(xù)用藥3 d。對(duì)照組則注射等劑量的生理鹽水。

1.4 指標(biāo)測(cè)定10周后，以40 mg/kg的3%戊巴比妥過量腹腔注射法處死家兔，無菌操作狀態(tài)下取出股骨頭，剔除多余軟組織，縱行鋸開股骨頭，經(jīng)過固定、脫鈣等HE染色程序處理后，在顯微鏡下觀察后計(jì)算：①髓腔中脂肪面積：觀察50個(gè)視野，經(jīng)過圖像采集，圖像分析儀定量分析測(cè)定髓腔脂肪面積。②空骨陷窩率：高倍鏡下隨機(jī)選擇20個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)50個(gè)骨陷窩及總的空骨陷窩，空骨陷窩率=空骨陷窩數(shù)/50×100%。

1.5 免疫組化檢測(cè)將股骨頭組織脫鈣后切片并浸入0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液，微波爐加熱15 min，冷卻后0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，滴加第二抗體及血清封閉液，室溫20℃，滴加稀釋第一抗體，4℃冰箱保存過夜，滴加SABC試劑，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物一般情況模型組逐漸出現(xiàn)食量減少、精神差、體質(zhì)量降低，無死亡。模型組HE染色可觀察到骨小梁出現(xiàn)稀疏、斷裂和空骨陷窩發(fā)生，見圖1。而對(duì)照組骨小梁形態(tài)正常。顯微鏡下觀察模型組MMP2表達(dá)明顯高于對(duì)照組，見圖2。

圖1HE染色(×100)

圖2MMP2表達(dá)(×200)

2.2 空骨陷窩率及髓腔脂肪面積情況對(duì)照組和模型組的空骨陷窩率分別為(3.12±1.05)%和(20.26± 9.83)%；而髓腔脂肪面積分別為(178.80±21.82)μm2和(236.30±34.78)μm2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 MMP2表達(dá)情況經(jīng)過免疫組化方法，檢測(cè)兩組的MMP2陽性表達(dá)并轉(zhuǎn)化成百分比，模型組為67.3%，對(duì)照組為21.1%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.353，P=0.020＜0.05)。

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是細(xì)胞外基質(zhì)降解重要的一類蛋白水解酶。MMPs也是骨組織細(xì)胞外的一種蛋白水解必需酶，主要降解骨細(xì)胞外基質(zhì)。MMPs基于分子結(jié)構(gòu)和底物的異同分為明膠酶、膠原酶、基質(zhì)溶解素等。MMP2作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族中重要的一種酶，屬于明膠酶范疇，可以降解各型膠原蛋白、多糖和粘連蛋白等[3]。MMP2直接參與降解骨細(xì)胞外基質(zhì)。MMP2在骨壞死細(xì)胞外基質(zhì)降解過程中，具有獨(dú)特而重要的作用。具體表現(xiàn)在當(dāng)MMP2高表達(dá)時(shí)，Ⅰ型膠原屏障被其降解，從而激活破骨細(xì)胞，啟動(dòng)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收過程[4-5]，其活性越高，骨吸收過程越強(qiáng)烈，從而導(dǎo)致骨壞死等骨病的發(fā)生。

前期研究中證實(shí)，兔激素性股骨頭壞死后，股骨頭內(nèi)出現(xiàn)空骨陷窩，髓腔中脂肪細(xì)胞明顯增多[6]，微觀上符合激素性股骨壞死病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過免疫組化檢測(cè)，模型組的MMP2表達(dá)明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。家兔激素性股骨頭壞死中MMP2出現(xiàn)異常的高表達(dá)，與空骨陷窩率和髓腔脂肪面積具有明顯的相關(guān)性。

本研究表明激素性股骨頭壞死的發(fā)生與MMP2的高表達(dá)有密切關(guān)系。MMP2可能通過降解骨基質(zhì)內(nèi)特定的底物，激活了破骨細(xì)胞，從而誘導(dǎo)了異常增多的股骨頭內(nèi)骨吸收發(fā)生，出現(xiàn)了激素性股骨頭壞死。需要指出的是，本實(shí)驗(yàn)研究經(jīng)費(fèi)有限，樣本量小，可能存在一定的誤差，在今后的研究中需要更加深入研究。

[1]Zhao Z,Xue Y.Polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene and associations with glucocorticoid-induced avascular osteonecrosis of the femoral head[J].Genet Test Mol Biomarkers,2017,27(10)：1089.

[2]Deng X,He G,Levine A,et al.Adenovirus-mediated expression of Timp-1 and TIMP-2 in bone inhibits osteolytic degradation by human prostate cancer[J].Int J Cancer,2008,122(1)：209-218.

[3]Sousa LH,Linhares EV,Alexandre JT.Effects of atorvastatin on periodontitis of rats subjected to glucocorticoid-Induced osteoporosis[J]. J Periodontol,2016,87(10)：1206-1216.

[4]Bian Y,Qian W,Li H,et al.Pathogenesis of glucocorticoid-induced avascular necrosis：A microarray analysis of gene expression in vitro [J].Int J Mol Med,2015,36(3)：678-684.

[5]Pan B,Farrugia AN.The nitrogen-containing bisphosphonate zoledronic acid influences RANKL expression in human osteoblast-like ceHs by activating TNF-alpha conveing enzyme(TACE)[J].J Bone Miner Res,2004,19(1)：147.

[6]紀(jì)志華,賈丙申,于鵬,等.TIMP2在激素性股骨頭壞死中的作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].海南醫(yī)學(xué),2016,27(18)：2925-2926.

Role of MMP2 in glucocorticoid-induced necrosis of the femoral head.

JI Zhi-hua1,JIA Bing-shen1,YU Peng1,FU Kun1,MENG Zhi-bin2,YUN Da-ke1.Department of Joint Injury1,Department of Spine Bone Disease2,Haikou 570102, Hainan,CHINA

ObjectiveTo explore the mechanism of matrix metalloproteinase2(MMP2)in glucocorticoid-induced necrosis of the femoral head by observing the expression of MMP2 in rabbits.MethodsA total of 12 rabbits were randomly divided into the model group and the control group.The model group was modeled by intravenous injection of endotoxin and intramuscular injection of methylprednisolone.And the control group was injected with equal volume of saline solution.After 10 weeeks,the rate of empty lacuna rate in the femoral head,the area of fat in the medullary cavity and the expression of MMP2 were measured.ResultsThe rate of empty lacuna rate in the femoral head,the area of fat in the medullary cavity and the expression of MMP2 were(20.26±9.83)%,(236.30±34.78)μm2and 67.3%in the model group,which were significantly higher than(3.12±1.05)%,(178.80±21.82)μm2and 21.1%in the control group(P＜0.05).ConclusionThe high expression of MMP2 is closely related to the occurrence of glucocorticoid-induced necrosis of the femoral head.

Glucocorticoid-induced necrosis of the femoral head;Matrix metalloproteinase(MMP);Rabbit

R-332

A

1003—6350（2017）14—2245—02

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.14.003

2017-04-13)

海南省自然科學(xué)基金(編號(hào)：814357)

賈丙申。E-mail：jbs123@163.com