王義彪，趙建農(nóng)，王鵬程，劉小丘，彭浩

(海南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，海南?？?70311)

MiR-150在大鼠垂體瘤細胞中的表達及其對細胞增殖的影響

王義彪，趙建農(nóng)，王鵬程，劉小丘，彭浩

(海南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科，海南海口570311)

目的探討微小核糖核酸-150(miR-150)在大鼠垂體瘤細胞中的表達及其對垂體細胞增殖的影響。方法選用5周齡Fischer344雌性大鼠20只，按實驗要求分為對照組(n=10)與觀察組(垂體瘤組，n=10)。觀察組大鼠皮下埋置10 mg雌激素緩釋泵誘導垂體瘤模型，對照組小鼠皮下埋置生理鹽水緩釋泵作為對照。造模成功后，觀察組及對照組分別取垂體瘤組織及正常垂體組織，采用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測miR-150的表達。培養(yǎng)正常的大鼠垂體細胞，用miR-150 mimics和miR-150 mimics control分別轉染正常的垂體細胞，并觀察其對細胞增殖功能的影響。結果結果顯示觀察組組織中miR-150的表達量為(0.39±0.10)，明顯低于對照組的(1.47±0.37)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；轉染miR-150 mimics的正常垂體細胞增殖(1.16±0.11)，相對于轉染miR-150 mimics control的(1.82±0.13)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論miR-150在垂體瘤中表達下調，其可能調控垂體細胞的增殖從而抑制垂體瘤的發(fā)生。

微小核糖核酸-150；垂體瘤；垂體瘤細胞；增殖

目前垂體瘤的發(fā)病機制尚未明確，小分子RNA的出現(xiàn)為臨床研究垂體瘤致病基因提供了新的途徑，microRNA(微RNA，miRNA)作為小RNA的一種，是一種非編碼調控RNA家族。研究表明miRNA參與了腫瘤形成的調節(jié)過程[1]。miR-150在胃癌、胰腺癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[2]。研究發(fā)現(xiàn)Let-7a、miR-15a、miR-16、miR-21、miR-141、miR-143、miR-145和miR-150參與了ACTH型垂體瘤的發(fā)病，且與腫瘤的大小和復發(fā)率相關性比較高[3]。本研究探討微小核糖核酸-150(miR-150)在垂體瘤細胞中的表達及垂體瘤細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器總RNA提取試劑Trizol(Invitrogen，USA)，反轉錄試劑盒miRNA Reverse Transcription Kit(Invitrogen，USA)，SYBR Green PCR Kit (BIO-RAD，USA)，普通PCR儀(BIO-RAD，USA)，NanoDrop 2000c紫外分光光度計(ThermoScientific，USA)，熒光定量PCR儀(BIO-RAD，USA)。PCR擴增引物由生工生物公司合成，miR-150 mimics購自銳博公司。細胞培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清購自Hyclone公司。蛋白提取試劑及BCA定量試劑盒購自碧云天公司。雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)試劑盒購自美國Promega公司。MTT增殖檢測試劑盒購自碧云天公司。

1.2 動物模型建立觀察組10只Fischer344雌性大鼠；對照組10只相同體質量范圍及相同周齡的Fischer344雌性大鼠。實驗用大鼠均購自海南大學實驗動物中心，在海南大學醫(yī)學中心的SPF級動物房飼養(yǎng)。觀察組大鼠皮下埋置10 mg雌激素緩釋泵誘導垂體瘤模型，對照組小鼠皮下埋置生理鹽水緩釋泵作為對照。飼養(yǎng)室溫保持18℃～20℃環(huán)境，相對濕度40%～70%。造模8周后，彩超觀察垂體瘤形成情況，如無明顯垂體瘤形成，繼續(xù)放置緩釋泵或更換新的緩釋泵繼續(xù)造模。觀察組及對照組分別取垂體瘤組織及正常垂體組織，用于下一步實驗。

1.3 細胞培養(yǎng)垂體細胞取自Fischer344雌性大鼠的正常垂體組織。在超凈臺中將用干冰保存的細胞懸液轉入含有5 mL配制好的1640培養(yǎng)基的小號無菌細胞培養(yǎng)瓶中，在37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。體外實驗均分為兩組，其中觀察組轉染miR-150 mimics(模擬生物體內(nèi)源的miRNA)，對照組轉染miR-150 mimics control(miR-150 mimics的陰性對照)。按照Lipo2000轉染試劑說明轉染miR-150 mimics和miR-150 mimics control，之后按照相應實驗需要孵育后收集細胞進行實時熒光定量PCR(qPCR)實驗[4]。

1.4 RNA提取每100 mg垂體瘤組織和正常垂體組織標本中加入1 mL Trizol試劑，冰上充分裂解。將混勻后的組織標本加入Eppendorf管中，劇烈震蕩15 s，靜置5 min。加入氯仿0.2 mL，充分混勻后室溫靜置5 min。在4℃下，以12 000 r/min離心10 min。吸去上清后轉入新的Eppendorf管中，加入異丙醇0.2 mL，混勻后放置于冰上10 min。再次在4℃，12 000 r/min條件下離心10 min。去上清后留取沉淀。加入l mL 75%已經(jīng)預冷的乙醇，洗滌沉淀RNA。7 000 r/min離心5 min。吸去乙醇后空氣干燥3 min。加入4℃DEPC水以充分溶解。

1.5 qPCR將培養(yǎng)好的正常垂體細胞分別通過轉染miRNA-150 mimics和miR-150 mimics control提取RNA，并按照SYBR Green PCR試劑盒說明書，以合成的cDNA作為模版在熒光定量PCR儀上進行qPCR反應。PCR反應體系為：模版cDNA 0.2 μL，miR-150引物0.6 μL，SYBR Green PCR Mix 5 μL，microRNA-150上游引物為5'-CGGAATGTGAAGTACTAAGTAT-3'，下游引物為Qiagen公司試劑盒提供的通用引物；以U6為作為內(nèi)參，U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-ACGCTTC ACGAATTTGCGT-3'，加DEPC水至反應總體積為10 μL。PCR反應條件為：95℃2 min，隨后95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，共40個循環(huán)。經(jīng)qRT-PCR擴增得到各目的基因的循環(huán)閾值(Ct)值，以2-ΔΔCT相對定量的方法分析miR-150與U6拷貝數(shù)的比值。

1.6 增殖實驗96孔板內(nèi)每孔培養(yǎng)7 000個正常垂體細胞，實驗分為miR-150 mimics組和miR-150 mimics control組。細胞轉染后使用MTT增殖檢測試劑盒檢測轉染細胞48 h后的增殖率，酶標儀490波長下檢測細胞的增殖情況。以上所有的實驗至少獨立重復3次[5]。

1.7 統(tǒng)計學方法應用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，兩組間比較和組內(nèi)比較分別采用成組t檢驗和配對t檢驗；以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-150在大鼠垂體瘤組織和正常垂體組織中的表達特征觀察組組織中miRNA-150的表達量為(0.39±0.10)，對照組織miRNA-150的表達量為(1.47±0.37)，觀察組miRNA-150表達量明顯低于對照組，差異有顯著統(tǒng)計學意義(t=0.376，P＜0.01)。

2.2 miR-150對正常垂體細胞增殖的影響為了驗證miR-150對正常垂體細胞增殖的影響，使用miR-150 mimics和miR-150 mimics control分別轉染正常垂體細胞，使用MTT法檢測細胞增殖。結果顯示，轉染miR-150 mimics的正常垂體細胞增殖(1.16± 0.11)，相對于轉染miR-150 mimics control的(1.82± 0.13)顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(t=1.795，P＜0.05) (圖1、圖2)。

圖1 轉染miR-150 mimics control的正常垂體細胞明顯增多(HE×400)

圖2 轉染miR-150 mimics的正常垂體細胞數(shù)量較少(HE×400)

3 討論

近年來，miRNAs作為細胞生命活動的重要調控因子，越來越多地被用于研究腫瘤細胞的生命活動改變[6]。miRNAs是一類非編碼小型RNA分子，幾乎參與人體的每一項生理活動過程[7]。miRNAs主要在轉錄后水平調節(jié)細胞的生理功能，它們特異性地結合到其靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)段，調節(jié)靶基因mRNA的轉錄，使其降解或抑制其轉錄，進而抑制相應蛋白質的合成，最終發(fā)揮調節(jié)細胞的生命活動功能，如細胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡等[8-10]。目前，miR-150在垂體瘤中研究尚未見文獻報道。本研究通過構建垂體瘤模型對miR-150在垂體瘤中的作用做了一些相關研究[11]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-150在大鼠垂體瘤中的表達相對于正常垂體中明顯下調，提示miR-150在垂體瘤的形成和發(fā)展中起到了一定的作用，但miR-150在垂體瘤的形成和發(fā)展中發(fā)揮什么作用，以及通過什么機制調控垂體瘤的進展目前尚不清楚[14]。垂體瘤細胞的增殖活力從某種程度上可以反映腫瘤的惡性程度[12]。通過本研究我們發(fā)現(xiàn)當增加miR-150的表達時可抑制正常垂體細胞的增殖，提示miR-150在垂體細胞轉變?yōu)榇贵w瘤細胞的發(fā)展過程中，通過對垂體細胞的增殖和凋亡兩個過程起到調節(jié)作用。

綜上所述，miR-150在垂體瘤中的表達下調，并通過細胞學方法在模擬環(huán)境中運用miR-150 mimics干預正常的垂體細胞，降低垂體細胞增殖能力，提示miR-150參與垂體細胞向垂體瘤細胞的轉變的發(fā)生和發(fā)展過程。

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Expression of microRNA-150 and its effect on cell proliferation of microRNA-150 in pituitary tumor cells of rats.

WANG Yi-biao,ZHAO Jian-nong,WANG Peng-cheng,LIU Xiao-qiu,PENG Hao.Department of Neurosurgery, Hainan Provincial People's Hospital,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of microRNA-150(miR-150)and its effect on cell proliferation in pituitary tumor cells of rats.MethodsTwenty Fischer344 female rats of five weeks old were selected.They were divided into control group(n=10)and observation group(pituitary adenoma group,n=10)according to experiment requirements.The observation group was treated by embedding estrogen slow-release pumps subcutaneously to induce model of pituitary adenoma,and the control group were treated with saline sustained-release pump subcutaneously as control.After successful modeling,pituitary adenoma and normal pituitary tissue were respectively extracted in the observation group and the control group.The expressions of miR-150 was detected by real-time quantitative PCR(qPCR).Human pituitary adenoma cells were cultured in vitro.MiR-150 mimics and miR-150 mimics control were respectively transfected into normal pituitary cells,and their effect on cell proliferation function was observed.ResultsMiRNA-150expression in observation group was(0.39±0.10),which was significantly lower than(1.47±0.37)in control group(P＜0.05).The cell proliferation of normal pituitary cells transfected with miRNA-150 mimics was(1.16±0.11),which was significantly lower than(1.82±0.13)of those transfection with miR-150 mimics control(P＜0.05).ConclusionExpression of miRNA-150 is decreased in pituitary adenoma,which may regulate the proliferation of pituitary cells,thereby inhibiting the occurrence of pituitary adenomas.

miRNA-150(miR-150);Pituitary adenoma;Pituitary tumor cell;Proliferation

R-332

A

1003—6350（2017）14—2243—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.14.002

2017-03-15)

海南省自然科學基金(編號：20158354)

彭浩。E-mail：haozigogo@163.com