千文君，潘瑩，白潔宇，何全中，孫力

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000)

·論著·

藍(lán)萼乙素對兩種宮頸癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制作用及其機(jī)制

千文君，潘瑩，白潔宇，何全中，孫力

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三臨床學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453000)

目的探討藍(lán)萼乙素(GLB)對兩種宮頸癌細(xì)胞株HeLa、SiHa裸鼠移植瘤的抑制作用及其機(jī)制。方法將HeLa、SiHa細(xì)胞分別種植至BALB/C nu裸小鼠右大腿根部背側(cè)皮下，建立裸小鼠移植瘤模型；待移植瘤體積約為0.1 cm3時(shí)，于第10天將HeLa組隨機(jī)分為4組，第14天將SiHa組隨機(jī)分為4組，分別為生理鹽水組、10%乙醇組、GLB低劑量組和高劑量組，每組5只；經(jīng)腹腔注射給藥，HeLa組給予生理鹽水0.4 mL/只、10%乙醇0.4 mL/只、GLB 0.15 μmol/g 0.4 mL/只和0.20 μmol/g 0.4 mL/只，隔日1次，共20 d；SiHa組給予生理鹽水0.4 mL/只、10%乙醇0.4 mL/只、GLB 0.18 μmol/g 0.4 mL/只和0.24 μmol/g 0.4 mL/只，隔日1次，共20 d。腹腔注射給藥的同時(shí)，隔天用標(biāo)準(zhǔn)體重秤稱量體質(zhì)量并做好記錄，每隔2 d專人用游標(biāo)卡尺精確測量移植瘤的最大長徑和短徑，至少測量兩次取平均值。給藥結(jié)束后處死裸鼠前，眼球取血，測生化指標(biāo)和腫瘤標(biāo)志物，觀察各組荷瘤鼠生化指標(biāo)和腫瘤標(biāo)志物的變化；通過移植瘤生長抑制試驗(yàn)，組織HE染色，觀察各組移植瘤的大體形態(tài)、組織形態(tài)學(xué)的變化；免疫組化法檢測移植瘤組織中自噬相關(guān)蛋白PTEN、Beclin 1、LC3的表達(dá)變化，Western blot法進(jìn)一步檢驗(yàn)相關(guān)蛋白變化。結(jié)果裸鼠處死后，HeLa、SiHa組中生理鹽水組、10%乙醇組、GLB低劑量組和高劑量組生化指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；GLB低劑量組和高劑量組的腫瘤標(biāo)志物較生理鹽水組、10%乙醇組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；GLB低劑量組和高劑量組的移植瘤體積均明顯小于生理鹽水組和10%乙醇組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；HE染色顯示：GLB低劑量組和高劑量組移植瘤組織出現(xiàn)凋亡、壞死改變；HeLa和SiHa組心肝脾肺腎均未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞；免疫組化法、Western-blot法結(jié)果示：GLB低劑量組和高劑量組的腫瘤組織PTEN、Beclin 1及LC3蛋白表達(dá)水平較生理鹽水組和10%乙醇組明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論GLB對人宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞移植瘤的生長具有明顯的抑制作用，其機(jī)制可能與上調(diào)PTEN、Beclin 1、LC3的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬凋亡有關(guān)。

宮頸癌；藍(lán)萼乙素；裸鼠；移植瘤；抑瘤率

宮頸癌在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中占第一位[1]。近年來普查發(fā)現(xiàn)感染HPV高?；蛐偷幕颊邤?shù)量增多，一部分人群不愿意接受手術(shù)或者放化療，同時(shí)對于患有消耗型疾病，癌癥終末期或者腫瘤復(fù)發(fā)的患者，手術(shù)及放療對機(jī)體造成永久性的損害，化療藥物的毒副反應(yīng)過大機(jī)體不能耐受，新的有效治療方案亟待被提出；近年來由于我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，中藥提取工藝穩(wěn)步提升，中草藥在藥理作用和分子生物學(xué)的研究得到進(jìn)一步細(xì)化。藍(lán)萼乙素是白素平等[2]從藍(lán)萼香茶菜類植物中提取的二帖類化合物，研究表明，藍(lán)萼香菜素對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[3]，白潔宇等[4]研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)萼乙素對宮頸癌細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，其機(jī)制主要為誘導(dǎo)細(xì)胞自噬及凋亡。目前GLB對在體宮頸癌細(xì)胞增殖的研究尚缺乏，本文對此進(jìn)一步研究，為宮頸癌的臨床治療理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品及主要材料藍(lán)萼乙素白色粉劑由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院提供，純度≥99%，分子量374.4；DMEM、胰酶為Hyclone生產(chǎn)，胎牛血清為美國Gibcol生產(chǎn)，磷酸鹽緩沖液(PBS)實(shí)驗(yàn)室配置，高壓滅菌后使用，蘇木素、伊紅、無水乙醇等試劑均為市售分析純。兔抗PTEN單抗為英國Abcam產(chǎn)品，鼠抗GAPDH抗體，兔抗Beclin、LC3多克隆抗體為武漢三鷹產(chǎn)品Protein-Tech，HRP山羊抗兔、抗小鼠IgG(H+L)二抗、蛋白上樣緩沖液(5×)、BCA試劑盒、彩色預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量Marker、超敏ECL發(fā)光液購于Beyotime，PVDF膜購于美國Millipore公司，免疫組化粘附載玻片購于江蘇世泰，免疫組化試劑盒通用型SP檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒(20×)購于中杉金橋。

1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及動(dòng)物宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞系由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院腫瘤逆轉(zhuǎn)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；SPF級(jí)IVC BALB/C健康雌性裸鼠40只，4～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，SCXK(京)：2012-0001。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物配制HeLa、SiHa細(xì)胞：DMEM培養(yǎng)基，加10%南美胎牛血清和1%青-鏈霉素雙抗，培養(yǎng)條件為37℃恒溫，5%的CO2飽和度，飽和濕度，細(xì)胞均勻貼壁生長，至70%～80%匯合，胰酶消化傳代。

1.4 裸鼠皮下移植瘤建立和給藥方案收集80%融合的宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞，1 500 r/min離心3 min，以PBS輕輕吹打，使沉淀懸浮均勻，顯微鏡下計(jì)數(shù)，活體瘤細(xì)胞數(shù)2×107個(gè)/0.4 mL，用臺(tái)盼藍(lán)染色2 min后在鏡下觀察計(jì)數(shù)板計(jì)算活細(xì)胞數(shù)大于90%；75%酒精消毒后，取細(xì)胞懸液0.2 mL，提起局部皮膚，針頭25°角傾斜注射于裸鼠右大腿根部背側(cè)皮下，緩慢退針，快速拔針，建立HeLa、SiHa兩種細(xì)胞移植瘤模型。分別將第10天成瘤的HeLa荷瘤鼠和第14天左右成瘤的SiHa荷瘤鼠又隨機(jī)分為生理鹽水組、10%乙醇組、GLB低劑量組和高劑量組，每組5只。GLB用10%的酒精溶解后，HeLa組分別給予GLB 0.15μmol/g、0.20μmol/g、0.15μmol/g的生理鹽水和10%的酒精0.4 mL/只；SiHa分別給予GLB 0.18μmol/g、0.24μmol/g、0.15μmol/g的生理鹽水和10%的酒精0.4 mL/只。腹腔注射隔天給藥，20 d后處死裸鼠，測量處理后各組移植瘤的大小及瘤重，計(jì)算抑瘤率。

1.5 取材及指標(biāo)檢測每天觀察裸鼠一般狀態(tài)，待各組移植瘤體積大約為0.1 cm3時(shí)經(jīng)腹腔注射給藥，隔天相同時(shí)間給藥，每3 d中午10時(shí)，固定的測量員用游標(biāo)卡尺測量其最大長短徑，并記錄；20 d后，稱取所有裸鼠體重后快速摘眼球取血后斷頸處死，無菌試管收集全血，剝離瘤體稱重，測量移植瘤最大長短徑。按公式計(jì)算；抑瘤率=(1-GLB處理組平均瘤重/GLB未處理組平均瘤重)×100%；腫瘤體積抑制率=(1-GLB處理組平均瘤體積/GLB未處理組平均瘤體積)×100%；其中腫瘤體積V=最大長徑(L)×最大短徑(W)2/2。

1.6 組織病理學(xué)觀察取瘤后，用事先配置好的10%中性福爾馬林溶液固定。石蠟冰凍包埋，4μm連續(xù)切片取材，常規(guī)HE染色。經(jīng)病理科診斷醫(yī)師雙盲法獨(dú)立閱片，光鏡下觀察各組裸鼠移植瘤組織及各個(gè)臟器的鏡下觀及病理組織學(xué)變化。

1.7 PTEN、Beclin 1、LC3蛋白的檢測制片后，按通用型SP試劑盒說明書對移植瘤組織進(jìn)行免疫組化染色，滴加PBS作為空白對照。PTEN陽性表達(dá)為胞質(zhì)和(或)胞核呈棕黃色，Beclin 1、LC3陽性表達(dá)為胞質(zhì)和(或)胞核呈棕褐色或棕黃色；每張切片在×400倍鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)不少于103個(gè)，計(jì)數(shù)PTEN、Beclin 1、LC3陽性細(xì)胞數(shù)百分比，取平均值。結(jié)果判定參照Axiotis等[5]的標(biāo)準(zhǔn)，400倍光鏡下，根據(jù)染色的強(qiáng)度、陽性細(xì)胞占總數(shù)的比例進(jìn)行判定。

1.8 PTEN、Beclin 1、LC3蛋白的檢測把移植瘤組織從-80℃取出置于研磨器，加入適量的RIPA裂解液研磨，冰上裂解，吸取上清液體移入EP管置于-80℃的冰箱中儲(chǔ)存，采用BCA法蛋白定量，Western blot法檢測，SDS-PAGE凝膠的配制具體步驟依據(jù)說明書進(jìn)行，電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h。分別以兔抗人PTEN單抗(1：100稀釋)兔抗人Beclin1、LC3多抗(1：1 000稀釋)為一抗，以HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)為二抗進(jìn)行顯色分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠一般情況HeLa細(xì)胞接種后第10天起，SiHa細(xì)胞接種后第14天起，裸鼠右大腿根部背側(cè)部均出現(xiàn)米粒大小的瘤體，40只裸鼠全部成瘤，給藥前各組間平均腫瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。腹腔注射藍(lán)萼乙素后，裸鼠的飲水及進(jìn)食量無明顯增減，糞便、尿液正常；精神狀態(tài)良好，皮膚呈粉紅色，肢體運(yùn)動(dòng)靈；移植瘤組織表面皮膚無破潰。

2.2 各組瘤體大小及抑制瘤生長曲線比較GLB低、高劑量組的腫瘤體積與生理鹽水組、10%乙醇組的瘤體積比較，生長速度明顯減緩；見圖1和圖2。

圖1HeLa各組移植瘤體生長曲線

圖2SiHa各組移植瘤體生長曲線

2.3 GLB對各組荷瘤鼠瘤重的影響HeLa組各組瘤重比較，GLB低劑量和高劑量組瘤重均較生理鹽水組、10%乙醇組輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1；SiHa組各組瘤重比較，GLB低劑量和高劑量組瘤重均較生理鹽水組、10%乙醇組輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。

表1 GLB對人宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤瘤重的影響

表1 GLB對人宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤瘤重的影響

注：與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與10%乙醇組比較，bP＜0.05；與GLB低劑量組比較，cP＜0.05。

組別只數(shù)瘤重(g)生理鹽水組10%乙醇組GLB低劑量組GLB高劑量組F值P值5 5 5 5 2.29±0.16 2.27±0.25 1.75±0.11ab1.42±0.06abc32.10 0.00

表2 GLB對人宮頸癌SiHa細(xì)胞裸鼠移植瘤瘤重的影響

表2 GLB對人宮頸癌SiHa細(xì)胞裸鼠移植瘤瘤重的影響

注：與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與10%乙醇組比較，bP＜0.05；與GLB低劑量組比較，cP＜0.05。

組別只數(shù)瘤重(g)生理鹽水組10%乙醇組GLB低劑量組GLB高劑量組F值P值5 5 5 5 1.46±0.12 1.40±0.04 1.08±0.10ab0.72±0.07abc78.24 0.00

2.4 GLB對荷瘤鼠腫瘤生長體積的影響HeLa組處理后瘤體積的比較，GLB低劑量和高劑量組腫瘤生長體積小于生理鹽水組和10%乙醇組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3；腫瘤生長抑制率隨GLB劑量增大逐漸增高，分別為27.10%、42.46%。SiHa組處理后瘤體積的比較，GLB低劑量和高劑量組腫瘤生長體積小于生理鹽水組和10%乙醇組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表4；腫瘤生長抑制率隨GLB劑量增大逐漸增高，分別為33.45%、42.90%。

2.5 荷瘤鼠血生化指標(biāo)和腫瘤標(biāo)志物的檢測采用摘眼球取血法檢測荷瘤鼠的Cr、BUN、ALT、AST、WBC數(shù)目和CA125、CEA的變化。檢測結(jié)果表明，GLB作用后HeLa、SiHa組荷瘤鼠的Cr、BUN、ALT、AST、WBC比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；GLB作用后，HeLa組和SiHa組的GLB低、高劑量組荷瘤鼠的CA125、CEA較生理鹽水組和10%乙醇組減少，且隨GLB濃度增加，CA125、CEA值降低，有濃度依賴性；組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；見表5、表6和表7、表8。

2.6 HeLa組和SiHa組各組瘤組織的病理學(xué)觀察生理鹽水組、10%乙醇組腫瘤細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞大小形態(tài)不一，細(xì)胞核異形性明顯；GLB低、高劑量組腫瘤細(xì)胞排列紊亂，分界不清楚出現(xiàn)均質(zhì)紅染的壞死區(qū)域。HE染色結(jié)果顯示，裸鼠的心、肝、肺、脾、腎組織無明顯病理改變，未見轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞。

2.7 Western blot法檢測各組裸鼠移植瘤組織中PTEN和Beclin 1及LC3蛋白的表達(dá)見圖3，GLB低、高劑量組PTEN和Beclin 1及LC3蛋白的表達(dá)較生理鹽水組、10%乙醇組明顯增高，且具有GLB濃度依賴性。

表3GLB對人宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長體積的影響

表3GLB對人宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長體積的影響

注：與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與10%乙醇組比較，bP＜0.05；與GLB低劑量組比較，cP＜0.05。

組別生理鹽水組10%乙醇組GLB低劑量組GLB高劑量組968.50±46.62 931.75±37.81 709.00±45.11ab517.25±6.70abc5 5 5 5 112.00±10.42 95.75±4.57 88.68±1.58 92.00±5.42 F值P值處理后瘤體積(mm3) 216.55 0.00只數(shù)處理前瘤體積(mm3) 132.40 0.12

表4 GLB對人宮頸癌 SiHa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長體積的影響

表4 GLB對人宮頸癌 SiHa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長體積的影響

注：與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與10%乙醇組比較，bP＜0.05；與GLB低劑量組比較，cP＜0.05。

組別生理鹽水組10%乙醇組GLB低劑量組GLB高劑量組F值P值只數(shù)5 5 5 5處理前瘤體積(mm3) 87.33±9.02 90.55±8.77 102.25±5.25 104.75±6.08 245.32 0.20處理后瘤體積(mm3) 495.67±16.26 485.50±10.66 252.00±18.70ab203.75±15.26abc365.60 0.00

表5HeLa各組CA125的比較

表5HeLa各組CA125的比較

注：與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與10%乙醇組比較，bP＜0.05；與GLB低劑量組比較，cP＜0.05。

組別生理鹽水組10%乙醇組GLB低劑量組GLB高劑量組F值P值只數(shù)5 5 5 5 CA125(U/mL) 12.30±0.90 12.03±0.65 5.09±0.42ab3.40±0.34abc282.39 0.00

表6HeLa各組CEA的比較

表6HeLa各組CEA的比較

注：與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與10%乙醇組比較，bP＜0.05；與GLB低劑量組比較，cP＜0.05。

組別CEA(ng/mL)只數(shù)80.63±0.69 79.80±0.77 7.57±0.90ab5.91±0.35abc147 833.64 0.00生理鹽水組10%乙醇組GLB低劑量組GLB高劑量組F值P值10 10 10 10

表7SiHa各組腫瘤標(biāo)志物的比較

表7SiHa各組腫瘤標(biāo)志物的比較

注：與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與10%乙醇組比較bP＜0.05；與GLB低劑量組比較，cP＜0.05。

組別只數(shù)CA125(U/mL)生理鹽水組10%乙醇組GLB低劑量組GLB高劑量組F值P值10 10 10 10 11.63±0.44 12.10±0.67 5.30±0.34ab2.86±0.23abc477.78 0.00

表8SiHa各組腫瘤標(biāo)志物的比較

表8SiHa各組腫瘤標(biāo)志物的比較

注：與生理鹽水組比較，aP＜0.05；與10%乙醇組比較，bP＜0.05；與GLB低劑量組比較，cP＜0.05。

組別只數(shù)CEA(ng/mL) 76.97±1.65 76.92±0.70 8.07±0.81ab4.69±0.40abc8 699.722 0.00生理鹽水組10%乙醇組GLB低劑量組GLB高劑量組F值P值10 10 10 10

圖3 Western blot法檢測HeLa和SiHa移植瘤組織中PTEN和Beclin 1及LC3蛋白的表達(dá)

2.8 瘤組織相關(guān)蛋白PTEN、Beclin 1、LC3表達(dá)的比較兩組細(xì)胞移植瘤模型中，與生理鹽水組、10%乙醇組比較，GLB高、低劑量組表達(dá)均明顯升高，見圖4。PTEN蛋白陽性表達(dá)主要定位于胞核，部分胞漿表達(dá)，呈棕黃色顆粒狀；Beclin 1、LC3蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞漿，部分胞核表達(dá)，呈棕褐色顆粒狀。

圖4SP免疫組化法

3 討論

近年來隨著宮頸癌病毒學(xué)檢查的普及，宮頸癌高危HPV病毒基因型感染率的升高引起我們的重視，然而對于宮頸癌的治療，手術(shù)、放化療對腫瘤的抑制作用有限，且對患者自體損傷較大。近年來中藥的應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣，研究發(fā)現(xiàn)藍(lán)萼香茶菜有抗菌消炎、護(hù)肝、保護(hù)心肌和抗癌等活性[6]；藍(lán)萼甲素(GLA)、GLB是從藍(lán)萼香茶菜中提取的二萜化合物，國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)GLA對體外培養(yǎng)的人慢粒白血病K562細(xì)胞，人肺癌A-549細(xì)胞的增殖有抑制作用[7-8]，對女性生殖系統(tǒng)腫瘤細(xì)胞如人卵巢癌HO8910細(xì)胞[9]、人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞[10]和腺癌HeLa[11]細(xì)胞均有抑制作用；李嘉鋅等[12]發(fā)現(xiàn)GLA對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性，機(jī)制可能是使該細(xì)胞生長停滯在G1期，使p53功能恢復(fù)，從而起到殺傷腫瘤的作用；李曉敏等[13]觀察到GLA能上調(diào)動(dòng)物體內(nèi)p53的表達(dá)。GLB是GLA的羥基乙?；?，海廣范等[14]研究表明GLB可誘導(dǎo)人肺腺癌AGZY細(xì)胞凋亡；Pan等[4]在人宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞和腺癌HeLa細(xì)胞中研究證實(shí)GLB可明顯抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖，可能通過使p-AKT基因的表達(dá)下調(diào)，LC3、PTEN、PARP的表達(dá)上調(diào)，來誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡、自噬；此實(shí)驗(yàn)研究GLB對在體宮頸癌移植瘤組織的抑制作用。人Beclin1基因(分子質(zhì)量約為60 kD)與大小鼠Beclin1基因高度同源，它是細(xì)胞自噬的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)控因子，是自噬體形成必備的條件之一[15]；Wang等[16]使宮頸癌HeLa細(xì)胞中Beclin1過表達(dá)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬、凋亡水平均增加，Caspase9水平增加，通過Caspase9調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。微管相關(guān)蛋白LC3基因分為胞漿型(LC3-Ⅰ)和膜型(LC3-Ⅱ)；自噬形成時(shí)，胞漿型LC3會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば?，因此，LC3-Ⅱ/Ⅰ比值越大自噬水平越高[17]。腫瘤抑制基因PTEN是與張力蛋白同源，在10號(hào)染色體有缺失的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)，PTEN編碼的脂質(zhì)磷酸酯酶可使得腫瘤的生長被負(fù)性調(diào)控，使得腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移可以得到抑制，PTEN可通過脂質(zhì)磷酸酶使得PIP3降解為PIP2，在PI3K/AKT信號(hào)通路中促使細(xì)胞凋亡；PTEN的失活必然導(dǎo)致PI3K/AKT信號(hào)通路的激活[18]，進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用；Chang等[19]研究表明，通過使用該信號(hào)通路的抑制劑可以增加前列腺癌患者對放射治療的敏感性。實(shí)驗(yàn)采用了HE染色法，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，GLB治療后移植瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)大片凋亡、壞死改變，與生理鹽水組、10%乙醇組有明顯差異；應(yīng)用Western blot免疫組化方法檢測，表明在兩種裸鼠移植瘤中GLB高劑量和低劑量組的Beclin 1、LC3、PTEN的表達(dá)量，較各對照組均明顯升高，該結(jié)果與移植瘤體積生長抑制率的結(jié)果相一致。

總之，此研究提示GLB具有在體抗腫瘤作用，為治療宮頸癌提供行之有效的方案；但該實(shí)驗(yàn)只探討PTEN-PI3K/Akt/mTOR途徑和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，關(guān)于該藥是否通過其他途徑誘導(dǎo)自噬凋亡，需要進(jìn)一步的研究。

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Inhibitory effect of GLB on two kinds of cervical cancer cell lines transplanted tumor in nude mice and its mechanism.

QIAN Wen-jun,PAN Ying,BAI Jie-yu,HE Quan-zhong,SUN Li.The Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Xinxiang 453000,Henan,CHINA

ObjectiveTo study the inhibitory effect of Glaucocalyxin B(GLB)on two kinds of cervical cancer cell lines HeLa and SiHa transplanted tumor in nude mice and its mechanism.MethodsHuman cervical cancer HeLa and SiHa cells were transplanted into nude mice in right thigh dorsal subcutaneously to establish the transplanted tumor model of HeLa and SiHa cell.When the transplanted tumor volume was about 0.1 cm3,HeLa cell were randomly divided into 4 groups at the tenth day.At the fourteenth day,SiHa group were randomly divided into 4 groups,namely normal saline group,10%ethanol group,GLB low dose group and high dose group,with 5 mice in each group.Through intraperitoneal injection,HeLa group was injected with 0.4 mL physiological saline,0.4 mL 10%ethanol,0.4 mL GLB(0.15 μmol/g) and 0.4 mL GLB(0.20 μmol/g),once every other day for 20 days.SiHa group was injected with 0.4 mL physiological saline,0.4 mL 10%ethanol,0.4 mL GLB(0.18 μmol/g)and 0.4 mL GLB(0.24 μmol/g),once every other day for 20 days. At the same time as intraperitoneal injection,the maximum diameter and minor diameter of the transplanted tumor were accurately measured at least two times for average by a Vernier caliper every 2 days.Before the administration of the nude mice,the nude mice were sacrificed and the blood samples were taken from the naked eye to measure and observe changes of biochemical indexes and tumor markers.Through the tumor growth inhibition test and transplanted tumor tissue HE staining,transplanted tumor gross morphology and histomorphological changes of each group were observed. The expression of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten(PTEN),Beclin 1 and LC3 in transplanted tumor tissues was detected by immunohistochemistry,and the changes of related proteins were detected by Western-blot.ResultsThere was no significant difference in biochemical indexes for physiological saline group,10%ethanol group,GLB low dose group and high dose group(P＞0.05).The tumor markers of GLB low dose group and highdose group were significantly lower than those of saline group and 10%ethanol group(P＜0.05).The tumor volume of GLB low dose group and high dose group were significantly lower than those in the saline group and 10%ethanol group (P＜0.05).HE staining showed more apoptosis and necrosis were observed in transplanted tumor tissue of GLB low dose group and high dose group,and no metastatic tumor cells were found in heart,liver,spleen,kidney and lung of HeLa and SiHa group.The results of immunohistochemistry and Western-blot showed that the expression levels of PTEN,Beclin 1 and LC3 protein in tumor tissues of GLB low dose group and high dose group were significantly higher than those in saline group and 10%ethanol group(P＜0.05).ConclusionGLB can inhibit the growth of human cervical cancer cell line HeLa and SiHa cells in nude mice,and its mechanism may be related to the up-regulation expression of tumor suppressor gene PTEN,microtubule associated protein LC3,autophagy gene Beclinl protein expression and induction of autophagy and apoptosis.

Cervical cancer;Glaucocalyxin B(GLB);Nude mice;Transpianted tumor;Tumor suppression rate

R-332

A

1003—6350（2017）14—2237—06

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.14.001

2017-03-06)

河南省教育廳資助項(xiàng)目(編號(hào)：14B320004)

潘瑩。E-mail：1063919310@qq.com