北京大學(xué)深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科 （廣東 深圳 518036）

吳 嘉 徐秀雙 謝 謙 徐曉燕 唐春梅

外周血中樹突狀細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子水平與Graves病的關(guān)聯(lián)分析*

北京大學(xué)深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科 （廣東 深圳 518036）

吳 嘉 徐秀雙 謝 謙 徐曉燕 唐春梅

目的 檢測(cè)Graves病患者在治療前后外周血中樹突狀細(xì)胞（DCs）不同亞群和相關(guān)細(xì)胞因子的數(shù)量和表達(dá)情況，并與健康對(duì)照組進(jìn)行比較，分析DCs細(xì)胞亞群和相關(guān)細(xì)胞因子與Graves病的關(guān)聯(lián)性。方法 利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)56例Graves病患者和30名健康體檢者的外周血樹突狀細(xì)胞亞群數(shù)量，其中Graves病患者中30人為治療前組、26人為治療后組，同時(shí)利用ELISA檢測(cè)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）及白細(xì)胞介素-6（IL-6）等細(xì)胞因子的水平。結(jié)果 測(cè)定得出Graves病治療前組漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（mDC）和髓樣樹突狀細(xì)胞（pDC）值顯著高于健康對(duì)照組，經(jīng)治療后mDC和pDC值明顯降低，略高于健康對(duì)照組。通過對(duì)比3組細(xì)胞因子水平發(fā)現(xiàn)，Graves病治療前組患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平均高于其他2組，治療后組與健康對(duì)照組的細(xì)胞因子水平相近。結(jié)論 Graves病患者血中樹突狀細(xì)胞（DC）明顯升高，細(xì)胞因子分泌失調(diào)，經(jīng)治療病情好轉(zhuǎn)后，DC和細(xì)胞因子水平逐漸恢復(fù)正常，提示DC和細(xì)胞因子可能參與Graves病的發(fā)病機(jī)制，并有望作為分析Graves病治療效果的一項(xiàng)依據(jù)。

Graves?。粯渫粻罴?xì)胞；細(xì)胞因子

Graves病(Graves'diseaes,GD)又稱為毒性彌漫性甲狀腺腫，是一種器官特異性的自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)[1]。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cells，APC)，根據(jù)其表面標(biāo)記，其可分為髓樣樹突狀細(xì)胞(mDC)和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(pDC)[2]。它能高效地?cái)z取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DC具有較強(qiáng)的遷移能力，而成熟的DC能有效激活初始型T淋巴細(xì)胞向Th1、Th2細(xì)胞分化，是啟動(dòng)、調(diào)控和維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)[3]。本研究采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)Graves病患者在治療前后外周血中mDC及pDC亞群的變化，同時(shí)用ELISA檢測(cè)Th1、Th2相關(guān)的細(xì)胞因子，并與健康對(duì)照組進(jìn)行比較，以探討DC細(xì)胞亞群與Th1、Th2細(xì)胞失衡的關(guān)系，進(jìn)一步研究DC細(xì)胞亞群和相關(guān)細(xì)胞因子與Graves病的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集我院內(nèi)分泌科在2013年5月至2014年2月期間住院或門診就診的Graves病患者56例，均無其他自身免疫性疾病，且1年內(nèi)未使用過免疫抑制劑。其中男性31例，占55.4%；女性25例，占44.6%；平均年齡43.5歲。并選取30例Graves病患者檢測(cè)治療前DC和細(xì)胞因子水平，作為治療前組；另選取26例Graves患者在抗甲狀腺功能亢進(jìn)治療后血甲狀腺功能恢復(fù)正常，作為治療后組；同期選取30例年齡和性別匹配的健康志愿者作為健康對(duì)照組，男女各15例,平均年齡為42.7歲。三組的平均年齡、性別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。

1.2 主要儀器和試劑流式細(xì)胞儀B D FACSArial，淋巴細(xì)胞分離液，熒光抗體，mDC標(biāo)記試劑：(CD14 +，CD16 +)-FITC/CD85K-PE/CD123-PC5；pDC標(biāo)記試劑：(CD14 +，CD16 +)-FITC/CD85K-PE/ CD33-PCS；鞘液、溶血素、HUMAN TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6 ELISA KIT等。

1.3 方法

1.3.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離：取研究對(duì)象的抗凝靜脈血5mL，1000r/min轉(zhuǎn)速離心10min，取上層血清再加入等體積的PBS液稀釋1倍，隨后加入淋巴細(xì)胞分離液，3000r/min密度梯度離心20min，吸取單核細(xì)胞層置于15mL離心管中，并用PBS液洗滌2次，最后得到PBMC，通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.3.2 DC比例檢測(cè)：吸取200μL PBMC細(xì)胞懸浮液分別加入熒光抗體mDC標(biāo)記試劑和pDC標(biāo)記試劑；另取200μL PBMC細(xì)胞懸浮液加入FITC-mouse IgG和PE-mouse IgG混合均勻后置于室溫避光30min；每管均要用2mL PBS洗滌3次，再加入1mL PBS重懸，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)mDC和pDC占淋巴細(xì)胞的比例。

1.3.3 細(xì)胞因子檢測(cè)：按照ELISA試劑盒說明書操作，分別檢測(cè)3組研究對(duì)象血清中TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-6等細(xì)胞因子水平。并使用酶標(biāo)儀檢測(cè)492nm處吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到3組研究對(duì)象血清中細(xì)胞因子的濃度。

2 結(jié) 果

2.1 外周血中mDC和pDC水平比較分析3組研究對(duì)象的外周血DC亞群水平變化，結(jié)果顯示Graves病患者在治療前mDC和pDC在外周血DC中的比例較健康對(duì)照組均顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而治療后組DC亞群水平略高于健康對(duì)照組，較治療前明顯降低，如表1所示。

2.2 血清中4種細(xì)胞因子水平檢測(cè)通過ELISA試劑盒檢測(cè)Graves病治療前后組和健康對(duì)照組患者血清中細(xì)胞因子的濃度，結(jié)果見表2。對(duì)比治療前組和健康對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)治療前組患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6細(xì)胞因子均高于健康對(duì)照組，其中TNF-α在Graves患者中增多達(dá)266%(P＜0.05)，而IL-2水平在治療前組顯著降低，降幅達(dá)到331%(P＜0.05)。經(jīng)治療病情好轉(zhuǎn)后，可見治療后組的細(xì)胞因子水平逐漸恢復(fù)，與健康對(duì)照組接近。

3 討 論

隨著現(xiàn)代人生活節(jié)奏的加快，精神壓力的增加，導(dǎo)致Graves病發(fā)病率逐年升高，已成為甲狀腺功能亢進(jìn)癥中最為常見的一種。然而其具體發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。近年的研究認(rèn)為，Graves病的發(fā)生發(fā)展是促甲狀腺激素受體抗受體抗體(TSH receptor antibody，TRAb)對(duì)甲狀腺刺激的結(jié)果，TRAb可持續(xù)而強(qiáng)烈地興奮甲狀腺細(xì)胞上的TSH受體，激化cAMP途徑，使甲狀腺細(xì)胞增生肥大，從而激活甲狀腺細(xì)胞代謝，合成甲狀腺激素功能增強(qiáng)。Graves病患者體內(nèi)同時(shí)存在體液免疫及細(xì)胞免疫紊亂，屬于器官特異性自身免疫病，因此調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、輔助性T細(xì)胞(Th)、調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(Berg)以及樹突狀細(xì)胞等機(jī)體免疫細(xì)胞必然與Graves病的免疫病理形成密切相關(guān)。

表1 Graves病患者治療前后組別與健康對(duì)照組DC亞群在外周血單核細(xì)胞的比例

表1 Graves病患者治療前后組別與健康對(duì)照組DC亞群在外周血單核細(xì)胞的比例

注：a：P＜0.05，治療前組與健康對(duì)照組比較；b：P＜0.05，治療后組與治療前組比較

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表2 Graves病患者治療前后組別與健康對(duì)照組血清中細(xì)胞因子濃度的比較（pg/mL）

樹突狀細(xì)胞可直接向循環(huán)中的T細(xì)胞提呈抗原，調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答。根據(jù)細(xì)胞表型可分為mDC和pDC兩個(gè)亞群，其中mDC是人體主要的抗原提呈細(xì)胞，可引起Th1免疫應(yīng)答，促進(jìn)細(xì)胞免疫的發(fā)生；pDC除了有較弱的抗原提呈功能外，在人體受到病毒攻擊時(shí)能產(chǎn)生大量干擾素，抑制病毒復(fù)制并增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，主要引起Th2免疫應(yīng)答，在體液免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[4]。為進(jìn)一步探究DC細(xì)胞亞群與Graves病的關(guān)聯(lián)性，本研究通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者在治療前后外周血中mDC和pDC占淋巴細(xì)胞的比例，并與正常人的DC細(xì)胞亞群水平進(jìn)行比較分析。此外，Th1和Th2細(xì)胞水平反映機(jī)體免疫應(yīng)答狀態(tài)，為研究Graves病的發(fā)病機(jī)制，可通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中Th1和Th2細(xì)胞分泌的各細(xì)胞因子數(shù)量，從而分析Th1和Th2細(xì)胞水平，其中Th1細(xì)胞主要分泌IL-2和IFN-γ細(xì)胞因子[5]，而Th2細(xì)胞主要表達(dá)IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子[6]。另有研究證實(shí)，IFN-α作為pDC分泌的細(xì)胞因子，與Graves病等自身免疫性甲狀腺疾病的發(fā)生密切相關(guān)，因此一并作為本研究的監(jiān)測(cè)指標(biāo)[7-8]。

由研究結(jié)果可知，相比于健康對(duì)照組，Graves病治療前組患者外周血中mDC和pDC水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明治療前患者的細(xì)胞免疫和體液免疫明顯紊亂。而經(jīng)抗甲狀腺亢進(jìn)癥治療后患者血中mDC和pDC水平減少，與健康對(duì)照組相近，提示對(duì)癥治療后可改善機(jī)體免疫應(yīng)答。且隨著Graves患者外周血中pDC細(xì)胞占比增加，其分泌的IFN-α水平也明顯上升，明顯高于健康對(duì)照組(P＜0.05)。在治療后組中，隨著pDC水平的降低，IFN-α水平也逐漸恢復(fù)正常。此外，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)治療前組INF-γ和IL-6水平均有所升高，而IL-2水平則顯著降低(P＜0.05)?；颊咴诮?jīng)過治療后，免疫功能逐漸恢復(fù)，血中INF-γ、IL-6和IL-2水平均有所改善，與健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，Graves病作為一種器官特異性自身免疫病，與調(diào)控機(jī)體免疫應(yīng)答的DC亞群和細(xì)胞因子水平密切相關(guān)，并且經(jīng)過抗甲狀腺亢進(jìn)癥治療后，患者免疫應(yīng)答功能逐漸恢復(fù)，DC亞群和細(xì)胞因子水平也將趨于正常。

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The Correlation of the Peripheral Blood Dendritic Cells and Cytokines in Graves' Disease Patients*

WU Jia, XU Xiu-shuang, XIE Qian,et al., Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen 518036, Guangdong Province, China

ObjectiveTo explore the changes of different DC subsets and the secretion of cytokines level in the peripheral blood of Graves' disease patients compared to the healthy controls. Then the correlation of them were analyzed.MethodsFlow cytometry was applied to assess the frequency of different DC subsets in peripheral blood of 56 Graves disease patients and 30 healthy cases respectively. 56 Graves disease patients were divided into the before treatment group (30 cases) and the after treatment group (26 cases). Moreover, ELISA was performed to detect the secretion of TNF-α,IFN-γ, IL-2 and IL-6 in the peripheral blood.ResultsThe frequency of pDCs and mDCs in the before treatment group was higher than in healthy cases and it was significantly decreased after treatment. The secret of TNF-α,IFN-γ and IL-6 in Graves disease patients' peripheral blood were higher than that in other groups. Nevertheless, them were found similar levels of the after treatment group and healthy cases.ConclusionDendritic cells are increased significantly and the cytokines secretion disorder in the blood of Graves patients. However, they can be decreased by treatment, which indicates that DC subsets and the secretion of cytokines level may be involved in the pathogenesis of Graves. They are hopefully used as the basis for analysis of Graves disease treatment effect.

Graves' Disease; Dendritic Cells; Cytokine

R361+.3

A

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（201203029）

10.3969/j.issn.1009-3257.2017.04.024

2017-07-11

吳 嘉，男，內(nèi)分泌學(xué)專業(yè)，副主任醫(yī)師， 主要研究方向：糖尿病、甲狀腺疾病等

吳 嘉