劉 煥,楊 婕,黃少文,劉瑞菁,賀永健,柳春紅(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510642)

?

桑葚粗提液對(duì)壬基酚誘導(dǎo)大鼠焦慮行為的干預(yù)作用及其機(jī)制

劉 煥,楊 婕,黃少文,劉瑞菁,賀永健,柳春紅*
(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510642)

目的:探討桑葚粗提液對(duì)壬基酚染毒大鼠焦慮行為的干預(yù)效果。方法:48只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(玉米油)、桑葚對(duì)照組(桑葚粗提液,按多酚含量計(jì),120 mg/kg)、壬基酚染毒組(270 mg/kg)、桑葚粗提液低、中、高劑量干預(yù)組(壬基酚灌胃劑量均為270 mg/kg,桑葚粗提液干預(yù)劑量分別為30、60和120 mg/kg),利用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(OFT)和高架十字迷宮(EPM)來觀察桑葚粗提液對(duì)壬基酚染毒大鼠焦慮行為的影響,并用ELISA試劑盒檢測(cè)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素水平和單胺氧化酶活性。結(jié)果表明,高劑量干預(yù)組大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入中央?yún)^(qū)域距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)以及在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入開臂時(shí)間百分比和進(jìn)入開臂次數(shù)百分比均顯著高于染毒組(p<0.05)。與壬基酚染毒組相比,高劑量干預(yù)組大鼠下丘腦5-羥色胺和多巴胺水平,中劑量干預(yù)組大鼠下丘腦多巴胺水平顯著下調(diào)(p<0.05),而且高劑量干預(yù)組還明顯上調(diào)單胺氧化酶的活性(p<0.05)。同時(shí)隨著干預(yù)劑量的增加,去甲腎上腺素水平逐漸降低但并無顯著性差異。結(jié)論:桑葚粗提液降低壬基酚所致焦慮大鼠下丘腦5-羥色胺、多巴胺、去甲腎上腺素水平,其作用機(jī)制可能與上調(diào)下丘腦單胺氧化酶的活性有關(guān)。

壬基酚,桑葚提取液,單胺類神經(jīng)遞質(zhì),曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn),高架十字迷宮

壬基酚聚氧乙烯醚硫酸鈉(Nonylphenol Ethoxylates,NPEs)被廣泛用于生產(chǎn)非離子表明活性劑、洗滌劑、橡膠、絕緣材料等,在日用品、醫(yī)藥、農(nóng)藥、化妝品、玩具等數(shù)十個(gè)行業(yè)中均有存在[1]。壬基酚(Nonylphenol)是合成NPEs的單體,是酚類環(huán)境雌激素之一,廣泛存在于環(huán)境中[2]。目前關(guān)于壬基酚對(duì)環(huán)境污染的研究主要集中于水體污染方面[3-6];關(guān)于壬基酚毒性的研究則基本集中于生殖毒性和免疫毒性方面[7-9],同時(shí)有研究表明環(huán)境雌激素(壬基酚,鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯)通過影響神經(jīng)遞質(zhì)間接導(dǎo)致焦慮[10-11]。目前針對(duì)外源化學(xué)物的毒性干預(yù)研究報(bào)道不多,對(duì)壬基酚神經(jīng)行為毒性的干預(yù)更是鮮有報(bào)道。

桑葚,又稱桑果、桑棗,被衛(wèi)生部列為“既是食品又是藥品”的產(chǎn)品之一,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[12-13]。到目前為止,從桑葚中已分離出150多種化合物,其中活性物質(zhì)主要為多酚和活性多糖[14]。研究認(rèn)為,桑葚具有防癌、抗氧化、抗衰老、降血糖、提高免疫力、改善大腦功能等功效[15-17]。同時(shí)有研究表明桑葚可影響大鼠的焦慮行為[18-19]。鑒于焦慮在現(xiàn)代生活中普遍發(fā)生,本研究以食品或環(huán)境污染物壬基酚為染毒物質(zhì),以桑葚提取液進(jìn)行干預(yù),通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和高架十字迷宮兩類神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)方法,從單胺神經(jīng)遞質(zhì)的角度來分析桑葚提取液對(duì)壬基酚染毒大鼠的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用,以期為人類焦慮預(yù)防提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮成熟桑葚 國(guó)家桑樹種植資源華南分圃;壬基酚 純度>99.9%,美國(guó)Sigma公司;大鼠5-羥色胺(5-HT)ELISA試劑盒、大鼠去甲腎上腺素(NE)ELISA試劑盒、大鼠多巴胺(DA)ELISA試劑盒、大鼠單胺氧化酶(MAO)ELISA試劑盒 上海江萊生物科技有限公司;雄性SPF級(jí)Sprague-Dawley(SD)大鼠 48只,4～5周,體重70～90 g,動(dòng)物及飼料均購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(粵)2013-0002,華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心許可證號(hào):SYXK(粵)2014-0136。

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱(OFT)、高架十字迷宮(EPM) 上海移數(shù)信息科技有限公司;Multiskan Mk3型多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher公司;Ethovision 8.0型行為軌跡跟蹤分析系統(tǒng) 荷蘭Noldus公司;大鼠飼養(yǎng)籠 蘇杭科技器材有限公司;Lab-1B-80真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康有限公司;ultraLC 110-XL HPLC AB SCIEX Triple TOF 5600超高效液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)SCIEX公司。

1.2 桑葚粗提液制備

參考胡金奎的方法[20],略有改動(dòng)。新鮮桑葚冷凍干燥后粉碎過60目篩,樣品-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?準(zhǔn)確稱取一定量的桑葚粉末,浸入一定量乙醇(體積分?jǐn)?shù)80%、料液比為1∶15),超聲輔助提取90 min,桑葚果渣重復(fù)超聲提取,得到的總提取液在3000 r/min的條件下離心10 min,隨之進(jìn)行真空抽濾,濾液于45 ℃減壓旋蒸除去乙醇并濃縮,儲(chǔ)存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 多酚含量測(cè)定

采用福林-酚法測(cè)定桑葚粗提液多酚含量[21]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:準(zhǔn)確稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品50 mg,用乙醇(80%)定容至50 mL,得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)母液(1 mg/mL)。分別將母液稀釋成50、100、150、200、250、300、350、400 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。分別取125 μL的標(biāo)準(zhǔn)液加入125 μL的福林酚混合靜置6 min,加入7% Na2CO3(1.25 mL),用水調(diào)至3 mL(加水1.5 mL),放置90 min,760 nm測(cè)定吸光度,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測(cè)定:將提取液稀釋100倍,取125 μL按上述步驟測(cè)定吸光度,以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算桑葚粗提液多酚的含量。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

大鼠單籠飼養(yǎng),光/暗周期12 h/12 h(光照時(shí)間07:00～19:00),室內(nèi)溫度為(22±0.5) ℃,濕度為50%～60%。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,適應(yīng)期及干預(yù)期內(nèi)所有大鼠自由攝食和飲水。適應(yīng)期后按體重采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分組法分為6組:正常對(duì)照組、壬基酚染毒組、桑葚對(duì)照組、桑葚粗提液低、中、高劑量干預(yù)組,每組8只。正常對(duì)照組:玉米油;壬基酚染毒組:壬基酚270 mg/kg;桑葚對(duì)照組:以多酚含量計(jì),120 mg/kg;3個(gè)干預(yù)組為壬基酚270 mg/kg+桑葚粗提液30、60或120 mg/kg。每天上午9:00干預(yù)組與染毒組灌胃壬基酚(溶于玉米油),正常對(duì)照組和桑葚對(duì)照組灌胃等體積(2 mL)玉米油;1 h后,桑葚對(duì)照組和干預(yù)組灌胃桑葚粗提液(溶于生理鹽水),對(duì)照組與染毒組灌胃等體積(2 mL)生理鹽水,連續(xù)灌胃28 d。

1.5 行為學(xué)測(cè)試

行為實(shí)驗(yàn)前,徹底清潔OFT和EPM裝置,設(shè)置好相關(guān)程序,保證實(shí)驗(yàn)室通風(fēng)良好。干預(yù)前后均提前1 h將所有大鼠轉(zhuǎn)移至行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室,以適應(yīng)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)開始時(shí),從籠內(nèi)輕輕取出大鼠(背對(duì)實(shí)驗(yàn)者),將大鼠放入OFT和EPM裝置,實(shí)驗(yàn)者立即離開,通過動(dòng)物行為軌跡跟蹤系統(tǒng)采集大鼠5 min內(nèi)在OFT和EPM中的活動(dòng)信息。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用75%的酒精徹底清潔裝置,并用紙巾擦干。行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)包括:曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn):總距離、中央?yún)^(qū)運(yùn)動(dòng)距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)時(shí)間、進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)、直立次數(shù)和修飾次數(shù);高架十字迷宮:進(jìn)入開臂時(shí)間百分比、進(jìn)入開臂次數(shù)百分比和入臂總次數(shù)。

1.6 下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)與MAO的測(cè)定

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,各組大鼠斷頸處死,解剖出下丘腦,并稱重,用預(yù)冷的PBS溶液沖洗下丘腦表面的血跡,濾紙吸干,制成10%下丘腦勻漿,在2000 r/min、4 ℃下離心20 min,取上清液,用相應(yīng)的ELISA試劑盒分別測(cè)定其5-HT、NE、DA及MAO的水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

表1 干預(yù)前各組大鼠OFT行為比較Table 1 Comparison of open field test behavior of rats after the experimental intervention

表2 干預(yù)后各組大鼠OFT行為比較Table 2 Comparison of open field test behavior of rats after the experimental intervention

注:與正常對(duì)照組相比,*p<0.05,**p<0.01;與壬基酚染毒組相比,#p<0.05,##p<0.01;表3、表4、圖2～圖5同。

所有數(shù)據(jù)以Mean±SD表示,n=8。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA),進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較,若方差齊時(shí),采用LSD檢驗(yàn);若方差不齊,則采用Tamhane’s檢驗(yàn),p<0.05認(rèn)為差異顯著,p<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葚粗提液多酚含量

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0034x-0.0298,R2=0.9984,得到桑葚粗提液多酚的含量為(34.86±0.09) mg/mL。

2.2 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 OFT結(jié)果 由OFT是利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的恐懼和探究的矛盾心理特性來考察動(dòng)物的焦慮狀態(tài)[22]。動(dòng)物的焦慮程度越高,越傾向于在周邊區(qū)域活動(dòng)[23]。大鼠在中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)的距離越長(zhǎng),進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的時(shí)間越長(zhǎng),進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)越多,就說明大鼠的焦慮程度越低。表1可知,各組大鼠曠場(chǎng)行為學(xué)結(jié)果在干預(yù)前均無顯著性差異(p>0.05)。

由表2可知,與正常對(duì)照組相比,桑葚對(duì)照組大鼠各指標(biāo)變化不大,無顯著性差異,為后文干預(yù)組與對(duì)照組和染毒組比較提供前提條件。與正常對(duì)照組相比,染毒組大鼠中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)的距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的時(shí)間和進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)均極顯著降低(p<0.01),說明造模成功,壬基酚能使大鼠產(chǎn)生一定的焦慮。與染毒組相比,高劑量桑葚提取液干預(yù)組大鼠中央?yún)^(qū)域運(yùn)動(dòng)距離和進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)顯著增加(p<0.05),說明桑葚粗提液具有一定的改善大鼠焦慮的效果,起到了一定的干預(yù)效果。同時(shí)隨著干預(yù)劑量的增加,大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的時(shí)間和進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)均逐漸增加。

2.2.2 EPM結(jié)果 EPM是利用動(dòng)物對(duì)新異環(huán)境的探究和對(duì)高懸開臂的恐懼形成的矛盾心理來考察動(dòng)物的焦慮狀態(tài)[24]。大鼠進(jìn)入開臂時(shí)間百分比和進(jìn)入開臂次數(shù)百分比越高,說明大鼠焦慮程度越低,反之亦然。由表3可知,各組大鼠EMP學(xué)結(jié)果在干預(yù)前均無顯著性差異(p>0.05)。

表3 干預(yù)前各組大鼠EPM行為比較Table 3 Comparison of elevated plus-maze behavior of rats before the experimental intervention

由表4可知,與正常對(duì)照組相比,桑葚對(duì)照組大鼠各指標(biāo)變化不大,無顯著性差異,為后文干預(yù)組與對(duì)照組和染毒組比較提供前提條件。與對(duì)照組相比,染毒組大鼠進(jìn)入開臂時(shí)間百分比和進(jìn)入開臂次數(shù)百分比極顯著降低(p<0.01),說明造模成功,壬基酚能使大鼠產(chǎn)生一定的焦慮。與染毒組相比,高劑量桑葚粗提液干預(yù)組大鼠進(jìn)入開臂時(shí)間百分比顯著降低(p<0.05),進(jìn)入開臂次數(shù)百分比極顯著增加(p<0.01),中劑量桑葚粗提液干預(yù)組大鼠進(jìn)入開臂次數(shù)百分比顯著增加(p<0.05),說明桑葚粗提液具有一定的改善焦慮的效果,起到了一定的干預(yù)效果。同時(shí)隨著干預(yù)劑量的增加,大鼠進(jìn)入開臂時(shí)間百分比和進(jìn)入開臂次數(shù)百分比均逐漸增加。

表4 干預(yù)后各組大鼠EPM行為比較Table 4 Comparison of open-field test behavior of rats after the experimental intervention

注:與正常對(duì)照組相比,*p<0.05,**p<0.01;與壬基酚染毒組相比,#p<0.05,##p<0.01。

綜上所述,干預(yù)后,壬基酚染毒組大鼠進(jìn)入中央?yún)^(qū)域距離、進(jìn)入中央?yún)^(qū)域的時(shí)間及進(jìn)入中央?yún)^(qū)域次數(shù)極顯著低于正常對(duì)照組(p<0.01),壬基酚染毒組大鼠進(jìn)入開臂時(shí)間百分比和進(jìn)入開臂次數(shù)百分比也極顯著低于正常對(duì)照組(p<0.01),兩種行為學(xué)測(cè)試都一致表明:壬基酚暴露誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生焦慮行為。由于壬基酚、雙酚A等環(huán)境內(nèi)分泌干擾物與17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,能與雌激素受體結(jié)合,在機(jī)體內(nèi)模擬E2發(fā)揮作用[25]。由此可推斷,壬基酚可能與雙酚A一樣發(fā)揮擬雌激素樣相應(yīng),影響E2與雌激素受體的結(jié)合,從而使大鼠產(chǎn)生焦慮的狀況。同時(shí)Yadav等[18]發(fā)現(xiàn)桑葚乙醇提取物可以顯著增加大鼠在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入開臂的次數(shù)和時(shí)間,而且還顯著增加大鼠在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中穿越格子數(shù),起到了一定的抗焦慮作用,與本研究結(jié)果一致。

2.3 桑葚粗提液對(duì)壬基酚染毒大鼠下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)及酶的影響

2.3.1 桑葚粗提液對(duì)壬基酚染毒大鼠下丘腦5-HT的影響 由圖1可知,與正常對(duì)照組相比,桑葚對(duì)照組大鼠下丘腦5-HT含量無顯著性變化,而染毒組大鼠下丘腦5-HT含量極顯著升高(p<0.01),說明壬基酚對(duì)下丘腦造成了一定的損傷。與染毒組相比,桑葚提取物處理組大鼠下丘腦5-HT含量呈下降趨勢(shì),其中高劑量處理組大鼠下丘腦5-HT含量顯著降低(p<0.05),說明桑葚粗提液能夠一定程度地緩解這種損傷,起到了一定的干預(yù)作用。

圖1 各組大鼠下丘腦5-HT水平的變化Fig.1 Changes in the hypothalamic of rats 5-HT levels

2.3.2 桑葚粗提液對(duì)壬基酚染毒大鼠下丘腦NE含量的影響 由圖2可知,與正常對(duì)照組相比,桑葚對(duì)照組大鼠下丘腦NE含量無顯著性變化,而染毒組大鼠下丘腦NE含量極顯著升高(p<0.01),說明壬基酚對(duì)下丘腦造成了一定的損傷。與染毒組相比,桑葚提取液處理組大鼠下丘腦NE含量呈下降趨勢(shì),但差異不顯著,說明桑葚粗提液對(duì)大鼠下丘腦NE的作用并不是很明顯。

圖2 各組大鼠下丘腦NE水平的變化Fig.2 Changes in the hypothalamic of rats NE levels

2.3.3 桑葚粗提液對(duì)壬基酚染毒大鼠下丘腦DA含量的影響 由圖3可知,與正常對(duì)照組相比,桑葚對(duì)照組大鼠下丘腦DA含量無顯著性變化,而染毒組大鼠下丘腦DA含量顯著升高(p<0.01),說明壬基酚對(duì)下丘腦造成了一定的損傷。與染毒組相比,桑葚提取液處理組大鼠下丘腦DA含量呈下降趨勢(shì),其中中劑量和高劑量處理組大鼠下丘腦DA含量顯著降低(p<0.05),說明桑葚粗提液能夠一定程度的改善這種損傷作用,起到了一定的干預(yù)作用。

圖3 各組大鼠下丘腦多巴胺水平的變化Fig.3 Changes in the hypothalamic of rats dopamine levels

2.3.4 桑葚粗提液對(duì)壬基酚染毒大鼠下丘腦MAO活力的影響 如圖4可知,與正常對(duì)照組相比,桑葚對(duì)照組大鼠下丘腦MAO活力無顯著性變化,而染毒組大鼠下丘腦MAO活力極顯著降低(p<0.01),說明壬基酚對(duì)下丘腦造成了一定的損傷。與染毒組相比,僅桑葚提取液高劑量處理組大鼠下丘腦MAO活力極顯著升高(p<0.01),說明桑葚粗提液能夠一定程度的改善這種損傷作用,起到了一定的干預(yù)作用。

圖4 各組大鼠下丘腦MAO水平的變化Fig.4 Changes in the hypothalamic of rats MAO levels

桑葚具有良好的保健作用,本實(shí)驗(yàn)中桑葚粗提液的主要活性物質(zhì)是多酚類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桑葚粗提液可以通過增加MAO活性來降低神經(jīng)遞質(zhì)的含量,起到一定的抗焦作用。Xu等研究[26]發(fā)現(xiàn)反白藜蘆醇能上調(diào)大鼠腦內(nèi)的5-HT、NE和DA的水平,降低MAO的活性,起到了白藜蘆醇相反的效果從側(cè)面說明白藜蘆醇的抗焦慮作用;劉露[27]研究發(fā)現(xiàn)蘆丁可以上調(diào)染毒三甲基氯化錫大鼠腦內(nèi)的5-HT、NE和DA的水平,這可能是因?yàn)槿谆然a毒性作用使5-HT、NE和DA的水平過低,蘆丁一定的解毒作用,使神經(jīng)遞質(zhì)水平維持平衡;劉倩佟等[28]發(fā)現(xiàn)槲皮素能下調(diào)大鼠腦內(nèi)5-HT和DA的水平;同時(shí)本研究質(zhì)譜分析顯示桑葚粗提液有花色苷(矢車菊-3-葡萄糖苷)、蘆丁、槲皮素、白藜蘆醇等[29],由此推測(cè)可能是這類物質(zhì)起到的干預(yù)作用。

3 結(jié)論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為5-HT、NE、DA等神經(jīng)遞質(zhì)水平的增加,是引起焦慮病的原因之一[30-32]。研究表明,雌激素能抑制大鼠腦中MAO酶活性[33],而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,壬基酚染毒后的大鼠下丘腦內(nèi)5-HT、NE、DA的含量極顯著升高(p<0.01),焦慮大鼠亦出現(xiàn)MAO活性極顯著降低(p<0.01)。由此推測(cè)壬基酚是通過降低MAO酶的活性從而阻斷單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的正常分解,使得腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的水平升高而導(dǎo)致焦慮。同時(shí)桑葚粗提液干預(yù)組大鼠下丘腦中5-HT、NE、DA水平明顯降低,MAO水平明顯升高,提示桑葚粗提液特別是高劑量桑葚粗提液可以有效干預(yù)壬基酚染毒所引起的焦慮。本研究為桑葚的深加工提供了一定的借鑒,同時(shí)也為壬基酚毒性干預(yù)研究提供了思路。

[1]Andrew M N,Dunstan R H,O’Connor W A,et al. Effects of 4-nonylphenol and 17alpha-ethynylestradiol exposure in the Sydney rock oyster,Saccostrea glomerata:Vitellogenin induction and gonadal development[J]. Aquatic toxicology(Amsterdam,Netherlands),2008,88(1):39.

[2]張諾,賈瑞寶,孫韶華,等. 壬基酚的檢測(cè)及毒理學(xué)研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境與健康雜志,2013,30(4):362-365.

[3]Mao Z,Zheng X F,Zhang Y Q,et al. Occurrence and Biodegradation of Nonylphenol in the Environment[J]. International Journal of Molecular Sciences,2012,13(1):491-505.

[4]Chen W L,Wang G S,Gwo J C,et al. Ultra-high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry determination of feminizing chemicals in river water,sediment and tissue pretreated using disk-type solid-phase extraction and matrix solid-phase dispersion.[J]. Talanta,2012,89(2):237-245.

[5]Liu J,Wang R,Huang B,et al. Distribution and bioaccumulation of steroidal and phenolic endocrine disrupting chemicals in wild fish species from Dianchi Lake,China[J]. Environmental Pollution,2011,159(10):2815-2822.

[6]Xu E G B,Brian M,Lee J H W,et al. Environmental fate and ecological risks of nonylphenols and bisphenol A in the Cape D’Aguilar Marine Reserve,Hong Kong.[J]. Marine Pollution Bulletin,2015,91(1):128-138.

[7]李祥軍. 壬基酚和β-萘黃酮對(duì)河川沙塘鱧(Odontobulispotamophila)幼魚雌激素/抗雌激素效應(yīng)的研究[D]. 上海:華東師范大學(xué),2008.

[8]Nagao T,Wada K,Marumo H,et al. Reproductive effects of nonylphenol in rats after gavage administration:a two-generation study[J]. Reproductive Toxicology,2001,15(3):293-315.

[9]張瓊宇,孫遠(yuǎn)東,王中軍,等. 壬基酚對(duì)金魚(Carassiusauratus)胚胎發(fā)育毒性的初步研究[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,16(16):3040-3043.

[10]賴玉婷,歐陽(yáng)俊彥,郭佑廷,等. 壬基酚對(duì)大鼠5-羥色胺分解代謝通路的影響[J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué),2014,34(9):2408-2412.

[11]劉輝,郭佑廷,黃少文,等.γ-氨基丁酸對(duì)DEHP染毒大鼠焦慮行為的干預(yù)研究[J]. 食品工業(yè)科技,2015(20):354-358.

[12]Yadav A V,Kawale L A,Nade V S. Effect of Morus alba L.(mulberry)leaves on anxiety in mice.[J]. Indian Journal of Pharmacology,2008,40(1):32-36.

[13]Abbas B,Ahmad J J,Hasan A,et al. Effects of the Alcoholic Extract of White Mulberry Leaves on Behavioral Performance of Rats[J]. Biomedical & Pharmacology Journal,2015,8:715-719.

[14]Shin W H,Park S J,Kim E J. Protective effect of anthocyanins in middle cerebral artery occlusion and reperfusion model of cerebral ischemia in rats[J]. Life Sciences,2006,79(2):130-137.

[15]Kim A J,Park S. Mulberry extract supplements ameliorate the inflammation-related hematological parameters in carrageenan-induced arthritic rats[J]. Journal of Medicinal Food,2006,9(3):431-435.

[16]Kim H G,Ju M S,Shim J S,et al. Mulberry fruit protects dopaminergic neurons in toxin-induced Parkinson’s disease models[J]. British Journal of Nutrition,2010,104(1):8-16.

[17]鄭芳昊,羅佳波. 桂枝對(duì)大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用的研究[J]. 中藥藥理與臨床,2014,30(4):76-79.

[18]范興文,貫士闊,吳開良. 腦部照射對(duì)大鼠情緒和記憶的影響[J]. 中國(guó)癌癥雜志,2014,24(11):814-819.

[19]王維剛,吳文婷,周嘉斌,等.應(yīng)用高架十字迷宮分析小鼠焦慮行為[J]. 中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),2011,33(5):466-472.

[20]胡金奎. 桑葚花色苷的分離制備,結(jié)構(gòu)分析及其體外活性[D]. 無錫:江南大學(xué),2013.

[21]婁在祥,王洪新,呂文平,等. 微波輔助提取牛蒡葉多酚及其抗氧化,抗菌活性研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2010,36(1):161-165.

[22]肖更生,徐玉娟,劉學(xué)銘,等. 桑椹的營(yíng)養(yǎng)、保健功能及其加工利用[J]. 中藥材,2001,24(1):70-72.

[23]楊海霞,朱祥瑞,房澤民. 桑椹的藥用價(jià)值與開發(fā)利用[J]. 蠶桑通報(bào),2003,34(3):5-8.

[24]張志強(qiáng),楊清香,孫來華. 桑葚的開發(fā)及利用現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)食品添加劑,2009(4):65-68.

[25]董芳妮. 長(zhǎng)期雙酚A暴露對(duì)成年小鼠焦慮和抑郁行為的影響及其神經(jīng)機(jī)制[D]. 金華:浙江師范大學(xué),2014.

[26]Xu Y,Wang Z,You W,et al. Antidepressant-like effect of trans-resveratrol:Involvement of serotonin and noradrenaline system[J]. European Neuropsychopharmacology,2010,20(6):405-413.

[27]劉露. 蘆丁預(yù)處理對(duì)TMT致學(xué)習(xí)記憶功能障礙的保護(hù)作用與單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的關(guān)系[D]. 重慶:重慶醫(yī)科大學(xué),2014.

[28]劉倩佟. 合歡花抗焦慮活性物質(zhì)基礎(chǔ)研究[D]. 北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2015.

[29]Liu H,Yang J,Huang S,et al. Mulberry crude extracts induce Nrf2 activation and expression of detoxifying enzymes in rat liver:Implication for its protection against NP-induced toxic effects[J]. Journal of Functional Foods,2017,32:367-374.

[30]鄭祖艷,朱崇霞.焦慮癥患者5-羥色胺及去甲腎上腺素水平的動(dòng)態(tài)研究[J].福建中醫(yī)藥,2004,35(2):5.

[31]周奇志,余曙光,吳俊梅,等. 針刺對(duì)嗎啡戒斷后焦慮模型小鼠行為和腦內(nèi)去甲腎上腺素含量的影響[J]. 成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2003,26(1):40-42.

[32]喻東山,梅安昌. 驚恐障礙的發(fā)生機(jī)制[J]. 四川精神衛(wèi)生,2009,22(2):122-124.

[33]黃艷紅,辛?xí)匝?陳亞瓊,等. 卵巢切除及雌激素替代對(duì)大鼠腦單胺氧化酶和行為學(xué)的影響[J]. 中國(guó)行為醫(yī)學(xué)科學(xué),2004,13(2):140-141.

Intervention effects and mechanism research of mulberry crude extract on nonylphenol anxiety behavior of SD rats induced by nonylphenol

LIU Huan,YANG Jie,HUANG Shao-wen,LIU Rui-jing,HE Yong-jian,LIU Chun-hong*

(College of Food Science,South China Agricultural University,Key Laboratory of Food Quality and Safety in Guangdong Province,Guangzhou 510642,China)

The aim of this study was toinvestigate the interventioneffects of mulberry crude extract(MCE)on anxiety behaviors of SD rats exposed to nonylphenol(NP). 48 SPF rats were randomly divided into 6 goups:normal control group(corn oil),MCE control group(120 mg/kg),NP model group(270 mg/kg),and three intervention groups(120 mg/kg NP+30 mg/kg MCE,120 mg/kg NP+60 mg/kg MCE,120 mg/kg NP+120 mg/kg MCE). The open field test(OFT)and elevated plus maze(EPM)were used to evaluate anxiety behaviors of the rats while the ELISA kitswere used to detect the levels of monoamine neurotransmitter,including serotonin,dopamine,norepinephrine and monoamine oxidase. The distance traveled in the center and entrance frequency to the center of the high-dose intervention groupwere significantly higher thanthe NP group in the OFT. The percentage of open arm entries and time of the high-dose intervention group rats were significantly higher thanthe NP group in the EPM test(p<0.05). Compared with the nonylphenol group,the hypothalamic serotoninand dopamin levels in the high-dose intervention group were significantly lower(p<0.05),the hypothalamus dopamin level was significantly lower in the middle-dose intervention group(p<0.05)and MAO activity of high dose intervention group was significantly increased(p<0.05). Meanwhile as intervention dose increased,norepinephrine levels gradually reduce with no significant difference. Mulberry crude extract can reduce the levels of serotonin,dopamine,norepinephrine in hypothalamus of rats with anxiety caused by nonylphenol and the underlying mechanism may involve up-regulation of MAO activity.

nonylphenol;mulberry crude extract;monoamine neurotransmitter;open field text;elevated plus maze

2016-12-20

劉煥(1991-)，男，碩士，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品安全，E-mail：liuhuanjzcd@126.com。

*通訊作者:柳春紅(1968-)，女，博士，教授，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與食品安全，E-mail：liuch@scau.edu.cn。

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016A030313395)；農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管項(xiàng)目(GJFP201601106)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020204001)；廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目(2016LM2152)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)14-0294-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.058