尹 雪,郭雪峰,2,*,帕提古麗·毛拉紅,劉俊峰,2,張秀萍,2,席琳喬,2,程 龍(.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾 8400; 2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆阿拉爾 8400; .墨爾本大學(xué)獸醫(yī)與農(nóng)業(yè)科學(xué)院,澳大利亞維多利亞區(qū) 647)

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傳統(tǒng)發(fā)面面肥中乳酸菌的分離與鑒定

尹 雪1,郭雪峰1,2,*,帕提古麗·毛拉紅1,劉俊峰1,2,張秀萍1,2,席琳喬1,2,程 龍3
(1.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,新疆阿拉爾 843300; 2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆阿拉爾 843300; 3.墨爾本大學(xué)獸醫(yī)與農(nóng)業(yè)科學(xué)院,澳大利亞維多利亞區(qū) 3647)

為改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)篩選提供乳酸菌資源,實(shí)驗(yàn)采用實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)方法結(jié)合生理生化分析,對(duì)新疆傳統(tǒng)發(fā)面面肥樣品中乳酸菌的種類、形態(tài)學(xué)及生理生化特性進(jìn)行研究,對(duì)分離的菌株運(yùn)用16S rDNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育研究進(jìn)行種屬鑒定。結(jié)果表明,分離得到三株乳酸菌,其中F5和F28兩株被鑒定為Bacillussp.,F3被鑒定為Paenibacillussp.。3株菌在pH4～7能生長,在3%和6.5% NaCl條件下生長狀況良好,在10～45 ℃溫度范圍能生長。兩株芽孢桿菌中F5菌株產(chǎn)酸能力較強(qiáng),F28菌株生長速率較快,并且這兩株菌均能利用多種碳源。所以,實(shí)驗(yàn)中篩選出的三株乳酸菌均可選作青貯飼料制作過程中的添加劑。

發(fā)面面肥,乳酸菌,分離,鑒定

發(fā)面面肥是指面粉和水混合后經(jīng)微生物(如乳酸菌等)發(fā)酵而成的產(chǎn)物[1]。面團(tuán)發(fā)酵時(shí)各種微生物同時(shí)作用,其中,乳酸菌可以酸化面團(tuán),改善面團(tuán)質(zhì)構(gòu),產(chǎn)生包括揮發(fā)酸在內(nèi)的各種風(fēng)味成分。此外,乳酸菌產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)可以有效抑制有害細(xì)菌和真菌的生長,具有延長饅頭、面包等的保藏時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)[2]。近年來有越來越多的新的乳酸菌被發(fā)現(xiàn)在傳統(tǒng)發(fā)面面肥中發(fā)揮了重要作用并被鑒定出來。Valcheva[3-4]等從法國面肥中首次發(fā)現(xiàn)并鑒定出Lactobacillushammesiisp.nov.和Lactobacillusnantensissp.nov.;Scheirlinck[5-6]等從比利時(shí)兩個(gè)小麥發(fā)面面肥中首次發(fā)現(xiàn)并鑒定出Lactobacilluscrustorumsp.nov.和Lactobacillusnamurensissp.nov.;Gu Chuntao[7]等從中國黑龍江當(dāng)?shù)氐碾绮撕兔娣手惺状伟l(fā)現(xiàn)并鑒定出Lactobacillusmudanjiangensissp.nov.,Lactobacillussonghuajiangensissp.nov. 和Lactobacillusnenjiangensissp.nov.。我國各地區(qū)發(fā)面面肥的制作工藝具有一定差異,導(dǎo)致面肥的菌群組成也不相同,除了Zhang Jiachao[8]、吳斯日古冷[9]等采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合對(duì)內(nèi)蒙地區(qū)的傳統(tǒng)面肥做了比較系統(tǒng)的乳酸菌菌群的鑒定之外,張國華[10]也對(duì)我國不同地區(qū)發(fā)酵酸面團(tuán)的菌群組成進(jìn)行了研究,其中華東地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌為Leueonostoe,華中地區(qū)、華北地區(qū)、西北地區(qū)及東北地區(qū)均以Lactobacillus為優(yōu)勢(shì)菌。隨著研究人員對(duì)傳統(tǒng)發(fā)面面肥的研究興趣日益增加,關(guān)于面肥的研究逐漸從表征的理化指標(biāo)轉(zhuǎn)向更加深入的分子生物學(xué)技術(shù)。如今隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,乳酸菌的鑒定過程將變得簡(jiǎn)單、快速,結(jié)果也將更加準(zhǔn)確。但對(duì)于新疆地區(qū)發(fā)面面肥微生物組成研究的報(bào)道較少。本研究的主要目的是通過實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和16S rDNA基因序列分析方法,對(duì)新疆傳統(tǒng)發(fā)面面肥中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定,以期為抑制霉菌改善青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)篩選提供乳酸菌資源。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

發(fā)面面肥樣品 2016年7月從本地區(qū)隨機(jī)采集發(fā)面面肥樣品,將面肥樣品封于密封袋中,樣品貼上標(biāo)簽標(biāo)明采樣時(shí)間和地點(diǎn)后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,于4 ℃條件下,由塔里木大學(xué)畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室草食家畜營養(yǎng)研究室保存?zhèn)溆?乳酸菌培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基;10×Buffer、2.5 mmol/L dNTP Mixture、X-gal、IPTG、蛋白酶K(30 U/mg)、過硫酸銨、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺 Sigma公司;T4連接盒、5 U/μL Tap酶、DNA細(xì)菌基因組提取試劑盒、通用型DNA純化回收試劑盒、DNA Markers、質(zhì)粒小提試劑 Tian Gen;瓊脂糖;氨芐青霉素、溶菌酶(70000 U/mg) Takara公司;大腸桿菌(DH5α) 來自新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;引物FA-27F:(5′-GCA GAG TTC TCG GAG TCA CGA AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′);RA-1495R:(5′-AGC GGA TCA CTT CAC ACA GGA CTA CGG GTA CCT TGT TAC GA-3′) 北京英俊生物技術(shù)公司;蛋白胨水 實(shí)驗(yàn)室配制。

SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司;XP603S電子天平 瑞士梅特勒-托利多中國公司;SX-500型高壓滅菌鍋 上海法潤科學(xué)儀器有限公司;DNP9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;T6型紫外可見光分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Mastercycler nexus PCR儀、MiniSpin離心機(jī) 德國艾本德股份公司;HMS-350型旋渦振蕩儀 金壇市科析儀器有限公司;JY-300C電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;GEL DOC XR+型凝膠成像系統(tǒng) 北京賽百奧科技有限公司;PHSJ-5實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器有限公司;-70 ℃超低溫冰箱 海爾集團(tuán)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離 在超凈工作臺(tái)中稱取10 g發(fā)面面肥樣品放入90 mL無菌蛋白胨水中,密封,置于搖床上以120 r/min搖動(dòng)2 h,吸取1 mL上清液加入到9 mL無菌蛋白胨水中,漩渦振蕩,以此稀釋成10-5、10-6、10-7、10-8四個(gè)梯度,分別取4個(gè)梯度的菌液100 μL涂布于固體 MRS平板培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)48～72 h,根據(jù)菌落顏色、大小、光澤、是否有透明圈等挑取單菌落,在MRS固體培養(yǎng)基上劃線,恒溫培養(yǎng)30 ℃,48～72 h,重復(fù)劃線分離培養(yǎng)3次,得到純化的單菌株。用MRS液體培養(yǎng)基富集(30 ℃,24 h),與等體積的甘油混合,封裝,-70 ℃保存?zhèn)溆肹11]。

1.2.2 產(chǎn)酸速率測(cè)定 將乳酸菌菌懸液以3%的接種量接種到pH6.5的MRS液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)溫度37 ℃,恒溫培養(yǎng)時(shí)間12 h。每隔2 h測(cè)定發(fā)酵液pH,每次測(cè)三組平行樣并計(jì)算平均值,根據(jù)不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)應(yīng)的發(fā)酵pH平均值的變化繪制產(chǎn)酸速率曲線[12]。

1.2.3 測(cè)定生長曲線 將乳酸菌菌液以6.0%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)。每隔2 h測(cè)其OD值,波長620 nm,每次測(cè)三組平行樣,測(cè)定時(shí)間為0～12 h。測(cè)定完成后取三組平行實(shí)驗(yàn)所測(cè)結(jié)果,計(jì)算平均值繪制統(tǒng)計(jì)圖[12]。

1.2.4 乳酸菌的鑒定

1.2.4.1 生理生化鑒定 將保存?zhèn)溆玫木昊罨?4 h,進(jìn)行革蘭氏染色,觀察菌落的顏色、形態(tài)及大小等。參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》進(jìn)行乳酸菌生理生化特性鑒定[13-14];葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)、碳源發(fā)酵實(shí)驗(yàn)采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)進(jìn)行鑒定;耐鹽實(shí)驗(yàn)、耐酸實(shí)驗(yàn)、溫度生長實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[10-11]進(jìn)行。

1.2.4.2 提取細(xì)菌DNA 凡是革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株初步認(rèn)定為乳酸菌,對(duì)所得菌液提取DNA。取細(xì)菌培養(yǎng)液2 mL,10000 r/min離心,棄上清液,向沉淀中加入200 μL緩沖液GA重新懸浮細(xì)菌,再加入180 μL含有溶菌酶的緩沖液,37 ℃處理30 min以上。取出離心管,加入20 μL蛋白酶K溶液,混勻后加入220 μL GB緩沖液,振蕩15 s,70 ℃水浴10 min,此時(shí)溶液變得清亮,簡(jiǎn)短離心15 s后加入220 μL無水乙醇,充分振蕩15 s,簡(jiǎn)短離心15 s,將所得溶液溶液中加入吸附柱,12000 r/min離心30 s倒掉液體,向吸附柱中加入500 μL GD緩沖液,12000 r/min離心30 s,棄廢液,向吸附柱中加入600 μL漂洗液PW,12000 r/min離心30 s,棄廢液,重復(fù)前面步驟一次。將吸附柱放回收集管中12000 r/min離心2 min,棄廢液。

表1 發(fā)面面肥中乳酸菌的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of lactic acid bacteria fertilizer in sourdough

將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘,以徹底晾干殘余緩沖液。將吸附柱放入一個(gè)干凈的離心管中,懸空向吸附膜中間部位滴加50～200 μL洗脫液TE,室溫放置2～5 min,12000 r/min離心2 min,將液體收集到離心管中,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 PCR擴(kuò)增和16S rDNA基因序列分析 用PCR儀對(duì)各個(gè)菌株的DNA進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增引物為27f和1495r,所使用擴(kuò)增反應(yīng)的體系為50 μL,體系如下:5 μL 10×Buffer,4 μL dNTP Mixture,0.5 μL Taq酶,2 μL DNA模板,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,無菌超純水補(bǔ)足至50 μL后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件:95 ℃,3 min;94 ℃,1 min;53 ℃,1 min;72 ℃延伸90 s,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸8 min,用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物回收后,連接p MD-18T載體并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,經(jīng)藍(lán)白斑篩選為陽性克隆后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在Gen Bank中進(jìn)行BLAST分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌菌株形態(tài)特征分析

菌落形態(tài)特征是鑒定菌株的首要指標(biāo),菌落特征是菌種在培養(yǎng)基中的生長情況,乳酸菌大多數(shù)為圓形菌落,菌落顏色基本為黃色、微黃色、灰白色和乳白色。根據(jù)《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》所描述的乳酸菌菌株形態(tài)進(jìn)行乳酸菌菌株分離鑒定。乳酸菌是指能夠利用碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱[13]。這類細(xì)菌具有一些基本特征:革蘭氏陽性,不運(yùn)動(dòng)或極少運(yùn)動(dòng),過氧化氫酶陰性;可發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸,產(chǎn)酸和耐酸能力強(qiáng);為厭氧或兼性厭氧菌[15-16]。目前我國乳酸菌的分類主要依照凌代文的報(bào)道,主要包括乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、腸球菌屬(Enterococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等23個(gè)屬[13]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)菌落特征篩選出30株符合特征的乳酸菌,編號(hào)為F1～F30,挑取單菌落經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢,再根據(jù)菌體特征和接觸酶反應(yīng),初步確定以下三株菌為乳酸菌,如表1所示。

2.2 乳酸菌菌株的生理生化特性

青貯飼料目前在畜牧業(yè)生產(chǎn)中使用較為廣泛,現(xiàn)已成為反芻動(dòng)物不可缺少的基礎(chǔ)飼料[17]。在青貯飼料發(fā)酵過程中,隨著厭氧條件的加深,一些有害菌的生長活動(dòng)受到限制。乳酸菌在整個(gè)發(fā)酵過程中起驅(qū)動(dòng)作用,不僅可以抑制霉菌等有害菌的生長,還能利用飼料中的可溶性糖,提高青貯的發(fā)酵品質(zhì)。產(chǎn)酸速率和生長速率是篩選優(yōu)良乳酸菌的重要指標(biāo),從圖1中可見,本實(shí)驗(yàn)分離得到的三株乳酸菌的產(chǎn)酸能力較強(qiáng),在12 h之內(nèi)菌株的pH均能降到4.5左右,其中菌株F5產(chǎn)酸能力較強(qiáng)。在0～4 h時(shí)產(chǎn)酸速率較快,4～12 h時(shí)產(chǎn)酸速率變化平緩,菌株F5的pH在12 h的時(shí)候低于4.5,其他兩株菌的pH在12 h的時(shí)候均接近4.5,因此,可以看出各菌株產(chǎn)酸能力強(qiáng)弱依次為F5、F3、F28。從圖2中可見,在0～2 h時(shí)菌株F3與菌株F28的繁殖速率一致,2～12 h時(shí)菌株F28的生長速度較快。F5菌株的繁殖速率稍低于其他兩株菌。因此,可以看出各菌株繁殖速率強(qiáng)弱依次為F28、F3、F5。

圖1 乳酸菌菌株產(chǎn)酸速率曲線Fig.1 Acid-producing rate curve of lactic acid bacterium strains

圖2 乳酸菌菌株生長曲線Fig.2 Growth curve of lactic bacterium strains

對(duì)3株乳酸菌生理生化指標(biāo)及碳源利用方式進(jìn)行鑒定,結(jié)果見表2和表3。由表2可看出,在產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)中3株乳酸菌發(fā)酵葡萄糖均不能產(chǎn)氣,為同型發(fā)酵乳酸菌。在5 ℃條件下均生長較弱;在10 ℃條件下除菌株F3生長較弱,其余2株菌均生長良好;在40 ℃和45 ℃條件下,3株乳酸菌的生長良好;NaCl濃度為3%和6.5%時(shí)3株菌均能生長;在pH3條件下3株乳酸菌均不能生長;在pH4條件下菌株F5和F28生長良好,菌株F3生長較弱;pH為5～7時(shí)3株菌生長狀況良好。由表3可知，3株菌均可利用D-葡萄糖、D-麥芽糖、D-甘露糖、D-松二糖、纖維二糖、D-甘露醇、D-海藻糖、D-果糖、蔗糖、D-山梨醇;F3菌株不能發(fā)酵乳糖、D-半乳糖、L-山梨糖、D-松三糖、木糖醇、D-棉籽糖、L-鼠李糖、D-木糖、D-蜜二糖;F5和F28菌株均不能利用L-山梨糖、D-松三糖、龍膽二糖、L-鼠李糖。

圖3 乳酸菌基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the lactic bacterium strains according to 16S rDNA sequences

鑒定項(xiàng)目菌株編號(hào)F3F5F28產(chǎn)氣---發(fā)酵類型同型同型同型5℃WWW10℃W++40℃+++45℃+++3%NaCl+++6 5%NaCl+++pH3---pH4W++pH5+++pH6+++pH7+++

注:“+”表示生長,“-”表示不生長,“W”表示弱生長。表3同。

表3 乳酸菌碳源同化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Carbon source of fermentation experiments to lactic acid bacterium

2.3 分子生物學(xué)鑒定

芽孢桿菌屬是一類需氧或兼性厭氧、能形成內(nèi)生孢子的細(xì)菌,革蘭氏染色呈陽性,且對(duì)逆性環(huán)境的耐受性強(qiáng)[18]?，F(xiàn)有研究表明,當(dāng)動(dòng)物食用添加了芽孢桿菌的飼料后,芽孢進(jìn)入動(dòng)物腸道,其萌發(fā)和生長會(huì)消耗大量的氧氣,從而抑制有害微生物的生長,且動(dòng)物的生產(chǎn)性能和抗病力都有所提高[19]。據(jù)報(bào)道,凝結(jié)芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等都可作為飼料添加劑[20]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選出的乳酸菌提取基因組DNA,采用細(xì)菌通用引物對(duì)其16S rDNA序列擴(kuò)增,片段大小為1500 bp左右。測(cè)序獲得的16S rDNA序列通過BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行比對(duì)分析見圖3,菌株F3與數(shù)據(jù)庫中的Paenibacillussp.同源性為100%,故將其鑒定為類芽孢桿菌。菌株F5、F28與數(shù)據(jù)庫中Bacillussp.同源性為100%,故將其鑒定為芽孢桿菌。

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)的方法對(duì)新疆傳統(tǒng)的發(fā)面面肥樣品進(jìn)行乳酸菌的分離,對(duì)分離的菌株運(yùn)用16S rDNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育研究進(jìn)行種屬鑒定。首次從新疆傳統(tǒng)發(fā)面面肥中分離得到三株乳酸菌,其中2株菌株F5和F28被鑒定為Bacillussp.,1株菌株F3被鑒定為Paenibacillussp.。本實(shí)驗(yàn)分離的三株芽孢桿菌的生長性能和產(chǎn)酸速率都處于良好水平,其中菌株F5產(chǎn)酸能力較好,菌株F28的繁殖速度較快,并且兩株乳酸菌均能利用多種碳水化合物。計(jì)劃后期在制作青貯過程中將F5和F28兩株菌同時(shí)添加,并對(duì)此次分離出的乳酸菌菌株的發(fā)酵條件、抑菌能力及其應(yīng)用于青貯中的效果進(jìn)行進(jìn)一步研究,望其能成為對(duì)動(dòng)物有益的新的飼料添加劑。

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[20]孔高飛,金敏,朱蓮蓮,等.一種短小芽孢桿菌分離鑒定及培養(yǎng)條件研究[J]. 浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào),2014(7):467-473,480.

Isolation and identification of lactic acid bacteria from Chinese traditional sourdough

YIN Xue1,GUO Xue-feng1,2,*,Patiguli·Maolahong1,LIU Jun-feng1,2, ZHANG Xiu-ping1,2,XI Lin-qiao1,2,CHENG Long3

(1.College of Animal Science,Tarim University,Alar 843300,China; 2.Key Laboratory of Animal Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production & Construction Corps,Alar 843300,China; 3.Faculty of Veterinary & Agricultural Sciences,Dookie Campus,the University of Melbourne,Victoria 3647,Australia)

To support the growing silage industry,the study adopted the pure culture method from silage microbial analysis,combining with the physiological and biochemical analysis to investigate the species,morphological,physiological-biochemical characteristics of lactic acid bacteria from Chinese traditional sourdough sampled in Xinjiang. The isolated lactic acid bacteria was identified using 16S rDNA gene sequences and phylogenetic studies. Results showed that three strains of lactic acid bacteria were isolated and identified. F5 and F28 wereBacillussp., F3 wasPaenibacillussp.. Three strains of lactic acid bacteria were found in the range of pH4～7,and grew well under the condition of 3% and 6.5% concentration of NaCl and the bacteria also grew well between 10 ℃ and 45 ℃. The strain F5 produced the most acid,strain F28 had faster growth rate than strain F5. In conclusion,three strains of lactic acid bacteria from this study might be used as additives in the production of silage.

sourdough;lactic acid bacteria;isolation;identification

2016-12-12

尹雪(1990-)女，在讀碩士研究生，研究方向：抑制青貯飼料中黃曲霉菌生長的乳酸菌篩選和鑒定，E-mail:1186027456@qq.com。

*通訊作者:郭雪峰(1980-)，女，博士，副教授，研究方向：反芻動(dòng)物瘤胃營養(yǎng)調(diào)控技術(shù)，E-mail：gxfdky@126.com。

科技創(chuàng)新中青年領(lǐng)軍人才項(xiàng)目(2016BC001)；兵團(tuán)畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(HS201613)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)14-0141-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.028