王世成,王 瑩,張 紅,李國琛,王顏紅(中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所,沈陽市食品安全檢測與控制技術重點實驗室,遼寧沈陽 110016)

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北蟲草中蟲草素的NIR快速定量測定

王世成,王 瑩,張 紅,李國琛,王顏紅*
(中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所,沈陽市食品安全檢測與控制技術重點實驗室,遼寧沈陽 110016)

應用近紅外光譜(NIR)和偏最小二乘法(PLS),建立了北蟲草中蟲草素的定量分析校正模型。分別采集北蟲草子實體的近紅外光譜圖,應用TQ化學計量學分析軟件,對不同化學計量學處理方法進行了比較,并對光譜區(qū)域,光譜預處理方法,主成分因子數進行篩選。依據預測效果確定了最佳的校正模型,蟲草素含量的預測結果與HPLC檢測結果的相關系數為0.9919,校正模型的定標均方差(RMSEC)為102 mg/kg、預測均方差(RMSEP)為281 mg/kg。本方法操作簡便,快速無損,可用于北蟲草中蟲草素含量的快速檢測。

近紅外光譜,北蟲草,蟲草素,偏最小二乘法(PLS),主成分回歸(PCR)

北蟲草[Cordycepsmilitaris(L.)Link]又名北冬蟲夏草、蛹蟲草,與冬蟲夏草同屬異種。人工培植的北蟲草含有蟲草素(即3-脫氧腺苷)、蟲草酸、蟲草多糖、腺苷、超氧化物歧化酶(SOD)等多種特有的活性成分[1]。2009年國家衛(wèi)生部發(fā)布公告,批準北蟲草為新資源產品。其中的蟲草素作為北蟲草的最主要特征成分,具有廣譜的抗菌活性,有抑制腫瘤、抗病毒、免疫調節(jié)作用[2-4];蟲草素在北蟲草中的含量比冬蟲夏草高很多,約為后者的數倍甚至10倍[5]。作為評價北蟲草的關鍵指標,蟲草素測定通常采用高效液相色譜法[6-8]、毛細管電泳-質譜法[9]、高效液相色譜-質譜法[10]和分光光度法[11]等,但是上述方法測定的時間較長,有時不能滿足產品快速檢測的需要。

近紅外光譜作為一種重要的快速檢測手段,已經在北蟲草中腺苷、蟲草酸、多糖和蛋白質等活性成分及食用農產品的有效成分快速檢測中得到廣泛應用[12-15]。但是,采用近紅外光譜測定蟲草素含量的方法還未見報道。為此,本文應用近紅外光譜技術,建立了北蟲草子實體中蟲草素的快速檢測方法,為北蟲草素的質量評價提供了一個快速、簡便的分析手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

表1 北蟲草樣品中蟲草素含量統計分析Table 1 Statistical analysis of cordycepin contents in Cordyceps militaris

北蟲草樣品 為市場采購和企業(yè)提供的北蟲草子實體干燥樣品,共計31份,在60 ℃干燥箱中烘干12 h,粉碎后過80目篩備用;蟲草素標準品 上海安譜科學儀器有限公司,含量99.9%;乙腈 為色譜純,Merck公司;實驗用水 均為超純水;其他試劑 均為分析純。

Nicolet 6700紅外光譜儀 裝配智能積分球附件、樣品旋轉器、InGaAs檢測器、配有OMNIC8.0光譜采集軟件和TQ8.0分析軟件，美國Thermo Fisher公司;2695液相色譜儀 配有996二極管陣列檢測器,MassLynx V4.1工作站，美國Waters公司;KQ-250B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Milli-Q超純水儀 Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 北蟲草中蟲草素含量的化學值測定 參照NY/T2116-2012《蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定 高效液相色譜法》,采用HPLC測定。

1.2.2 圖譜的采集 采集方式:積分球漫反射,掃描次數32次,掃描范圍:4000～10000 cm-1,分辨率4 cm-1。測試前,將自動旋轉式樣品杯擦拭干凈,確保樣品杯中裝入2/3體積以上北蟲草干粉樣品,壓實,通過OMNIC8.0 軟件控制光譜儀掃描,每個樣品掃描3次,取平均譜作為該樣品的近紅外光譜。

1.2.3 波數選擇和近紅外光譜圖的預處理方法 將31個北蟲草樣品分成2組,一組21個樣品作為校正集用于建立校正模型,另外10個樣品作為驗證集用于模型驗證。利用TQ8.0分析軟件進行回歸分析處理,剔除高頻區(qū)和低頻區(qū)的無效光譜,并對光譜的處理采用了無光譜預處理、一階導數(1st)、二階導數(2st)、標準正態(tài)變量校正(SNV)、多元散射校正(MSC)、Savitzky-golay平滑(Sav)、Norris平滑(Nor)以及上述預處理方式的校正+導數+平滑組合處理等方法。以校正模型的相關系數(r)、均方根誤差(RMSEC)和預測均方差(RMSEP)作為衡量標準,選擇建模最佳波數段和最佳預處理方式。

1.2.4 校正模型的建立及評價 采用TQ8.0分析軟件,分別對采集的近紅外圖譜進行數據預處理,比較了偏最小二乘法(PLS)和主成分回歸分析(PCR)的化學計量學處理方式,同時采用內部交叉驗證和驗證集樣品的外部驗證方式,由定標均方差(RMSEC)、預測均方差(RMSEP)、內部交叉驗證均方差(RMSECV)及回歸值與實測值的相關系數r來評價模型質量。

2 結果與討論

2.1 樣品蟲草素含量的數據分析

對獲得的31個北蟲草中蟲草素的HPLC分析結果進行統計分析,結果見表1。由分析結果可以看出,樣品的蟲草素最小含量為351 mg/kg,最高含量為3303 mg/kg,平均值1529.5 mg/kg,標準偏差為777.8 mg/kg,含量分布范圍近10倍區(qū)間。校正集和驗證集樣品的平均值和偏差分別為1549.3、822.8，1487.7、713.8 mg/kg,平均值相近,偏差均較大,說明用于近紅外建模的校正集和驗證集樣品蟲草素含量值分布能夠涵蓋正常北蟲草中的蟲草素含量范圍,且數據較分散,多態(tài)性比較豐富,并滿足建模的要求。

2.2 光譜預處理

圖1是未經預處理的光譜圖(4000～10000 cm-1),由圖可見,樣品的吸收峰主要集中在4000～7000 cm-1范圍內。在紅外光譜測定過程中,由于受儀器噪聲、空氣溫濕度、樣品顆粒均勻程度、試樣量不均勻等諸多因素影響,可能會使紅外譜圖的某些信息被噪聲掩蓋或干擾,基線發(fā)生傾斜或漂移,因而在建模時需要對采集的紅外譜圖進行預處理。對于樣品不同組分之間的相互干擾導致紅外光譜譜線重疊以及基線漂移和傾斜的現象,可采用求導數的方法進行消除,其中常用的是一階導數和二階導數。譜圖中的高頻噪聲干擾可采用平滑的方式去除或減少;由于儀器背景、樣品粒度和其它因素的影響,出現基線漂移和傾斜的現象,可采用基線校正有效地消除。通常情況下,如果采用導數處理的光譜圖,就不需做基線校正了。樣品顆粒分布不均所產生的散射對光譜的影響可采用多元散射校正(MSC)或標準正態(tài)變量校正(SNV)消除。

圖1 樣品的近紅外光譜Fig.1 Near infrared spectroscopy of samples

為此,在TQ8.0軟件推薦的光譜范圍內,對采集的近紅外光譜進行了不同處理方法的比較。相關系數(r)越接近1,RMSEC和RMSEP越小,模型的預測結果越精確,光譜預處理方法也就越優(yōu)。首先比較兩種校正方法,結果表明,標準正態(tài)變量校正(SNV)優(yōu)于多元散射校正(MSC)的處理效果。表2列出了采用標準正態(tài)變量校正(SNV)后,不同光譜處理方法：一階導數(1st)、二階導數(2st)、Savitzky-golay平滑(Sav)、Norris平滑(Nor)、以及導數+平滑的組合處理對模型的影響。由表2看出,光譜的多種預處理方式中,導數的處理對PLS方法建模具有明顯的正向影響,對PCR呈現負向影響;二階導數的Nor平滑處理效果好于Sav平滑處理。

表2 光譜預處理的影響Table 2 Effect of spectral pretreatment

2.3 波數段的選擇

北蟲草中含有蟲草酸、蟲草素、多糖、腺苷、蛋白等成分,其中蟲草素(3-脫氧腺苷)分子中主要含氫原子的基團有亞甲基、次甲基、羥基、氨基等。近紅外光譜的吸收規(guī)律表明[16],亞甲基的C-H(不)對稱伸縮振動特征吸收峰出現在2843～2963 cm-1處,一級倍頻峰出現在5170～5757 cm-1的近紅外區(qū)附近;烯烴的C-H一級倍頻峰出現在5455～6079 cm-1;O-H的伸縮振動基頻峰位于2940～4000 cm-1,其一級倍頻峰出現在4545～6671 cm-1;N-H的一級倍頻峰出現在6173～6658 cm-1處。采用TQ8.0分析軟件篩選的譜圖波數區(qū)域基礎上,依據預測模型的評價指標,并結合蟲草素的吸收峰位置,對校正模型的波數范圍進行了優(yōu)化。最后選取在4500～5300、6300～6700、6910～6920 cm-1范圍內的共計3個區(qū)段作為校正模型的波數范圍。圖2為模型選定的近紅外吸收圖譜在4000～6000 cm-1區(qū)間的二級導數圖,由圖2可見,該區(qū)域內的5190、5060、4865、4605 cm-1附近均有明顯的吸收峰。這4個峰均處在亞甲基C-H 振動一級倍頻吸收和O-H的一級倍頻吸收區(qū)域。

圖2 典型區(qū)域光譜的二階導數圖譜Fig.2 2st derivative of typical spectrum

2.4 最佳主成分數的確定

在采用化學計量學建立校正模型時,建模選取的最佳主成分數是影響模型質量的關鍵。目前使用較多的是通過計算內部交叉驗證均方差(RMSECV)的方法來確定最佳主成分數[17]。RMSECV值越小,說明模型的預測能力越好。本模型在采用PLS統計方法時,主成分少于2時,RMSECV隨主成分的增加而增加,而當主成分在2～5之間,隨著主成分數的增加而減小,在5以后隨著主成分的增加又呈增加,RMSECV最小值對應的主成分數為5,此時主成分數最佳。

2.5 模型的建立

一個好的校正模型應具有較高的相關系數,較低的RMSEC、RMSEP值;同時,RMSEC和RMSEP之差也要相對較小,才能保證模型預測結果具有較高精度。應用TQ8.0分析軟件,在圖譜預處理條件優(yōu)化的基礎上,綜合評價了PLS和PCR化學計量學方法構建校正模型結果,雖然PCR建模方法中模型的定標均方差(RMSEC)較小(4.8～254),但模型推薦的最佳主成分因子數較高,均為19,易出現過擬合和產生共線性,影響模型的預測精度和穩(wěn)定性。PCR方法的預測均方差(RMSEP)明顯大于PLS方法,且比較兩種處理方法的RMSEP與RMSEC的差值,PCR方法明顯大于PLS方法。PLS模型具有最高的相關系數,較低的RMESC值和RMSEP值。綜合分析,PLS方法優(yōu)于PCR化學計量學處理方法。

所以最終確定,圖譜采用標準正態(tài)變量校正(SNV)+二階導數+Nor平滑的處理方式,建模采用PLS化學計量學方法,獲得較理想的校正模型。模型的相關系數r為0.9919,RMSEC和RMSEP分別為102和281。獲得的校正模型結果見圖3所示。

圖3 定量模型預測值與實測值的相關性(上圖)及偏差分布(下圖)Fig.3 Correlation(up)and difference(down) between predicted values and actual ones of the models

3 結論

采用漫反射方法采集北蟲草子實體的近紅外光譜,在4500～5300、6300～6700、6910～6920 cm-1范圍內,應用TQ8.0分析軟件的PLS方法建立了北蟲草中蟲草素的定量預測校正模型。蟲草素含量的模型預測值與HPLC實測值具有很好的相關性,相關系數為0.9919,預測模型的RMSEC和RMSEP分別為102 mg/kg和281 mg/kg,模型具有良好的定量預測效果。利用該模型能夠定量測定北蟲草中蟲草素的含量,建立的方法是一個快速、簡便、有效的蟲草素檢測方法,可用于北蟲草中蟲草素含量的快速檢測。

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Rapid determination of cordycepin inCordycepsmilitaris
by near-infrared spectroscopy

WANG Shi-cheng,WANG Ying,ZHANG Hong,LI Guo-chen,WANG Yan-hong*

(Institute of Applied Ecology,the Chinese Academy of Sciences,Shenyang Key Laboratory of Detection and Control Technology of Food Safety,Shenyang 110016,China)

The quantification model of determining the content of cordycepin inCordycepsmilitariswas established by using near-infrared spectroscopy(NIR)combined with a partial least square(PLS)method. The comparison of principle component regression(PCR)and PLS,selection of spectroscopy wavenumber region and principal component factor number were studied.The best model was selected according to the prediction effect. The correlation coefficients of prediction,the root mean square error of calibration(RMSEC)and the root-mean-square error of prediction(RMSEP)of the model were 0.9919,102 mg/kg,281 mg/kg respectively. The proposed methods are simple,convenient,fast,and can be applied for detection of cordycepin inCordycepsmilitaris.

near-infrared spectroscopy(NIR);cordycepin;Cordycepsmilitaris;partial least square(PLS);principal component regression(PCR)

2016-11-23

王世成(1966-)，男，碩士，研究員級高工，主要從事光譜與色譜檢測技術及天然產物研發(fā)方面的研究，E-mail：wangsc@iae.ac.cn。

*通訊作者:王顏紅(1963-)，女，碩士，研究員，主要從事檢測技術與食品安全風險評估方面的研究，E-mail:wangyh@iae.ac.cn。

國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0401201)；沈陽市科技計劃項目(F14-198-4-00)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)14-0016-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.14.004